酶工程电子教案 第五章 酶、细胞、原生质体固定化 ◆酶的一些不足之处： （1）酶的稳定性较差 （2）酶的一次性使用 （3）产物的分离纯化较困难 ◆改善方法之一就是固定化技术的应用: (1)固定化酶是指固定在一定载体上并在一定的空间范围内进行催化反应的酶。固定化酶既保持了酶的催化特性，又克服了游离酶的不足之处，具有增加稳定性，可反复或连续使用以及易于和反应产物分开等显著优点。 (2)固定化细胞是指固定在载体上并在一定的空间范围内进行生命活动的细胞。也称为固定化活细胞或固定化增值细胞。通常只能用于胞外酶等胞外产物的生产。 (3) 固定化原生质体技术，有利于胞内物质的分泌。 1. 酶固定化 ◆采用各种方法，将酶与水不溶性的载体结合，制备固定化酶的过程称为酶的固定化。固定在载体上并在一定的空间范围内进行催化反应的酶称为固定化酶。 ◆固定在载体上的菌体或菌体碎片称为固定化菌体，它是固定化酶的一种形式。 1.1酶的固定化方法 固定化的方法：吸附法、包埋法、结合法、交联法和热处理法等。 (1)吸附法： ◆利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上，而使酶固定化的方法称为物理吸附法，简称吸附法。 ◆物理吸附法常用的固体吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石等。 ◆靠物理吸附作用，结合力较弱，酶与载体结合不牢固而容易脱落，所以使用受到一定的限制。 (2)包埋法 ◆将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法称为包埋法。 ◆包埋法使用的多孔载体主要有：琼脂、琼脂糖、海藻酸钠、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺、光交联树脂、聚酰胺、火棉胶等。 ◆包埋法制备固定化酶或固定化菌体时，根据载体材料和方法的不同，可分为凝胶包埋法和半透膜包埋法两大类。 ◇凝胶包埋法：凝胶包埋法是将酶或含酶菌体包埋在各种凝胶内部的微孔中，制成一定形状的固定化酶或固定化含酶菌体。大多数为球状或片状，也可按需要制成其他形状。 常用的凝胶有琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶等天然凝胶以及聚丙烯酰胺凝胶、光交联树脂等合成凝胶。 ◇半透膜包埋法：半透膜包埋法是将酶包埋在由各种高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶。 常用于制备固定化酶的半透膜有聚酰胺膜、火棉胶膜等。 (3)结合法 ◆选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方法称为结合法。 ◆根据酶与载体结合的化学键不同，结合法可分为离子键结合法和共价键结合法。 ◇离子键结合法：通过离子键使酶与载体结合的固定化方法称为离子键结合法。 离子键结合法所使用的载体是某些不溶于水的离子交换剂。常用的有DEAE-纤维素、TEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等。 ◇共价键结合法：通过共价键将酶与载体结合的固定化方法称为共价键结合法。 共价键结合法所采用的载体主要有：纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、甲壳质、氨基酸共聚物、甲基丙稀醇共聚物等。 酶分子中可以形成共价键的基团主要有：氨基、羧基、巯基、羟基、酚基和咪唑基等。 ◇要使载体与酶形成共价键，必须首先使载体活化，即借助于某种方法，在载体上引进一活泼基团。然后此活泼基团再与酶分子上的某一基团反应，形成共价键。 ◇使载体活化的方法很多。主要的有重氮法、迭氮法、溴化氰法和烷化法等。 (4)交联法 ◆借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法称为交联法。交联法也可用于含酶菌体或菌体碎片的固定化。 ◆常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等。其中应用最广泛的是戊二醛。 (5)热处理法 ◆将含酶细胞在一定温度下加热处理一段时间，使酶固定在菌体内，而制备得到固定化菌体。◆热处理法只适用于那些热稳定性较好的酶的固定化，在加热处理时，要严格控制好加热温度和时间，以免引起酶的变性失活。 1.2固定化酶的特性 (1)稳定性:固定化酶的稳定性一般比游离酶的稳定性好。 (2)最适温度: 固定化酶的最适作用温度一般与游离酶差不多，活化能也变化不大。 (3)最适pH值: 酶经过固定化后，其作用的最适pH值往往会发生一些变化。 ◆影响固定化酶最适pH值的因素主要有两个，一个是载体的带电性质，另一个是酶催化反应产物的性质。 (4)底物特异性: 固定化酶的底物特异性与游离酶比较可能有些不同，其变化与底物分子量的大小有一定关系。对于那些作用于低分子底物的酶，固定化前后的底物特异性没有明显变化。 ◆固定化酶底物特异性的改变，是由于载体的空间位阻作用引起的。 1.3固定化酶的应用 固定化酶既保持了酶的催化特性，又克服了游离酶的不足之处，具有如下显著的优点： （1）酶的稳定性增加，减少温度、pH值、有机溶剂和其他外界因素对酶的活力的影响，可以较长期地保持较高的酶活力。 （2）固定化酶可反复使用或连续使用较长时间，提高酶的利用价值，降低生产成本。 （3）固定化酶易于和反应产物分开，有利于产物的分离纯化，从而提高产品质量。 固定化酶已广泛地应用于食品、轻工、医药、化工、分析、环保、能源和科学研究等领域。 2.细胞固定化 ◆通过各种方法将细胞与水不溶性的载体结合，制备固定化细胞的过程称为细胞固定化。(固定化活细胞或固定化增殖细胞) ◆微生物细胞、植物细胞和动物细胞都可以制成固定化细胞。 2.1细胞固定化的方法 ◆主要可分为吸附法和包埋法两大类方法。 (1)吸附法 ◆利用各种固体吸附剂，将细胞吸附在其表面而使细胞固定化的方法称为吸附法。 ◆用于细胞固定化的吸附剂主要有：硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、多孔塑料、金属丝网、微载体和中空纤维等。 包埋法 ◆将细胞包埋在多孔载体内部而制成固定化细胞的方法称为包埋法。 ◆包埋法可分为凝胶包埋法和半透膜包埋法。 ◇以各种多孔凝胶为载体，将细胞包埋在凝胶的微孔内而使细胞固定化的方法称为凝胶包埋法。 ○凝胶包埋法是应用最广泛的细胞固定化方法，适用于各种微生物、动物和植物细胞的固定化。 ○凝胶包埋法所使用的载体主要有琼脂、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺凝胶和光交联树脂等。 2.2微生物细胞固定化 2.2.1固定化微生物细胞的特点： ①固定化微生物细胞保持了细胞的完整结构和天然状态，稳定性好。 ②固定化微生物细胞保持了细胞内原有的酶系、辅酶体系和代谢调控体系，可以按照原来的代谢途径进行新陈代谢，并进行有效的代谢调节控制。 ③发酵稳定性好，可以反复使用或者连续使用较长的一段时间。 ④固定化微生物细胞密度提高，可以提高产率。 ⑤提高工程菌的质粒稳定性， 2.2.2固定化微生物细胞的应用 ◆主要用在两个方面： ◇是利用固定化微生物细胞发酵生产各种胞外产物。 ◇二是利用固定化微生物细胞与各种电极结合制成微生物电极。 (1)利用固定化微生物生产各种产物 (2)固定化微生物细胞制造微生物传感器 2.3植物细胞固定化 2.3.1固定化植物细胞的特点： （1）植物细胞经固定化后，由于有载体的保护作用，可减轻剪切力和其他外界因素对植物细胞的影响，提高植物细胞的存活率和稳定性。 （2）细胞经固定化后，被束缚在一定的空间范围内进行生命活动，不容易聚集成团。 （3）固定化植物细胞发酵可以简便地在不同地培养阶段更换不同的培养液，即首先在生长培养基中生长增殖，在达到一定的细胞密度后，改换成发酵培养基，以利于生产各种所需的次级代谢物。 （4）固定化植物细胞可反复使用或连续使用较长的一段时间，大大缩短生产周期，提高产率。 （5）固定化植物细胞易于与培养液分离，利于产品的分离纯化，提高产品质量。 2.3.2 植物细胞固定化的方法： ◆植物细胞固定化的方法主要有吸附法和包埋法两种。 ◆吸附法是将植物细胞吸附在泡沫塑料的孔洞或裂缝内，或者将植物细胞吸附在中空纤维的外壁上。 ◆包埋法是将植物细胞包埋在琼脂、角叉菜胶、海藻酸钙凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、明胶等多孔凝胶之中。包埋方法与微生物细胞包埋时基本相同。 2.3.3固定化植物细胞的应用： ◆固定化植物细胞的主要用途是制造人工种子，就有可能获得大量具有相同遗传特性的植株。对种质的保存具有重要意义。并可以节约种子的用量。 ◆固定化植物细胞还可以用于生产各种色素、香精、药物、酶等次级代谢物。 2.4动物细胞固定化 2.4.2固定化动物细胞的特点： （1）提高细胞存活率：动物细胞经固定化后，由于有载体的保护作用，可以减轻或免受剪切力的影响，同时动物细胞可附着在载体表面生长，从而可显著提高动物细胞的存活率。 （2）提高产率：动物细胞固定化后，可先在生长培养基中生长繁殖，使细胞在载体上形成最佳分布并达到一定的细胞密度。然后可简便地改换成发酵培养基，控制发酵条件，使细胞从生长期转变到生产期，以利于提高产率。 （3）固定化动物细胞可反复使用或连续使用较长的时间。例如，中国仓鼠卵巢细胞（CHO）生产人干扰素可以稳定地生产30天。 （4）固定化细胞易于与产物分开，利于产物分离纯化，提高产品质量。 2.4.2动物细胞固定化方法： ◆动物细胞固定化地方法有吸附法和包埋法两种。 (1)吸附法： ◆大多数动物细胞属于附着细胞，它们在培养过程中，必须趋向于附着在固体表面。故此吸附法特别适合于动物细胞的固定化。 ◆转瓶是由玻璃或塑料制成，表面经过一定方法处理而带上电荷。 ◆微载体是指颗粒细小的固定化载体，直径一般为100～200μm，相对密度接近1.0。是由带有表面电荷的葡聚糖、明胶、纤维素、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯或玻璃等材料制成。微载体已用于多种动物细胞的固定化； ◆中空纤维由聚丙烯、硅化聚碳酸酯等高分子聚合物制成。 (2)包埋法 ◆包埋固定化法一般适用于悬浮细胞。 ◆根据载体和方法的不同，有凝胶包埋法、半透膜包埋法两种。 ①凝胶包埋法：利用各种多孔凝胶为载体将动物细胞固定化。细胞被固定在凝胶的微孔中生长繁殖和新陈代谢，由于有载体的保护，动物细胞有较好的稳定性，可显著提高其存活率。 用于动物细胞固定化的凝胶载体主要有琼脂糖凝胶、海藻酸钙凝胶和血纤维蛋白等。 ②半透膜包埋法：利用高分子聚合物形成的半透膜将动物细胞包埋，形成微囊型固定化动物细胞。 2.4.3固定化动物细胞的应用： 动物细胞中大部分为贴壁细胞，需要貼附在载体的表面才能正常生长。所以固定化动物细胞广泛应用。特别是采用微载体对动物细胞进行吸附固定化。 3.原生质体固定化 ◆固定化原生质体的制备主要包括原生质体的制备和原生质体固定化两个阶段。 3.1原生质体的制备 ◆不同种类的细胞，由于各自细胞壁的组成、结构和性质不同，原生质体的制备方法也不一样。 ◆原生质体的制备过程是首先将对数生长期的细胞收集起来，悬浮在含有渗透压稳定剂的高渗缓冲液中。然后加入适宜的细胞壁水解酶，在一定的条件下作用一段时间，使细胞壁破坏。分离除去细胞壁碎片、未作用的细胞以及细胞壁水解酶，而得到原生质体。 ◆除去细胞壁所使用的酶应根据细胞壁的主要成分的不同而进行选择。 ◇细菌的细胞壁主要成分是肽多糖，所以细菌原生质体制备时主要采用从蛋清中得到的溶菌酶； ◇酵母细胞壁主要由β-葡聚糖构成，故采用β-1，3-葡聚糖酶； ◇霉菌的细胞壁组分比较复杂，除含有几丁质外，还有其他多种组分，故要去除霉菌的细胞壁，则需有几丁质酶与其他有关酶共同作用。 ◇植物细胞壁由纤维素、半纤维素和果胶组成，故制备植物原生质体时主要应用纤维素酶和果胶酶。 ◆为防止制备得到的原生质体破裂，应加入适当的渗透压稳定剂。如：无机盐、糖类、糖醇等化合物。 ◆应选择对数生长期的细胞制备原生质体，以获得较高的原生质体形成率。 ◆所加进的细胞壁溶解酶的种类和浓度、酶作用温度，pH值以及作用时间等对原生质体的制备都有明显影响，必须经过试验确定其最佳条件。 3.2原生质体固定化 ◆采用包埋法制成固定化原生质体。 ◆原生质体固定化一般采用凝胶包埋法。常用的凝胶有：琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶和光交联树脂等。 3.3固定化原生质体的特点： (1)固定化原生质体由于解除了细胞壁这一扩散屏障，可增加细胞膜的通透性，有利于氧气和营养物质的传递和吸收，也有利于胞内物质的分泌，可显著提高产率。 (2)固定化原生质体由于有载体的保护作用，具有较好的操作稳定性和保存稳定性，可反复使用和连续使用较长的时间，利于连续化生产。在冰箱保存较长时间后仍能保持其生产能力。 (3)固定化原生质体易于和发酵产物分开，有利于产物的分离纯化，提高产品质量。 (4)固定化原生质体发酵的培养基中需要添加渗透压稳定剂，以保持原生质体的稳定性。这些渗透压稳定剂在发酵结束后，可用层析或膜分离技术等方法与产物分离。 3.4固定化原生质体的应用 固定化原生质体一方面保持了细胞原有的新陈代谢特性，可以照常产生原来在细胞内产生的各种代谢产物，另一方面又去除了细胞壁这一扩散屏障，有利于胞内产物不断地分泌到胞外，这样就可以不经过细胞破碎和提取工艺而在发酵液中获得所需的发酵产物，为胞内物质的工业化生产开辟了新途径。 固定化原生质体可用于各种氨基酸、酶和生物碱等物质的生产以及甾体转化等。