上海中医药大学
《分子生物学技术在中医药研究中的应用》教案（1）
课程名称 分子生物学技术在中医药研究中的应用 总学时数 48
专业 中医基础和中医临床专业 授课教师 方肇勤、管冬元、潘志强
内容
绪论、重组质粒
时数
5
本次课目的要求
了解分子生物学常用技术的沿革、任务和在中医药学中的地位和作用。
了解分子生物学的常用载体质粒及其特征。
掌握重组质粒方法。
本次课的重点难点
重点放在中医药研究中的应用，解决为何用、如何用。要求深入浅出地介绍，例举中医药研究事例说明。
分子生物学的常用载体质粒及其特征。
方法：理论部分一道进行，然后实验。
本次课的应用教具
多媒体设备。
重组质粒实验及有关仪器设备。
绪 论
一．中医药实验研究为什么要采用分子生物学技术
1．一些不同的认识
（1）中医是宏观的，讲整体的，讲辨证的，讲阴阳平衡的。微观的分子生物学是没有办法来研究中医的，不能研究中医的。
（2）担心采用现代技术研究中医，中医会被西医吃掉；
（3）中医的灵魂在临床。
于是一些人对此技术格格不入，学不进去。
这里就有这样一些疑问，持这些观点的人是否真正了解中医药的发展历史，是否了解分子生物学及其技术，是否了解当今医学研究发展的现状？回答大多是否定的。
回顾历史，教训是很多的。中医药一度比较发达的解剖、麻醉、化学药物合成，这些有时早已丧失；宋以来的人痘人工免疫、明以来的疠气学说、当代的水蛭素等，优势已经或还在不断地丧失！医学存在客观上存在的竞争。面对这样的竞争，怎么办？此外，中医药还要不要发展、要不要创新，采用什么手段去发展和创新？
一边是深深的忧患意识，一边却是动嘴不动手的妄加评判。我们不赞成这样的做法。
因此，本课程的目的要解决3个问题：
（1）分子生物学技术能不能用来研究中医，即 能否用？
（2）如何用分子生物学技术来研究中医，即 如何用？
（3）分子生物学技术用来研究中医的目的，即 为何用？
2．中医药实验研究采用分子生物学技术的必要性
40年来，中医现代化实验研究从无到有，经历了临床验证性研究，初步的机理研究，以及全方位展开的深入的机理研究和探索，包括采用先进的分子生物学技术，研究实现了与世界医学实验研究的接轨。在研究中大家逐渐认识到，加强分子生物学研究中医药是新时期中医药发展的迫切需要！这是因为：
（1）振兴中医的重要机遇
分子生物学、细胞生物学以其实验条件便于控制、实验稳定、重复性好、实验周期短、仪器试剂（包括各类试剂盒）发展快，手段丰富、国际研究普遍（使新方法、新技术层出不穷）、研究积累快、参考文献丰富，可以观察人体的不同组织的细胞、分子（这又强于动物实验），给应用该方法技术研究创造了绝佳的条件。
业已进行的研究揭示和开拓出生命科学广大的未知领域。
由于分子生物学新兴、发展快，给国内外、中西医创造了同等的发展和应用的机会，再次使中、西医有可能站到同一起跑线上。抓住这个千载难逢的机会，充分利用它、驾御它，必将给中医学注入强大的生命。
（2）保持中医药优势的需要
几千年来，中医在运用天然药物方面积累了丰富的经验。比如其中一些天然动植物药物的粗制品，比如水蛭素、蛇毒抗栓酶类粗制品已经作为我国的传统医药产业。但是当国外采用了分子生物学技术和生物工程，生产出水蛭素、类凝血酶素，既降低了成本，又提高了质量的稳定性。反销我国和国际市场，对我国传统医药产业形成了巨大竞争。有识之士开始呼吁不能坐视祖国医学优秀遗产的优势失去，主张抓紧采用分子生物学研究天然中药的有效成分，开发新药，不然势将失去优势。
通过几十年的研究，中药所面临的问题已经暴露得十分清楚，比如中药材的质量稳定性、占用耕地问题、有效成分和若干有效成分最佳组合的探索、有效成分得率的提高，以及服用的安全、方便等，均有赖于大量的中药学基础研究。而已有的研究表明，分子生物学是十分重要、有效的研究手段。
中药的研究有赖于中医基础的研究，而不加强分子生物学技术对中医基础的研究，没有强大的基础研究的积累和支撑，药物的研究、开发将成为无本之木。
（3）继承和发展中医基础理论的需要
中医药的作用发挥，脏腑病机的变化、不同治法（具体落实到中药复方及其有效成分，针灸、推拿等治疗方法）的作用环节和最终作用的发挥，均落实到人体基因转录与表达的调控。已有的研究表明，中医药的取效，往往是通过对基因的转录与表达调控实现的。甚至，一些基因缺失或突变所引起的疾病，中医药通过对其它有关基因的转录调控，进行补偿，达到治疗疾病的目的。深入研究对于阐明中医药的作用机制、阐明生命的调控原理，均具有重要的科学意义。作为对中医学优秀遗产的继承和发展，这部分的研究具有广阔的天地，是中医基础理论研究的重头。
另一方面，还应该看到，证的临床研究局限性与困难日益明显。主要表现在限于种种困难，证治的动态演变观察研究难以深入；临床证治的干扰因素多且复杂，严重影响到证治疗效的观察、评估；由于受到实验室检查经费昂贵、病员顾虑，不予配合等因素的限制，临床病人证治的实验室检查、复查均有困难，观察难以完整，广种薄收；由于创伤性检查在在我国目前临床上难以展开，因此细胞水平、分子水平，尤其是细胞、分子的调控研究无法进行，致使研究深入不下去。而采用分子生物学、细胞生物学技术能在很大程度上弥补其不足。
3．分子生物学的发展历程
1871年，首次发现DNA（鲑精DNA）。
1943年，证明DNA为遗传分子，而不是蛋白（1944，O T Avery）。
1953年，DNA双螺旋模型提出（J D Watson（美）和F H C Crick（英），1962年或诺贝尔生理学、医学奖）。从而为分子生物学这一学科奠基。
1961年，合成mRNA，破译第一个遗传密码（M W Nirenberg（美），1968年获诺贝尔生理学、医学奖）。
（以上被称为理论上的三大发现）
1970年，分离出第一个限制性内切酶（W Arber（瑞士），1978年获诺贝尔医学奖）。
1970年，Baltimore和Temin发现了逆转录酶。
1973年，Cohen把质粒作为基因工程的载体使用。
（以上被称为生物工程技术的的三大发明）
有人统计，自1957~1982的25年间，从事核酸研究而获得诺贝尔奖的有29位！
3个事例：
（1）1976年，重组DNA成功（H Boyer（美）和S N Colen（美？），1981年获诺贝尔化学奖）——科学精神。
（2）1982年，美国一制药公司在2000升发酵液中提取出100克精制胰岛素！相当于从1600磅动物胰腺中的提取量——效率、成本、质量、竞争。
（3）荷兰最早把分子生物学产品“猪牛痢疾疫苗”投放市场，比以上美国的胰岛素早半年——后来居上。
二．分子生物学技术在中医药研究中的实例
但是，如何运用分子生物学方法技术来研究中医，如何把两者紧密结合起来，这些技术对中医学术发展有什么帮助，如何找到最佳的切入点，等等，诸如此类的问题、困惑还萦绕在许多中医工作者和学生的脑中。归结起来，如何用、怎样用的问题并没有得到普遍地解决。为此，我们先以中医药延缓衰老的理论和研究发展为例，看看分子生物学在中医研究中的应用。
早在《黄帝内经》时代，中医学对人体的衰老和防治已经积累了丰富的经验，并在理论上把衰老归结为五脏精气虚，最终导致肾气虚、天癸竭，生殖系统衰老而丧失生殖能力。此后，预防和延缓衰老主要从补五脏、补肾入手。但是补有不同的补法，各有家传不同、门户之异，就中药复方而言，仅补肾便有平补、温补、凉补、阴阳并补、填精等区别，还有滋阴泻火、温肾祛寒、数法兼用，等等。用药讲究君臣佐使、轻重缓急，即便同一治法，用药还会有很大的区别。发展到了唐宋，已经积累起大大小小、许许多多的延缓衰老的单方和复方，面对如此众多的处方，临床应该如何选择，有没有最好的？
金元后期，朱丹溪提出阳常有余，阴常不足，治疗主张滋阴泻火，留有著名的大补阴丸。在明代李时珍《本草纲目》“黄柏”条下，也记载有长期服用单味黄柏以延缓衰老的论述。然而，明末的张介宾则极力反对，认为阳气是人体的大宝，不应该采用寒性药物大肆克伐，而力主温补。就这样，中医界寒温之争持续了几百年。几百年来，临床上有人禀承丹溪学说，也有人推衷景岳学说，没有定论。
当现代临床实验研究方法引入中医临床观察以后，发现同样是老年人，激素水平、神经递质水平存在显著差别，这些递质、激素在部分人群当中可以长期维持在一个较高的水平，而部分人群随着衰老则明显下降。其中，这些年大量实验研究所观察到的与寒证、热证有明显关系的儿茶酚胺类递质在老年人中波动就很大。我们采用动物实验研究中药二仙汤及其寒温两个拆方的作用机理时发现，温肾药对老年和去势大鼠下丘脑-垂体-性腺（去势动物观察肾上腺）轴兴奋作用突出，而滋阴泻火药对这些轴的延缓衰老和保护作用突出，部分揭示出寒、温治法的差别。联系到临床研究结果，显然，对那些激素、神经递质水平高、热象明显的老年人，补肾以偏重于滋阴泻火为妥；而对于那些激素、神经递质水平低、寒象明显的老年人，补肾以偏重于温肾壮阳为妥。这些中医基础理论研究丰富了中医学延缓衰老的理论和方法，对临床上延缓衰老的辨证论治起到了积极的指导作用。
生物医学研究表明，生殖的发生和衰老与下丘脑-垂体-性腺轴的发育成熟和衰老有关。在下丘脑水平，促性腺激素释放激素（GnRH）释放的一定数量和频率对于保持正常生殖能力是十分必要的。GnRH是由下丘脑位于弓状核和视前区的GnRH神经元所分泌。
为了进一步了解二仙汤的作用机制，我们采用了分子生物学实验技术观察了二仙汤对老年大鼠下丘脑、垂体GnRH含量的变化。研究发现，24月龄老年大鼠下丘脑GnRH mRNA含量（Northern blot）较5月龄青年大鼠下降、垂体GnRH（下丘脑合成的GnRH通过垂体门脉系统直接释放到垂体）含量也下降；而经过二仙汤的治疗，同龄老年大鼠下丘脑GnRH mRNA含量、垂体GnRH含量较老年对照大鼠增加，表明二仙汤治疗更年期综合征取效的部分机制与该处方延缓下丘脑GnRH神经元的衰老，并增进其功能有关。
那么以上的作用是对细胞产生的直接作用，还是间接的？
研究发现来源于不同部位的GnRH细胞系，对GnRH的表达数量有着很大的区别，比如GT1-7（来源于发生在前脑的肿瘤，接近GnRH细胞迁徙的终点）可以高表达GnRH，而Gn10（来源于GnRH细胞迁徙途中的肿瘤）则GnRH表达甚微——理想的研究工具。
上海第二医科大学进而采用细胞生物学的研究方法，发现与若干常用经典温肾中药复方相比，二仙汤能使GnRH细胞系GT1-7的GnRH分泌峰提前，并维持时间最长。
这些研究采用了细胞生物学和分子生物学技术加深了我们对中药复方作用机制的认识。如果不借助分子生物学、细胞生物学的技术和方法，我们便难以高效、准确、深入地观察到中药复方作用的分子机制，也就无从开展更进一步的深入研究，并在此基础上发展和丰富中医药学。
GnRH基因是如何表达的？医学和生命学科的研究探索是没有止境的。近十年来所采用的分子生物学技术研究表明，GnRH基因有3000bp左右的启动子，在这些启动子上一些区域在特定的细胞系中对于GnRH基因的高表达十分重要，被称之为增强子。GnRH细胞在胚胎初始由鼻小坑向下丘脑迁徙，并逐步分化成熟。
鉴此，研究人员推测两个细胞系中调节GnRH基因启动子的核蛋白构成会有所不同，由于这些核蛋白的构成不同，导致两个细胞系GnRH表达的多寡。我们采用分子生物学足迹法（Footprint）技术发现，来源于GT1-7和Gn10两个细胞系的核蛋白在GnRH启动子，尤其是其增强子上结合的数量以及所结合的DNA序列确实有所异同，可以推测，这些不同的结合蛋白可能是调节GnRH表达数量多寡的重要蛋白，由此也提示两个细胞系中基因的表达有所差异。
我们采用另一项新近发展起来的DDPCR技术进一步研究证实，GT1-7和Gn10两个细胞系中确实有许多基因表达不同，有的是仅仅在其中一个细胞系中表达，而另一细胞系中阙如；大多基因在两个细胞系中表达的数量明显不同。在这些差异表达的基因中，有一个基因产物称之为Ark，仅仅在Gn10中表达，之前的研究表明Ark是一个跨膜蛋白，但是采用报道基因技术研究发现，一旦使Ark基因在GT1-7细胞中表达增加，便会明显地抑制GnRH基因的表达。该现象不但新观察到Ark的新功能，同时也提示同一基因产物在细胞中可能存在的多功能。
我们进一步采用cDNA Array研究发现，有许多基因在GT1-7和Gn10两个GnRH细胞系中表达差异。其中哪些基因，或哪些基因组合对GnRH表达多寡会发生作用，目前尚不清楚，研究正在进行之中。这些研究已经是GnRH研究的国际前沿工作。
垂体呢，性腺呢？
在垂体方面：
我们的初步研究发现，二仙汤及其拆方有促进垂体LH、FSH基因mRNA转录的作用。
其中，当归似有促进垂体细胞LH、FSH释放的作用。
淫羊藿的主要成分淫羊藿苷似有促进垂体细胞LH释放的作用，但无促进垂体细胞FSH释放的作用。
黄柏、知母似有促进垂体细胞LH、FSH释放的作用，且作用接近全方。
在性腺方面：
二仙汤及其拆方能一定程度地促进卵巢颗粒细胞分泌雌二醇，其中以温肾药作用最强。
但是随着用药浓度的增加，滋阴药雌二醇分泌有减少趋势，而温肾药雌二醇分泌有增加趋势，似存在量效关系。
单味药中，以仙茅、巴戟天、淫羊藿的作用最强。
那么我们自然要问，中药复方和其它中医药治法，比如二仙汤是否对以上这些调节GnRH表达的基因产物发生影响，影响了哪些，是哪些中药有效部位或有效成分所起的作用，这些有效成分的量效关系如何，有没有最佳的组合，与已知西药的作用异同如何，等等。这样的研究势将把中医药延缓衰老的研究引向深入。
以上研究揭示出单一细胞内生物调控现象的混沌复杂，而位于组织和机体中的细胞还受到周边细胞、组织、其它系统的影响，因而变化就更复杂、更微妙，这就在细胞、分子水平印证了中医学的整体观、恒动观，丰富了中医学的整体观、恒动观。
澳大利亚的一研究发现，刺激下丘脑某一特定核团可以促使GnRH的释放，但是随着研究的深入，发现不同实验动物，对相同的刺激反应表现却不同。这一结果令人联想到中医的体质学说和证的变化。延伸出去，这些变化，就有可能是体质、证在基因、细胞、组织层次的表现，而辨证论治有可能在改变这些环节而发生作用。问题是，是不是我们要等外国人研究清楚了再去后悔呢？
所以，中医延缓衰老的深入研究要求采用以上的这些分子生物学技术，推而广之，其他中医药领域的研究也要求采用以上这些分子生物学技术，在这些研究的基础上，结合临床有效中药复方的疗效优势，给予进一步干预研究，了解作用于那些基因、调整了那些蛋白产物，与已知中西药的作用异同，等等。如此，可以极大地提高研究的效率、研究的深度、研究的可靠性、研究的竞争性。这样的研究不仅将有利于进一步揭示中药复方的作用机制，丰富中医藏象学说、辨证论治理论、治则治法学说，以及中药新药的开发、中药产品的升级换代、加强中医药产业国际的竞争力，还将发现新的生命及其调控现象，拓展人类对生命学科的认识。因此，加大分子生物学方法技术在中医药研究中的应用，是新世纪发展中医学的重要途径。
三．中医药研究经常使用的分子生物学技术
综合目前中医药研究中常用的分子生物学技术，以及将有可能普遍涉及到的技术，主要包括以下内容：
1．中医药对基因组（DNA）作用的研究
人类基因组计划的人类基因测序工作已接近尾声。一些实验动物、植物，包括中药植物的测序工作正在展开，或计划展开。鉴于中医药研究中这方面开展的研究不多，主要包括基因组DNA提取、Southern blot（观察DNA的变化，方法大体接近以后我们要介绍的Northern blot）、PCR技术、点突变PCR（研究DNA的功能及其意义）、DNA测序等。
2．中医药对某个已知基因转录（mRNA）水平调整作用的研究
主要包括提取总RNA，做Northern blot或RTPCR。
以上实验涉及到多项分子生物学常用技术和方法，包括：重组质粒、转化宿主细菌、筛选阳性克隆、扩增细菌、从细菌中制备已扩增了的DNA、利用限制性内切酶切开重组插入的DNA片段和载体、电泳分离插入DNA片段和载体、回收插入并放大的DNA基因片段、标记探针，以及制备组织或细胞的RNA，RNA电泳、把RNA 转移到硝酸纤维素膜上（印迹转移）、固定，Northern杂交、放射自显影，等等。我们详细介绍和实验操作。
3．中医药对多个已知基因转录（mRNA）水平调整作用的研究
cDNA列阵（cDNA Array）和基因芯片（Micro Array）这些在九十年代迅速发展起来的技术效率最高。这些实验所提供的信息量大，一个实验，可以观察多至1万个以上的基因变化，给研究复杂的中医药调控机制和变化提供了强有力的武器。鉴于基因芯片研究目前还需要专门的仪器设备，在一般实验室内无法开展，所以我们在第四章中详细介绍cDNA Array技术。
4．中医药对广泛未知基因差异转录（mRNA）作用的研究
该实验主要采用DDPCR技术。相关的还有cDNA库建立、基因全序列cDNA库筛选，RACE PCR技术。
5．观察中医药对某一已知蛋白表达水平的调整作用
比较常用的方法是ELISA技术、免疫组化和Western blot等技术。还有单克隆抗体制备技术。
6．观察中医药对若干已知或未知蛋白表达水平的调整作用
蛋白双向电泳和蛋白芯片技术。
7．中医药对某基因转录调控的研究
包括Footprint技术、凝胶阻滞实验、报道基因技术、功能基因插入哺乳类细胞表达载体技术、基因转移技术，等等。
以上5-7的内容，限于条件、经费和经验，我们不做介绍。
四．本课程的教学安排
包括两个方面，而重在基本技术的操作和培训：
1）理论介绍性的：如PCR技术，DNA测序，cDNA列阵（cDNA Array）和基因芯片（Micro Array），DDPCR技术，以及RACE PCR技术等。
2）实验操作训练的：如重组质粒、转化宿主细菌、筛选阳性克隆、扩增细菌、从细菌中制备已扩增了的DNA、利用限制性内切酶切开重组插入的DNA片段和载体、电泳分离插入DNA片段和载体、回收插入并放大的DNA基因片段，以及Northern blot：包括制备组织或细胞的RNA，RNA电泳、把RNA 转移到硝酸纤维素膜上（印迹转移）、固定；（可能的话，增加标记探针，Northern杂交、放射自显影），以及RTPCR。
五．推荐的参考书籍
有关分子生物学方法技术的书籍有许多，以下一些书籍我们经常参考，因此推荐给读者。
方肇勤主编《分子生物学技术在中医药研究中的应用》，上海科学技术出版社，2002年6月，第1版
黄培堂等译《分子克隆实验指南》，科学技术出版社，2002年8月，第3版。
颜子颖等译《精编分子生物学实验指南》，科学技术出版社，1998年 6月，第1版
李永明等著《实用分子生物学方法手册》，科学技术出版社，1998年6月，第1版
六．实验桌安排的介绍
七．移液器的使用介绍
