第九章 核酸的生物合成
中心法则
? 生物的遗传信息从 DNA传递给
mRNA的过程称为转录 。 根据
mRNA链上的遗传信息合成蛋
白质的过程, 被称为翻译和
表达 。 1958年 Crick将生物
遗传信息的这种传递方式称为中心法则 。
D N A
R N A 蛋白质
转录
反转录
翻译
复制
复制
Reverse
transcription
第一节 DNA的生物合成
一,DNA的半保留复制
复制时期
1,半保留复制的证明
2,DNA生物合成的基本问题
? 模板
? 引物
? dNTP
? DNA聚合酶
? Mg2＋
?在 5’-3’方向延伸
二、原核细胞 DNA的复制合成
1.原核 DNA聚合酶
2.复制的复杂性
5’
5’
3’
3’
酶 作用
DNA聚合酶 Ⅰ 5‘ － 3’ 聚合酶及外切酶作用,3‘ － 5’ 外切酶酶作用，
可校正 /修复 DNA链，还可切除引物
DNA聚合酶 Ⅱ 5‘ － 3’ 聚合酶及 3‘ － 5’ 外切酶酶作用，可校正 /修复
DNA链
DNA聚合酶 Ⅲ 与酶 Ⅰ 作用类似，酶活高，是主要的链延伸酶（聚合酶
replicase）
? 冈崎片段与半不连续复制（ okazaki 1968年）
? 复制方向,单起点、双向或单向复制
? 引物（ primer）及引物酶 (primase)
? 引物的切除与连接
5’－ 3’外切酶 切除引物 （ DNA聚合酶 Ⅰ ）
DNA连接酶 （大肠杆菌 DNA连接酶 /T4连接酶）
? 复制的起始
辨识起点（富含 AT区） 解旋（拓扑异构酶）
解链 单链结合蛋白（ SSB）
三、真核 DNA的复制合成
真核 DNA的合成的基本过程类似于原核 DNA，
不同之处：
? 多复制起点
? 至少有五种聚合酶 αβγδε
? 端粒的复制依赖于端粒酶
真核生物 DNA聚合酶
α β γ δ ε
亚基数 4 4 4 2 5
分子量（ KD) ＞ 250 36-38 160-300 170 256
细胞内定位 核 核 线粒体 核 核
5′→3′ 聚合活性 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
3′→5′ 外切活性 － － － － －
功能 复制、引发 修复 复制 复制 复制
DNA复制过程
真核生物 DNA复制叉结构示意图
四、反转录作用（ RNA指导下的 DNA合成）
1970年,Temin和 Baltimore在致癌 RNA病毒中发现
了反转录酶（ Reverse Transcriptase）
1.DNA聚合酶特性
需引物（ tRNA）,dNTP、模板（ RNA,DNA）,5’-3’方向聚合
2.杂交分子 H键断开
常由核糖核苷酶 H（ RNAase H）专一切除 RNA- DNA分子中的
RNA,全部或部分去除 RNA
3.前病毒 DNA
合成的 DNA链称负链,然后由依赖 DNA的 DNA聚合酶催化下,以
负链为模板合成一正链这样形成的 DNA称前病毒 DNA,前病毒
DNA可嵌入宿主细胞 DNA中 (称整合 )或潜伏于宿主细胞用其负
链 (依赖 DNA的 RNA聚合酶 )出 RNA,合成外壳蛋白,1
五,DNA的损伤与修复
1.DNA的损伤与突变
损伤可造成突变或致死
突变（ mutation）,指一种遗传状态，可以通过复
制而遗传的 DNA结构的任何永久性改变。携带突变
基因的生物称为突变体，未突变的称为野生型。
? 损伤原因
? 物理（紫外 （见下页）,高能射线、电离辐射）
? 化学（烷基化试剂、亚硝酸盐、碱基类似物）
? 生物因素（碱基对臵换、碱基的插入 / 缺失造成移
码）
? 当 DNA受到大剂量紫外线（波长 260nm附近）照射
时，可引起 DNA链上相邻的两个嘧啶碱基共价聚
合，形成二聚体，例如 TT二聚体。
2,DNA损伤修复
? 光复活
? 切除修复
? 重组修复
? SOS修复
光复活（ photoreactivation）
? 可见光（最有效波长
400nm）激活生物界
广泛分布（高等哺乳
动物除外）的光复活
酶，该酶分解嘧啶二
聚体。
? 是一种高度专一的修
复形式，只分解由于
UV照射而形成的嘧啶
二聚体。
切除修复（ excision repair）
? 即在一系列酶的作用下，
将 DNA分子中受损伤的部
分切除掉，并以完整的那
一段为模板，合成出切去
的部分，从而使 DNA恢复
正常。这是一种比较普遍
的修复机制。
? 细胞的修复功能对于保护
遗传物质 DNA不受破坏有
重要意义。
重组修复（ recombination repair）
? 又称复制后修复
（ postreplication repair）
? 受损伤的 DNA在进行复制时，
跳过损伤部位，在子代 DNA链
与损伤相对应部位出现缺口。
通过分子间重组，从完整的母
链上将相应的碱基顺序片段移
至子链的缺口处，然后再用合
成的多核苷酸来补上母链的空
缺，此过程即重复修复。并非
完全校正。
SOS修复
? 指 DNA受到严重损伤、细胞处于危急状态时所诱导
的一种 DNA修复方式，修复结果只是能维持基因组
的完整性，提高细胞的生成率，但留下的错误较多，
又称倾错性修复（ Error-Prone Repair ）。
3,基因重组与 DNA克隆（基因工程）
? 限制性内切酶
能识别 DNA特定核苷酸序列的核酸内切酶
? 分布,主要在微生物中 。
? 特点,特异性, 即识别特定核苷酸序列,
切割特定切点 。
? 结果,产生黏性未端 （ 碱基互补配对 ） 。
? 举例,大肠杆菌的一种限制酶能识别 GAATTC
序列, 并在 G和 A之间切开 。
? 一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在
特定的切割点上将 DNA 分子切断。目前已发现的限制酶
有 400～ 500多种。
运载体种类, 质粒、噬菌体和动植物病毒。
质粒的特点,
?细胞染色体外能自主复 制的小型环
状 DNA分子；
?质粒是基因工程中最常用的运载体；
?最常用的质粒是大肠杆菌的质粒；
?存在于许多细菌及酵母菌等生物中；
?质粒的存在对宿主细胞无影响；
?质粒的复制只能在宿主细胞内完成 。
? DNA重组与克隆 ① 从细胞中分
离出 DNA
①
②
③
④
⑤
⑥
② 限制酶截取
DNA片断
③ 分离大肠杆
菌中的质粒
④ DNA重组
⑤ 用重组质粒
转化大肠杆菌
⑥ 培养大肠杆菌
克隆大量基因
⑦ 重组体的筛选
PCR(polymerase Chain reaction)
聚合酶链式反应
PCR也称体外酶促基因扩增，原理类似天然 DNA复制。靶
DNA分子变性后解链，两条单链 DNA分别与两条引物互补
结合，在 4种 dNTP存在和合适和条件下，由耐热的 Taq
DNA聚合酶催化引物由 5’ － 3’ 扩增延伸，形成两条新的
双链 DNA分子，并作为下一循环的模板。每经过一个变性、
复性、延伸循环，模板 DNA增加一倍。经过 30～ 50个循环，
可使原 DNA量增加 106～ 109倍。
PCR的主要步骤：
? 模板 DNA的变性 一般选用 95℃ 左右 1min，使 DNA 双链解
为单链
? 复性 按引物实际情况确定适当温度，时间一般 30s至
1.5min
? 延伸 一般 72℃ 1min
? 循环数 按初始模板浓度确定，一般 25－ 45之间
PCR的引物设计
PCR扩增产物的特异性主要由引物决定，引物的
设计是 PCR成功的关键，
? 引物位臵和产物长度
根据不同目的和要求确定，长度一般在 200～ 800bp之间
? 引物的长度
一般为 18～ 25bp
? 末端核苷酸
3’端不得有任何修饰
? G＋ C含量和 Tm值
一般在 40－ 60%之间，两条相差 2－ 3 ℃
第二节 RNA的生物合成
DNA携带的遗传信息（基因）
传递给 RNA分子的过程称转
录（ transcription）。
在生物界,RNA合成有两种方式：
一是 DNA指导的 RNA合成，此为生物体
内的主要合成方式。另一种是 RNA指
导的 RNA合成，此种方式常见于病毒。
转录产生的初级转录本是 RNA前体
（ RNA precursor），需经加工过程
（ processing）方具有生物学活性。
反应体系,DNA模板,NTP,酶,Mg2+,Mn2+，合成方向
5'→3' 。连接方式 -- 3',5'磷酸二酯键。
转录特点,不对称转录 --DNA片段转录时，双链 DNA中只有
一条链作为转录的模板，这种转录方式称作 不对称转录 。
模板链 (template strand)及反意义链 (antisense strand):指
导 RNA合成的 DNA链为模板链，又称反意义链。
编码链 (coding strand)及有意义链 (sense strand),不作为
转录的另一条 DNA链为编码链，又称有意义链。由于基因
分布于不同的 DNA单链中，即某条 DNA单链对某个基因是模
板链，而对另一个基因则是编码链。
原料,四种磷酸核苷 NTP,DNA中的 T在 RNA合成中变为 U
合成过程,连续,
方向,5‘→3 ’从头合成,5′— 末端的起始核苷酸常为 GTP或
ATP
一、转录基本特点
? 不对称转录
?, 转录单位, （ transcription unit）
以 操纵子 （ operon）为转录的功能单位,结构上包括四
个功能区：多顺反子（结构基因区）、启动子、操作子、
终止子和调节基因。
? 原核 RNA聚合酶
? 转录过程
二、原核细胞 RNA转录合成特点
调节基因 启动子
操纵
基因 lacZ lacY lacA
CAP
cAMP CAP-cAMP复合物
mRNA+
?-半乳糖苷酶
?-半乳糖苷透过酶
?-半乳糖苷乙酰
基转移酶酶
forward
大肠杆菌的 RNA聚合酶
全酶由 5种亚基 α 2ββ ’ ?σ 组成, σ 因子与其它
部分的结合不是十分紧密，它易于与 β ’βα 2分离，
没有 σ, ?亚基的酶称为核心酶 —— 只催化链的延长，
对起始无作用。
五种亚基的功能分别为：
α 亚基,与启动子结合功能。
β 亚基,含催化部位，起催化作用，催化形 成磷酸二
酯键。
?亚基：在全酶中存在，功能不清楚。
β ’ 亚基,与 DNA模板结合功能。
σ 亚基,识别起始位点。
识别
解链
起始
延伸
终止
1,起始位点的识别
σ 识别正确的启动位点,启动子的结构至少由三部分组
成,-35序列提供了 RNA聚合酶全酶识别的信号； -10序列是
酶的紧密结合位点（富含 AT碱基，利于双链打开）；第三
部分是 RNA合成的起始点。
3’
5’
+1
转录起始点
AACTGT ATATTA
TTGACA TATAAT
5’
3’
－ 35序列
Sextama 框
－ 10序列
Pribnow框
2,转录起始
加入的第一个核苷三磷酸常是 GTP或 ATP。所形成的 启动子、全酶
和核苷三磷酸复合物称为三元起始复合物,第一个核苷三磷酸一旦
掺入到转录起始点,σ 亚基就会被释放脱离核心酶。
-35 -10 pppG或 pppA
5‘
5‘
3‘
3‘
模板链
E?
3.链的延伸
以 NTP为原料和能量,DNA模板链为模板,靠核心酶的催化，
核苷酸间通过 3′,5′-磷酸二酯键成核糖核酸链 (RNA)
4,转录终止
转 录终止信号有两种情况
弱终止子,依赖 ρ 因子（终止因子,terminators） 的终止
NusA蛋白识别 DNA链上的终止信号，在 ρ 因子帮助终止。
强终止子,（ 1 ）在终止点之前具有一段富含 G-C的回
文区域。（ 2）富含 G-C的区域之后是一连串的 dA碱基序
列，它们转录的 RNA链的末端为一连串 U（连续 6个） 。
三、真核生物的转录作用
酶类 分布 产物 活性 分子量
(KDa)
反应条件
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
核仁
核质
核质
rRNA（ 5.8S、
18S,28S ）
mRNA
tRNA,5S rRNA
50～ 70％
20～ 40％
10％
500
～ 700
～ 700
低离子强度要
求 Mg2+或 Mn2+
高离子强度
高 Mn2+浓度
1.真核 RNA聚合酶
2,转录
真核 RNA转录基本过程与原核类似，但其产生的 mRNA为
,单顺反子,,只编码一条肽链。
四、转录过程的选择性抑制剂
放线菌素 D 利福平 α －鹅膏蕈碱
原核 抑制 抑制 不抑制
真核 抑制 不抑制 抑制 RNA聚合酶 Ⅱ
五、转录产物的“加工”（成熟过程）
在细胞内，由 RNA聚合酶合成的原初转录物（ primary
transcript）往往需要一系列的变化，包括链的裂解,5?
和 3?末端的切除和特殊结构的形成、核苷的修饰、以及拼
接和编辑等过程，才转变为成熟的 RNA分子。此过程总称
为 RNA的成熟 或称为 RNA的转录后加工。
原核生物 的 mRNA转录后一般不需要加工，转录的同时
即进行翻译（半寿期短）。
rRNA前体的转录后加工
tRNA前体的加工
真核 mRNA前体的加工
?rRNA前体的加工
?rRNA基因之间以纵向串联的方式重复排列。
? 加工过程：
1、剪切作用：需核酸酶参与。
2、甲基化修饰：修饰在碱基上。
3、自我剪接：一种核酶的作用。
原核 rRNA加工,rRNA含非转录的间隔区，其产物中含 tRNA
真核 rRNA加工：
1.5S自成体系加工少无修饰和剪接。
2.45S加工中含剪切和甲基化修饰，需核酸酶。
大肠杆菌 rRNA前体加工
真核生物 rRNA前体加工
?tRNA前体的加工
? tRNA前体在 tRNA剪切酶的作用下，切成一定在小的
tRNA分子
? 3’末端加上 CCA
? 碱基的修饰：甲基化、脱氨和还原作用
? 真核 mRNA前体的加工
? 剪接（ Splicing） 去除内含子，连接外显子
? 5’帽端结构的生成（如图）
? 3’端多聚 A（ polyA）的附加
六,RNA的复制合成（ RNA指导的 RNA合成）
?噬菌体 Qβ 的 RNA复制两阶段
（ 1）其单链 RNA可充当 mRNA，利用寄主中的核糖体合成 外壳
蛋白 和 RNA复制酶的 β 亚基。
（ 2）复制酶的 β 亚基可与来自寄主细胞的亚基 α ?δ 自动装配
成 RNA复制酶,可进行 RNA的复制，以分子中单链 RNA为模板
（正链），复制出一条新的 RNA链（负链），再复制出 正链,
与外壳蛋白组装成新的噬菌体颗粒。
?某些 RNA病毒可以以自身 RNA为模板进行复制。
?不同的 RNA病毒复制方式不同
5 ? RNA-
5 ?
3 ?
3 ?
RNA+
释放 释放
3? 5 ? 3 ?
3 ?
5 ?
5 ?
RNA+ RNA+
RNA-
?RNA-及 RNA+的合成方向均为 5‘ 3’
核酶
? 1982年 Cech发现四膜虫 rRNA前体自我剪接作用,RNA有
催化作用 ;1983年发现 RNase P中的 RNA可催化 tRNA前体
的加工。
? 核酶我切割区内有锤头结构 （ hammer-head structure），
其中的结构特点是：
（ 1）三个茎区形成局部的双链结构；其中含 13个保
守的核苷酸,N代表任何核苷酸。
（ 2）图中的箭头表示自我切割位点，位于 GUX的 X外
侧,X可表示为 C,U或 A，不能是 G。
? 核酶的生物学意义
1.RNA为生物催化剂，具有重要生物学意义。
2.打破了酶是蛋白质的传统观念。
3.在生命起源问题上，为先有核酸提供了依据。
4.为治疗破坏有害基因，肿瘤等疾病提供手段。
七、基因表达转录调控方式
? 基因表达调控概述
? 原核生物以操纵子为单元进行表达和调控，特
异的阻遏蛋白是控制原核启动序列活性的重要
因素。
? 乳糖操纵子的调节机制
? 色氨酸操纵子的调节机制
I－调节基因
P－启动子
O－操作子（操
作基因）
Z,Y,A－三种
结构基因
?阻遏蛋白的负性调节
当无诱导物乳糖存在时，调节基因编码的阻遏蛋白
（ repressor protein）处于活性状态，阻止 RNA聚合酶与
启动基因的结合，则无法启动转录。
当有乳糖存在时,lac操纵子（元）即可被诱导。乳糖
进入细胞，经 β －半乳糖苷酶催化，转变为半乳糖。后者
作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导
致阻遏蛋白与 O序列解离、转录发生。
异丙基硫代半乳糖苷（ IPTG）是一种作用极强的诱导
剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。
? CAP（代谢产物活化蛋白）的 正性调节
当没有葡萄糖及 cAMP浓度较高时,cAMP与 CAP结合，这
时 CAP结合在 lac启动序列附近的 CAP位点，可刺激 RNA转录
活性。葡萄糖的分解代谢产物能抑制腺苷酸环化酶活性并
活化磷酸二酯酶，从而降低了 cAMP的浓度,CAP不能被活化
形成 CAP－ cAMP复合物，则不能转录。
? lac阻遏蛋白负性调节与 CAP正性调节两种机制协调合
作：当 Lac阻遏蛋白封闭转录时,CAP对该系统不能发
挥作用；但是如果没有 CAP存在来加强转录活性，即使
阻遏蛋白从操纵序列上解聚仍几无转录活性。
? lac操纵子强的诱导作用既需要乳糖存在又需缺乏葡
萄糖。
调节基因 操纵基因
结构基因
mRNA
酶蛋白
调节基因 操纵基因 结构基因
辅阻遏物 trp阻遏蛋白原
? 调节基因编码的阻遏蛋白原不与操作基因结合，结构基因转
录。 Trp或 Trp－ RNA与阻遏蛋白结合，使之构象发生变化与
操纵基因结合，结构基因不能表达。
阻遏物调节机制
衰减子调节机制
衰减子：在转录水平上调节基因表达的衰减作用，
用于终止和减弱转录，这种调节的作用部位叫衰减
子 —— 是一种位于结构基因上游前导区的终止子。
真核基因的调控
⑤ 翻译调节
（ translational control）
真核染色质体（ DNA） ① 转录前调节
转录初级产物 RNA
（ Pro－ RNA） hnRNA
③ 转录后加工的调节（ RNA Processing control）
④ 转运调节（ RNA transport control）
mRNA
⑥ mRNA降解的调控
mRNA降解物多肽链
⑦ 翻译后加工及蛋白质活性控制
（ protein activity control）
活性蛋白 失活蛋白
② 转录调节（ transcription control）
? 顺式作用元件 (cis acting elements)
真核基因的顺式调控元件是基因周围能与特异转录因子结
合而影响转录的 DNA序列。其中主要是起正性调控作用的
顺式作用元件，包括启动子 (promoter)、增强子
(enhancer)；近年又发现起负性调控作用的元件沉寂子
(silencer)。
? 1.启动子（ Promoter） 是指 RNA聚合酶结合并起动转录的 DNA序列。真核
启动子一般包括转录起始点及其上游约 100－ 200bp序列，包含有若干具有独立功能的
DNA序列元件，每个元件约长 7－ 30bp。
?
? ①核心启动子元件 (core promoter element) 指 RNA聚合
酶起始转录所必需的最小的 DNA序列，包括转录起始点及
其上游－ 25/－ 30bp处的 TATA盒。核心元件单独起作用时
? ②上游启动子元件 (upstream promoter element) 包括
通常位于－ 70bp附近的 CAAT盒和 GC盒、以及距转录起始点
更远的上游元件
? 2.增强子（ Ehancer） 一种能够提高转录效率的顺式调控元件，通常
占 100－ 200bp长度，也和启动子一样由若干组件构成，基本核心组件常为 8－
12bp，可以单拷贝或多拷贝串连形式存在。增强子的作用有以下特点：
? ①增强子提高同一条 DNA链上基因转录效率,可以远距离作用,通常可距
离 1－ 4kb、个别情况下离开所调控的基因 30kb仍能发挥作用，而且在基因的上
游或下游都能起作用
? ②增强子作用与其序列的正反方向无关,将增强子方向倒臵依然能起作用。
而将启动子倒就不能起作用，可见增强子与启动子是很不相同的。
? ③增强子要有启动子才能发挥作用,没有启动子存在，增强子不能表现活性。
? 3.沉寂子（ silencer） 最早在酵母中发现，以后在 T淋巴细胞的 T
抗原受体基因的转录和重排中证实这种沉寂子的作用可不受序列方向的影响，
也能远距离发挥作用，并可对异源基因的表达起作用，是一种负调控顺式元件。
? UAS（ upstream acticity sequence）
CAATbox（－ 70～－ 80）
GC BOX（－ 80～－ 110）
? 反式作用因子 (trans acting factors)
以反式作用影响转录的因子可统称为转录因子
(transcription factors,TF)。 RNA聚合酶是一种
反式作用于转录的蛋白因子。
? GTF（ Genaral Transcription Factor）
? TBP(TATAbox binding protein) 是唯一能识别 TATA盒
并与其结合的转录因子，是三种 RNA聚合酶转录时都需
要的；
? 不同基因由不同的上游启动子元件组成，能与不同的
转录因子结合，这些转录因子通过与基础的转录复合
体作用而影响转录的效率。现在已经发现有许多不同
的转录因子，看到的现象是：同一 DNA序列可被不同的
蛋白因子所识别；能直接结合 DNA序列的蛋白因子是少
数，但不同的蛋白因子间可以相互作用，因而多数转
录因子是通过蛋白质－蛋白质间作用与 DNA序列联系并
影响转录效率的
蛋白质的锌指结构
转录调控的实质在于蛋白质与 DNA、蛋白质与蛋
白质之间的相互作用
碱性亮氨酸拉链结构
及其与 DNA的结合
中心法则
? 生物的遗传信息从 DNA传递给
mRNA的过程称为转录 。 根据
mRNA链上的遗传信息合成蛋
白质的过程, 被称为翻译和
表达 。 1958年 Crick将生物
遗传信息的这种传递方式称为中心法则 。
D N A
R N A 蛋白质
转录
反转录
翻译
复制
复制
Reverse
transcription
第一节 DNA的生物合成
一,DNA的半保留复制
复制时期
1,半保留复制的证明
2,DNA生物合成的基本问题
? 模板
? 引物
? dNTP
? DNA聚合酶
? Mg2＋
?在 5’-3’方向延伸
二、原核细胞 DNA的复制合成
1.原核 DNA聚合酶
2.复制的复杂性
5’
5’
3’
3’
酶 作用
DNA聚合酶 Ⅰ 5‘ － 3’ 聚合酶及外切酶作用,3‘ － 5’ 外切酶酶作用，
可校正 /修复 DNA链，还可切除引物
DNA聚合酶 Ⅱ 5‘ － 3’ 聚合酶及 3‘ － 5’ 外切酶酶作用，可校正 /修复
DNA链
DNA聚合酶 Ⅲ 与酶 Ⅰ 作用类似，酶活高，是主要的链延伸酶（聚合酶
replicase）
? 冈崎片段与半不连续复制（ okazaki 1968年）
? 复制方向,单起点、双向或单向复制
? 引物（ primer）及引物酶 (primase)
? 引物的切除与连接
5’－ 3’外切酶 切除引物 （ DNA聚合酶 Ⅰ ）
DNA连接酶 （大肠杆菌 DNA连接酶 /T4连接酶）
? 复制的起始
辨识起点（富含 AT区） 解旋（拓扑异构酶）
解链 单链结合蛋白（ SSB）
三、真核 DNA的复制合成
真核 DNA的合成的基本过程类似于原核 DNA，
不同之处：
? 多复制起点
? 至少有五种聚合酶 αβγδε
? 端粒的复制依赖于端粒酶
真核生物 DNA聚合酶
α β γ δ ε
亚基数 4 4 4 2 5
分子量（ KD) ＞ 250 36-38 160-300 170 256
细胞内定位 核 核 线粒体 核 核
5′→3′ 聚合活性 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
3′→5′ 外切活性 － － － － －
功能 复制、引发 修复 复制 复制 复制
DNA复制过程
真核生物 DNA复制叉结构示意图
四、反转录作用（ RNA指导下的 DNA合成）
1970年,Temin和 Baltimore在致癌 RNA病毒中发现
了反转录酶（ Reverse Transcriptase）
1.DNA聚合酶特性
需引物（ tRNA）,dNTP、模板（ RNA,DNA）,5’-3’方向聚合
2.杂交分子 H键断开
常由核糖核苷酶 H（ RNAase H）专一切除 RNA- DNA分子中的
RNA,全部或部分去除 RNA
3.前病毒 DNA
合成的 DNA链称负链,然后由依赖 DNA的 DNA聚合酶催化下,以
负链为模板合成一正链这样形成的 DNA称前病毒 DNA,前病毒
DNA可嵌入宿主细胞 DNA中 (称整合 )或潜伏于宿主细胞用其负
链 (依赖 DNA的 RNA聚合酶 )出 RNA,合成外壳蛋白,1
五,DNA的损伤与修复
1.DNA的损伤与突变
损伤可造成突变或致死
突变（ mutation）,指一种遗传状态，可以通过复
制而遗传的 DNA结构的任何永久性改变。携带突变
基因的生物称为突变体，未突变的称为野生型。
? 损伤原因
? 物理（紫外 （见下页）,高能射线、电离辐射）
? 化学（烷基化试剂、亚硝酸盐、碱基类似物）
? 生物因素（碱基对臵换、碱基的插入 / 缺失造成移
码）
? 当 DNA受到大剂量紫外线（波长 260nm附近）照射
时，可引起 DNA链上相邻的两个嘧啶碱基共价聚
合，形成二聚体，例如 TT二聚体。
2,DNA损伤修复
? 光复活
? 切除修复
? 重组修复
? SOS修复
光复活（ photoreactivation）
? 可见光（最有效波长
400nm）激活生物界
广泛分布（高等哺乳
动物除外）的光复活
酶，该酶分解嘧啶二
聚体。
? 是一种高度专一的修
复形式，只分解由于
UV照射而形成的嘧啶
二聚体。
切除修复（ excision repair）
? 即在一系列酶的作用下，
将 DNA分子中受损伤的部
分切除掉，并以完整的那
一段为模板，合成出切去
的部分，从而使 DNA恢复
正常。这是一种比较普遍
的修复机制。
? 细胞的修复功能对于保护
遗传物质 DNA不受破坏有
重要意义。
重组修复（ recombination repair）
? 又称复制后修复
（ postreplication repair）
? 受损伤的 DNA在进行复制时，
跳过损伤部位，在子代 DNA链
与损伤相对应部位出现缺口。
通过分子间重组，从完整的母
链上将相应的碱基顺序片段移
至子链的缺口处，然后再用合
成的多核苷酸来补上母链的空
缺，此过程即重复修复。并非
完全校正。
SOS修复
? 指 DNA受到严重损伤、细胞处于危急状态时所诱导
的一种 DNA修复方式，修复结果只是能维持基因组
的完整性，提高细胞的生成率，但留下的错误较多，
又称倾错性修复（ Error-Prone Repair ）。
3,基因重组与 DNA克隆（基因工程）
? 限制性内切酶
能识别 DNA特定核苷酸序列的核酸内切酶
? 分布,主要在微生物中 。
? 特点,特异性, 即识别特定核苷酸序列,
切割特定切点 。
? 结果,产生黏性未端 （ 碱基互补配对 ） 。
? 举例,大肠杆菌的一种限制酶能识别 GAATTC
序列, 并在 G和 A之间切开 。
? 一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在
特定的切割点上将 DNA 分子切断。目前已发现的限制酶
有 400～ 500多种。
运载体种类, 质粒、噬菌体和动植物病毒。
质粒的特点,
?细胞染色体外能自主复 制的小型环
状 DNA分子；
?质粒是基因工程中最常用的运载体；
?最常用的质粒是大肠杆菌的质粒；
?存在于许多细菌及酵母菌等生物中；
?质粒的存在对宿主细胞无影响；
?质粒的复制只能在宿主细胞内完成 。
? DNA重组与克隆 ① 从细胞中分
离出 DNA
①
②
③
④
⑤
⑥
② 限制酶截取
DNA片断
③ 分离大肠杆
菌中的质粒
④ DNA重组
⑤ 用重组质粒
转化大肠杆菌
⑥ 培养大肠杆菌
克隆大量基因
⑦ 重组体的筛选
PCR(polymerase Chain reaction)
聚合酶链式反应
PCR也称体外酶促基因扩增，原理类似天然 DNA复制。靶
DNA分子变性后解链，两条单链 DNA分别与两条引物互补
结合，在 4种 dNTP存在和合适和条件下，由耐热的 Taq
DNA聚合酶催化引物由 5’ － 3’ 扩增延伸，形成两条新的
双链 DNA分子，并作为下一循环的模板。每经过一个变性、
复性、延伸循环，模板 DNA增加一倍。经过 30～ 50个循环，
可使原 DNA量增加 106～ 109倍。
PCR的主要步骤：
? 模板 DNA的变性 一般选用 95℃ 左右 1min，使 DNA 双链解
为单链
? 复性 按引物实际情况确定适当温度，时间一般 30s至
1.5min
? 延伸 一般 72℃ 1min
? 循环数 按初始模板浓度确定，一般 25－ 45之间
PCR的引物设计
PCR扩增产物的特异性主要由引物决定，引物的
设计是 PCR成功的关键，
? 引物位臵和产物长度
根据不同目的和要求确定，长度一般在 200～ 800bp之间
? 引物的长度
一般为 18～ 25bp
? 末端核苷酸
3’端不得有任何修饰
? G＋ C含量和 Tm值
一般在 40－ 60%之间，两条相差 2－ 3 ℃
第二节 RNA的生物合成
DNA携带的遗传信息（基因）
传递给 RNA分子的过程称转
录（ transcription）。
在生物界,RNA合成有两种方式：
一是 DNA指导的 RNA合成，此为生物体
内的主要合成方式。另一种是 RNA指
导的 RNA合成，此种方式常见于病毒。
转录产生的初级转录本是 RNA前体
（ RNA precursor），需经加工过程
（ processing）方具有生物学活性。
反应体系,DNA模板,NTP,酶,Mg2+,Mn2+，合成方向
5'→3' 。连接方式 -- 3',5'磷酸二酯键。
转录特点,不对称转录 --DNA片段转录时，双链 DNA中只有
一条链作为转录的模板，这种转录方式称作 不对称转录 。
模板链 (template strand)及反意义链 (antisense strand):指
导 RNA合成的 DNA链为模板链，又称反意义链。
编码链 (coding strand)及有意义链 (sense strand),不作为
转录的另一条 DNA链为编码链，又称有意义链。由于基因
分布于不同的 DNA单链中，即某条 DNA单链对某个基因是模
板链，而对另一个基因则是编码链。
原料,四种磷酸核苷 NTP,DNA中的 T在 RNA合成中变为 U
合成过程,连续,
方向,5‘→3 ’从头合成,5′— 末端的起始核苷酸常为 GTP或
ATP
一、转录基本特点
? 不对称转录
?, 转录单位, （ transcription unit）
以 操纵子 （ operon）为转录的功能单位,结构上包括四
个功能区：多顺反子（结构基因区）、启动子、操作子、
终止子和调节基因。
? 原核 RNA聚合酶
? 转录过程
二、原核细胞 RNA转录合成特点
调节基因 启动子
操纵
基因 lacZ lacY lacA
CAP
cAMP CAP-cAMP复合物
mRNA+
?-半乳糖苷酶
?-半乳糖苷透过酶
?-半乳糖苷乙酰
基转移酶酶
forward
大肠杆菌的 RNA聚合酶
全酶由 5种亚基 α 2ββ ’ ?σ 组成, σ 因子与其它
部分的结合不是十分紧密，它易于与 β ’βα 2分离，
没有 σ, ?亚基的酶称为核心酶 —— 只催化链的延长，
对起始无作用。
五种亚基的功能分别为：
α 亚基,与启动子结合功能。
β 亚基,含催化部位，起催化作用，催化形 成磷酸二
酯键。
?亚基：在全酶中存在，功能不清楚。
β ’ 亚基,与 DNA模板结合功能。
σ 亚基,识别起始位点。
识别
解链
起始
延伸
终止
1,起始位点的识别
σ 识别正确的启动位点,启动子的结构至少由三部分组
成,-35序列提供了 RNA聚合酶全酶识别的信号； -10序列是
酶的紧密结合位点（富含 AT碱基，利于双链打开）；第三
部分是 RNA合成的起始点。
3’
5’
+1
转录起始点
AACTGT ATATTA
TTGACA TATAAT
5’
3’
－ 35序列
Sextama 框
－ 10序列
Pribnow框
2,转录起始
加入的第一个核苷三磷酸常是 GTP或 ATP。所形成的 启动子、全酶
和核苷三磷酸复合物称为三元起始复合物,第一个核苷三磷酸一旦
掺入到转录起始点,σ 亚基就会被释放脱离核心酶。
-35 -10 pppG或 pppA
5‘
5‘
3‘
3‘
模板链
E?
3.链的延伸
以 NTP为原料和能量,DNA模板链为模板,靠核心酶的催化，
核苷酸间通过 3′,5′-磷酸二酯键成核糖核酸链 (RNA)
4,转录终止
转 录终止信号有两种情况
弱终止子,依赖 ρ 因子（终止因子,terminators） 的终止
NusA蛋白识别 DNA链上的终止信号，在 ρ 因子帮助终止。
强终止子,（ 1 ）在终止点之前具有一段富含 G-C的回
文区域。（ 2）富含 G-C的区域之后是一连串的 dA碱基序
列，它们转录的 RNA链的末端为一连串 U（连续 6个） 。
三、真核生物的转录作用
酶类 分布 产物 活性 分子量
(KDa)
反应条件
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
核仁
核质
核质
rRNA（ 5.8S、
18S,28S ）
mRNA
tRNA,5S rRNA
50～ 70％
20～ 40％
10％
500
～ 700
～ 700
低离子强度要
求 Mg2+或 Mn2+
高离子强度
高 Mn2+浓度
1.真核 RNA聚合酶
2,转录
真核 RNA转录基本过程与原核类似，但其产生的 mRNA为
,单顺反子,,只编码一条肽链。
四、转录过程的选择性抑制剂
放线菌素 D 利福平 α －鹅膏蕈碱
原核 抑制 抑制 不抑制
真核 抑制 不抑制 抑制 RNA聚合酶 Ⅱ
五、转录产物的“加工”（成熟过程）
在细胞内，由 RNA聚合酶合成的原初转录物（ primary
transcript）往往需要一系列的变化，包括链的裂解,5?
和 3?末端的切除和特殊结构的形成、核苷的修饰、以及拼
接和编辑等过程，才转变为成熟的 RNA分子。此过程总称
为 RNA的成熟 或称为 RNA的转录后加工。
原核生物 的 mRNA转录后一般不需要加工，转录的同时
即进行翻译（半寿期短）。
rRNA前体的转录后加工
tRNA前体的加工
真核 mRNA前体的加工
?rRNA前体的加工
?rRNA基因之间以纵向串联的方式重复排列。
? 加工过程：
1、剪切作用：需核酸酶参与。
2、甲基化修饰：修饰在碱基上。
3、自我剪接：一种核酶的作用。
原核 rRNA加工,rRNA含非转录的间隔区，其产物中含 tRNA
真核 rRNA加工：
1.5S自成体系加工少无修饰和剪接。
2.45S加工中含剪切和甲基化修饰，需核酸酶。
大肠杆菌 rRNA前体加工
真核生物 rRNA前体加工
?tRNA前体的加工
? tRNA前体在 tRNA剪切酶的作用下，切成一定在小的
tRNA分子
? 3’末端加上 CCA
? 碱基的修饰：甲基化、脱氨和还原作用
? 真核 mRNA前体的加工
? 剪接（ Splicing） 去除内含子，连接外显子
? 5’帽端结构的生成（如图）
? 3’端多聚 A（ polyA）的附加
六,RNA的复制合成（ RNA指导的 RNA合成）
?噬菌体 Qβ 的 RNA复制两阶段
（ 1）其单链 RNA可充当 mRNA，利用寄主中的核糖体合成 外壳
蛋白 和 RNA复制酶的 β 亚基。
（ 2）复制酶的 β 亚基可与来自寄主细胞的亚基 α ?δ 自动装配
成 RNA复制酶,可进行 RNA的复制，以分子中单链 RNA为模板
（正链），复制出一条新的 RNA链（负链），再复制出 正链,
与外壳蛋白组装成新的噬菌体颗粒。
?某些 RNA病毒可以以自身 RNA为模板进行复制。
?不同的 RNA病毒复制方式不同
5 ? RNA-
5 ?
3 ?
3 ?
RNA+
释放 释放
3? 5 ? 3 ?
3 ?
5 ?
5 ?
RNA+ RNA+
RNA-
?RNA-及 RNA+的合成方向均为 5‘ 3’
核酶
? 1982年 Cech发现四膜虫 rRNA前体自我剪接作用,RNA有
催化作用 ;1983年发现 RNase P中的 RNA可催化 tRNA前体
的加工。
? 核酶我切割区内有锤头结构 （ hammer-head structure），
其中的结构特点是：
（ 1）三个茎区形成局部的双链结构；其中含 13个保
守的核苷酸,N代表任何核苷酸。
（ 2）图中的箭头表示自我切割位点，位于 GUX的 X外
侧,X可表示为 C,U或 A，不能是 G。
? 核酶的生物学意义
1.RNA为生物催化剂，具有重要生物学意义。
2.打破了酶是蛋白质的传统观念。
3.在生命起源问题上，为先有核酸提供了依据。
4.为治疗破坏有害基因，肿瘤等疾病提供手段。
七、基因表达转录调控方式
? 基因表达调控概述
? 原核生物以操纵子为单元进行表达和调控，特
异的阻遏蛋白是控制原核启动序列活性的重要
因素。
? 乳糖操纵子的调节机制
? 色氨酸操纵子的调节机制
I－调节基因
P－启动子
O－操作子（操
作基因）
Z,Y,A－三种
结构基因
?阻遏蛋白的负性调节
当无诱导物乳糖存在时，调节基因编码的阻遏蛋白
（ repressor protein）处于活性状态，阻止 RNA聚合酶与
启动基因的结合，则无法启动转录。
当有乳糖存在时,lac操纵子（元）即可被诱导。乳糖
进入细胞，经 β －半乳糖苷酶催化，转变为半乳糖。后者
作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导
致阻遏蛋白与 O序列解离、转录发生。
异丙基硫代半乳糖苷（ IPTG）是一种作用极强的诱导
剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。
? CAP（代谢产物活化蛋白）的 正性调节
当没有葡萄糖及 cAMP浓度较高时,cAMP与 CAP结合，这
时 CAP结合在 lac启动序列附近的 CAP位点，可刺激 RNA转录
活性。葡萄糖的分解代谢产物能抑制腺苷酸环化酶活性并
活化磷酸二酯酶，从而降低了 cAMP的浓度,CAP不能被活化
形成 CAP－ cAMP复合物，则不能转录。
? lac阻遏蛋白负性调节与 CAP正性调节两种机制协调合
作：当 Lac阻遏蛋白封闭转录时,CAP对该系统不能发
挥作用；但是如果没有 CAP存在来加强转录活性，即使
阻遏蛋白从操纵序列上解聚仍几无转录活性。
? lac操纵子强的诱导作用既需要乳糖存在又需缺乏葡
萄糖。
调节基因 操纵基因
结构基因
mRNA
酶蛋白
调节基因 操纵基因 结构基因
辅阻遏物 trp阻遏蛋白原
? 调节基因编码的阻遏蛋白原不与操作基因结合，结构基因转
录。 Trp或 Trp－ RNA与阻遏蛋白结合，使之构象发生变化与
操纵基因结合，结构基因不能表达。
阻遏物调节机制
衰减子调节机制
衰减子：在转录水平上调节基因表达的衰减作用，
用于终止和减弱转录，这种调节的作用部位叫衰减
子 —— 是一种位于结构基因上游前导区的终止子。
真核基因的调控
⑤ 翻译调节
（ translational control）
真核染色质体（ DNA） ① 转录前调节
转录初级产物 RNA
（ Pro－ RNA） hnRNA
③ 转录后加工的调节（ RNA Processing control）
④ 转运调节（ RNA transport control）
mRNA
⑥ mRNA降解的调控
mRNA降解物多肽链
⑦ 翻译后加工及蛋白质活性控制
（ protein activity control）
活性蛋白 失活蛋白
② 转录调节（ transcription control）
? 顺式作用元件 (cis acting elements)
真核基因的顺式调控元件是基因周围能与特异转录因子结
合而影响转录的 DNA序列。其中主要是起正性调控作用的
顺式作用元件，包括启动子 (promoter)、增强子
(enhancer)；近年又发现起负性调控作用的元件沉寂子
(silencer)。
? 1.启动子（ Promoter） 是指 RNA聚合酶结合并起动转录的 DNA序列。真核
启动子一般包括转录起始点及其上游约 100－ 200bp序列，包含有若干具有独立功能的
DNA序列元件，每个元件约长 7－ 30bp。
?
? ①核心启动子元件 (core promoter element) 指 RNA聚合
酶起始转录所必需的最小的 DNA序列，包括转录起始点及
其上游－ 25/－ 30bp处的 TATA盒。核心元件单独起作用时
? ②上游启动子元件 (upstream promoter element) 包括
通常位于－ 70bp附近的 CAAT盒和 GC盒、以及距转录起始点
更远的上游元件
? 2.增强子（ Ehancer） 一种能够提高转录效率的顺式调控元件，通常
占 100－ 200bp长度，也和启动子一样由若干组件构成，基本核心组件常为 8－
12bp，可以单拷贝或多拷贝串连形式存在。增强子的作用有以下特点：
? ①增强子提高同一条 DNA链上基因转录效率,可以远距离作用,通常可距
离 1－ 4kb、个别情况下离开所调控的基因 30kb仍能发挥作用，而且在基因的上
游或下游都能起作用
? ②增强子作用与其序列的正反方向无关,将增强子方向倒臵依然能起作用。
而将启动子倒就不能起作用，可见增强子与启动子是很不相同的。
? ③增强子要有启动子才能发挥作用,没有启动子存在，增强子不能表现活性。
? 3.沉寂子（ silencer） 最早在酵母中发现，以后在 T淋巴细胞的 T
抗原受体基因的转录和重排中证实这种沉寂子的作用可不受序列方向的影响，
也能远距离发挥作用，并可对异源基因的表达起作用，是一种负调控顺式元件。
? UAS（ upstream acticity sequence）
CAATbox（－ 70～－ 80）
GC BOX（－ 80～－ 110）
? 反式作用因子 (trans acting factors)
以反式作用影响转录的因子可统称为转录因子
(transcription factors,TF)。 RNA聚合酶是一种
反式作用于转录的蛋白因子。
? GTF（ Genaral Transcription Factor）
? TBP(TATAbox binding protein) 是唯一能识别 TATA盒
并与其结合的转录因子，是三种 RNA聚合酶转录时都需
要的；
? 不同基因由不同的上游启动子元件组成，能与不同的
转录因子结合，这些转录因子通过与基础的转录复合
体作用而影响转录的效率。现在已经发现有许多不同
的转录因子，看到的现象是：同一 DNA序列可被不同的
蛋白因子所识别；能直接结合 DNA序列的蛋白因子是少
数，但不同的蛋白因子间可以相互作用，因而多数转
录因子是通过蛋白质－蛋白质间作用与 DNA序列联系并
影响转录效率的
蛋白质的锌指结构
转录调控的实质在于蛋白质与 DNA、蛋白质与蛋
白质之间的相互作用
碱性亮氨酸拉链结构
及其与 DNA的结合
