上海中医药大学
《分子生物学技术在中医药研究中的应用》教案（7）
课程名称 分子生物学技术在中医药研究中的应用 总学时数 48
专业 中医基础和中医临床专业 授课教师 方肇勤、管冬元、潘志强
内容
课程总结，介绍DDPCR、RACEPCR、测序、基因芯片等
时数
4
本次课目的要求
了解DDPCR、RACEPCR等技术和应用。
了解DNA样本测序处理、聚冰烯酰胺凝胶灌胶、上样、电泳、电泳后凝胶处理、放射自显影和读片技术。
了解基因芯片、cDNA Array原理技术和应用。
概要介绍最新分子生物学技术及其在中医药研究中的应用和课程总结。把业已操作的实验及其意义串起来重复介绍，明确其目的意义。
本次课的重点难点
DDPCR、RACEPCR等关键技术与常见问题。
DNA样本测序处理、聚冰烯酰胺凝胶灌胶、上样、电泳、电泳后凝胶处理、
放射自显影和读片关键技术与常见问题。
了解基因芯片、cDNA Array原理、关键技术与常见问题。
本次课的应用教具
多媒体教学课件。
课程总结和部分新技术介绍
（4学时）
一、中医药对基因组作用的研究
实验1 基因组DNA提取（方法类似于RNA的提取）
实验2 Southern blot（方法类似于Northern blot）
实验3 PCR
PCR是Polymerase chain reaction的缩写，中文译作聚合酶链式反应。其特点是可以在几小时内方便、快捷地将微量DNA（含由微量RNA反转录成的cDNA）扩增达106倍，得到ug级的DNA！该技术发明于八十年代中期，到了八十年代末，由于引用了耐热DNA聚合酶，使这一技术得以蓬勃发展，成为分子生物学中应用最为广泛的技术之一，发挥着日益重要的作用。
由于其方便快捷，在中医药实验研究和临床检测中应用十分广泛。例如观察慢性炎症的活检组织中一些与肿瘤发生的基因是否存在突变，中医药治疗后防突变的作用如何；一些与肿瘤发生、转归、转移、凋亡等基因的表达如何，中医药的调控如何；探针的扩增等等。
原理
采用两段引物，分别与DNA两条链上各一段序列互补，位于模板DNA中拟扩增片段两条链的3'端。加热使模板DNA变性解链，当反应的温度下降时，两引物分别与模板DNA两条链发生退火，然后两引物在DNA聚合酶的作用下延伸。在摩尔数大大过量的两段引物和4种dNTP的反应体中，位于两段引物间的DNA在反复的变性、退火、延伸的循环里，每一轮扩增的产物再一次充当下一轮扩增的模板，使其产物增加一倍。经过30-40个循环，目的DNA可由原来的1pg扩增到1ug。
1）引物退火与模版DNA结合；2）PCR第一链的延伸；3）再次变性解链后，上下游引物分别退火结合到原先和扩增了的模版上；4）PCR第二轮的延伸；5）再次变性解链；6）再次引物与扩增了的模版退火并延伸。
注意事项
PCR的常见问题主要有：
1．没有PCR产物。其主要可能有PCR反应的有关试剂缺乏，循环次数不够，退火温度太高，引物设计不好，模版不够，模版质量差，变性温度过高或过低，变性时间过长或过短，链延伸时间过短，Taq酶数量不够或质量不行，Mg++过低，dNTP过少，模版C/G过于丰富，等等。
2．PCR产物不纯，见多条条带产物。其主要可能有循环次数太多，退火温度过低，引物设计不合理，污染等。其中，引物设计不合理的可能性最大。
3．PCR产物前后一片，拖带。其主要可能有循环次数太多，退火温度太低，链延伸时间过长，模版质量差，模版过多，污染，Taq酶数量过多，Mg++过多，等等。
还有一些值得注意的问题：
4．关于引物。
（1）引物的长度。引物的长度要求不一，如模版是单一的载体和单一的插入片段，可以选用较短的插入片段两侧的载体序列作为引物，一些常用载体有现成的引物商品，可以购买。对于复杂的基因库，或反转录产物，为提高引物的特异性，建议采用较长的引物。具体可以参见RACE PCR介绍。
（2）引物的CG与AT的比例。可能的话，建议1:1左右。
（3）引物的计算机设计参见本书RTPCR介绍。
5．关于酶。一些实验反复失败，竟然会与酶的质量问题有关。因此，我们建议购买那些经常从事PCR实验的实验室所经常使用品牌及其供应商的PCR酶。
6．退火温度。通常按照检索到的文献或试剂盒提供的方法，可以确定退火温度。但是，时常会碰到两条引物的Tm值不一致，或PCR反复调整仍不见改善，此时可以考虑Touch Down PCR的方法，具体参见本书RACE PCR介绍。
7．CG丰富的DNA模版往往不容易扩增，对此，可以采用DMSO（DIMETHYL SULFOXIDE），用量为PCR反应总容积的1/10。比如将4ul的DMSO加入36ul的PCR反应液，使总容积达40ul。
8．MgCl2。通常PCR buffer中含有MgCl2，但是由于一些不清楚的原因，有时仍嫌不足，此时可以适当增加MgCl2的浓度。
9．PCR是一种十分灵敏的实验，对操作技巧要求高，为防止加样误差，建议做复管。同时，同时进行多个反应时，相同的试剂建议先一道配置，并留有余量，比如Taq酶、10×PCR Buffer、dNTP、消毒过的双蒸水等，混匀，这样可以很大程度上避免上样误差。
10．关于电泳参见本书实验29。
11．关于试管。为提高PCR的质量，以及大批量PCR反应的操作，目前业已开发出不同的PCR试管。比如为减少管壁导热的延滞，发展出超薄壁的PCR试管；为满足批量实验，发展出排状PCR试管，等等。我们在实验中先后使用过一些不同的试管，从操作方便和安全上看仍喜欢采用0.5ml的试管。这样的试管比较结实，不宜引起试管的破裂和同位素的泄漏，且手持起来方便。
实验4 点突变PCR
点突变PCR的使用机会越来越多了起来。当研究发现中医药对某些特定基因的具有调整作用以后，自然要求深入了解实现对该基因调整的具体途径，比如中医药对某基因的调整是直接的，并通过这样的调整发挥疗效，抑或是间接的；如果这些基因的功能尚不清楚，那么，哪些部位是主要的功能区，改变了这些功能区会如何；在这些基因中中医药可能对启动子的哪些部位发生作用，等等，点突变PCR技术可以为回答这些疑问提供方便。
本方法是利用PCR技术，改变目的基因的个别或若干碱基，使该碱基所处位置的基因功能发生变化，以观察其意义。例如对于功能基因，可以检测点突变后功能是否发生变化，以逐步明确功能区的意义；或直接破坏一些已明确的功能区，使该基因失去原有功能；或用于筛选启动子中的重要序列、增强子的位置，了解一些已知转录调控蛋白及其特定结合序列的关系，等等。
点突变PCR技术的实现主要有两种方法，一种是比较老的办法，叫做两步法点突变PCR；另一种发展比较晚，并得益于Taq酶性能的提高，称之为一步法点突变PCR。如STRATAGENE公司QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit所采用的一步法点突变PCR。
原理
采用性能优良的DNA聚合酶PfuTurbo DNA polymerase，设计出含有突变位点的一对对应的引物，将含有目的基因的载体加热解链，退火时，突变引物会结合到载体插入片段的相应序列上，并以此作为引物，延伸。该方法可以直接完成数千bp长度的含有插入片段的整个载体的复制，使复制的DNA含有突变位点。PCR后，PCR产物用Dpn I消化原先的模版，这是因为大多来自于大肠杆菌的DNA是甲基化的，对Dpn I敏感，而新延伸的DNA链则不然。消化后，所消化的质粒未突变链含有大量的切口，在转化大肠杆菌后，大肠杆菌会依据突变链将切口修补完善，并予以复制。从而完成基因的点突变。由于该技术仅使用一次PCR循环，所以被称为一步法点突变PCR。
实验5 DNA双脱氧链终止法测序
目的
1．了解目的DNA的序列，如获得的DDPCR片段。发现中医药改变了某一不明的mRNA转录水平，而且反转录得到了该mRNA的 cDNA，欲观察该cDNA的序列；通过基因cDNA库的筛选得到基因的全部序列，要求完成测序。
2．了解目的基因是否发生了突变、缺失。例如经中医药治疗或处理后是否可以阻止或纠正病变组织基因组的突变。
3．一些实验如Footprint要求在足迹电泳的一侧有DNA的序列，以明确核蛋白所结合启动子的区域。
鉴定某一基因是否为目的基因。
测序有一些不同的方法及其改良法，比如化学降解测序法，九十年代还发展起来多种自动测序仪，并不断升级换代，给大量的测序工作提供了快捷、便利的条件。若测序工作量不大，或没有自动测序仪，可以采用本实验介绍的方法。
原理
1977年，Sanger等报道了用双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）作为链终止剂的测序方法。2’、3’ddNTP在脱氧核糖的3’位置缺少羟基，当DNA聚合酶通过其5’三磷酸基团掺入到正在增长的DNA链后，因其缺乏3’羟基，后继的dNTP不能与之形成磷酸二酯键，从而使DNA链终止延伸。于是，在DNA合成反应混合物的4种dNTP中加入少量的一种ddNTP，当DNA合成过程中，随机掺入到正在增长的DNA链上的ddNTP将终止链的进一步延伸，这样，以同一DNA为模版所合成的的拷贝链，将是一系列不同长度的核苷酸链，其长度取决于引物末端到过早出现链终止位置之间的距离。在四组独立的反应体系中，分别加入4种不同的ddNTP和一种经标记的dNTP，结果将产生4组长度不均的寡核苷酸，分别终止于模板链的每一个A、C、G或T的位置上。然后采用能分辩长度仅差一个核苷酸的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，把四组反应液加样于凝胶中若干相邻的泳道上，电泳并放射自显影后，从凝胶的放射自显影片上可直接读出DNA上的核苷酸序列。
实验步骤
1．双链DNA测序反应
1） DNA 12 ul（3-5ug）
水 6 ul
2M NaOH/1 mM EDTA 2 ul
37℃ 10 min
2）水 7 ul
3M NaAC 6 ul
100％乙醇 75 ul
插入干冰 5 min
3）离心10 min（4℃），吸弃乙醇，移入70％预冷乙醇110ul，离心10 min（4℃），吸弃乙醇，真空离心干燥5 min。
4） H2O 6 ul
引物 2 ul
Sequence Buffer 2 ul
65℃ 2 min，在室温下10-30 min内逐渐降至室温。
5）其间，标记4管： G A T C ，加入：
Dideoxy Termination Mix ddG ddA ddT ddC
2.5 2.5 2.5 2.5 （ul）
放于一侧。于前管加入：
6）0.1M DTT 1 ul
稀释的Labeling Mix（1:4 H2O）2 ul
α[35S]dATP 1 ul
稀释的Sequenase 2 ul
混匀（避免气泡），室温下放置5 min。
7）分别将此液加入 G A T C 管中：
3.5 3.5 3.5 3.5 （ul）
37℃水浴10 min。分别加入：
Stop Solution 4 4 4 4 （ul）
75-80℃水浴3 min，置于冰上。
放入4℃冰箱，待次日电泳。
2．灌胶
1）灌胶模具处理
用肥皂水洗净上下玻璃板，清水洗净。长板灌胶面用海绵沾以100％乙醇擦净，吸取5ml Repel-silane移至玻璃板上，均匀涂于全板，再倒上一些乙醇，擦遍全板，反复抛光至干。短板灌胶面用海绵沾以100％乙醇擦净，待干。0.4mm厚的梳子、垫片（Spacer）洗净后一并用乙醇拭净，待干。
灌胶架左侧一头撑起，右侧移件拉出。长玻璃板轻轻搁上，进出水管靠近操作者。板的两侧放上夹条，近移件端，将夹条长出一侧朝内，缺失一侧向外。夹条用夹子夹住边缘暂固定。短板灌胶面向下，凹头轻轻搁在长板及夹条之上，平头搁在移件远侧。
2）配制6％变性测序胶
5×TBE 12 ml
尿素 28.8 g
水 → 48 ml，加热磁力搅拌至尿素溶解，然后加入：
40％胶 9 ml
10％过硫酸铵 0.42 ml
水 → 60 ml，混匀，灌胶前再加入
四甲基乙二胺（TEMED） 18 ul
轻轻混匀后立刻灌胶。
3）灌胶
轻轻倾倒胶至短板前的凹侧内，见凝胶渗抵长板下缘后，左手按短板前侧，右手托移件之端，向前移动，速度以长板下缘凝胶不被带起，出现气泡和因移动过慢而泄漏；另一人保持不断倾倒凝胶，以不溢出凹侧为度。待短板两侧突起抵长板及夹条上缘后，即刻放平灌胶架，两侧用夹子夹紧，左侧前缘插入梳子。前后两侧包以保鲜膜，以防凝胶干燥。通常放过夜。
以上介绍的是DNA测序工作站的灌胶方式，不同测序模具有不同的方法，比如由注射器底部灌胶法、加样瓶上部灌胶法等。具体可以参考有关实验室相应仪器的说明书。
3．电泳
1）预电泳
揭去模具两端的保鲜膜，将模具固定至电泳架上。接通模具上端与电泳架上端的恒温水浴接头。上下缓冲液槽内注入1×TBE电泳缓冲液，各约1000ml。轻轻拔去疏子，立即冲洗上样孔。开启恒温水浴，温度设置在55℃。接通并开启电源，1500V预电泳半小时。
2）上样电泳
再次冲洗上样孔。自冰箱内取出样品，按G、A、T、C、G、A、T、C次序上样，每孔上样2.5ul，每一样品分上样两孔。上样时，吸头插入上样孔内的上部，轻轻推入样品，样品因比重较大，会自动沉入孔底。上样要轻而快，上样毕迅速开启电源电泳。电压调至2000V。电泳时间长短通常视拟测序列位置而定，如从起始部测起，当溴酚蓝抵达凝胶的下三分之一时，即可停止电泳。
4．干胶、曝光
1）干胶
放掉电泳缓冲液，卸下凝胶模具，轻轻撬起短玻璃板，撬时，左手抵住玻璃板对侧，以防玻璃板滑动，破坏凝胶。翻转玻璃，平置桌上。用略大于胶面的滤纸覆于胶上，轻轻按平，使胶粘于滤纸之上。捏住胶上滤纸一角，轻轻揭起凝胶，胶面向上，放于干燥器滤纸之上。开启凝胶干燥器，调至80℃，揭开盖膜，铺一张相同大小的滤纸于干燥面上（以防真空干燥时，同位素透过粘于胶上的滤纸，污染干燥器；亦可防止干燥器上已污染的同位素反过来再污染待干燥的凝胶，影响结果分析）。胶面盖以保鲜膜，开启真空泵，铺平保鲜膜，以免漏气。盖上盖膜。真空干燥80-100分钟。
2）曝光
于暗房内，打开暗盒，置X光胶片于增感屏上，将烘干的凝胶胶面朝X光片，盖上暗盒。置暗盒于避光干燥处。曝光3天。常规冲片，视显影深浅延长或缩短曝光时间。
5．读片
读片方法同前图示。参照引物之后部分已知序列，读出所测序列，并确认上样次序是否有误。
实验结果
注意事项
1．通常由于电泳时间较长，以及还有后续的干胶等工作，通常测序反应和灌胶于同一天完成，次日一早上样电泳、干胶和放射自显影。
2．如欲当天完成测序和电泳，则应先予灌胶，再进行测序反应，以便凝胶有充分的时间聚合。一般实验室习惯将剩余的凝胶液保留，以观察聚合与否，若剩余凝胶液在容器中聚合，则可以推测注入于模具间的凝胶也已经聚合。
3．灌胶架务必调至水平，以免凝胶侧漏。通常凝胶泄漏的原因源自塑料隔片上前一次实验残存的凝胶没有清洗干净，使隔片与玻璃之间形成空隙。因此实验之后彻底的清洗十分必要。
4．配制测序胶时，温度掌握很重要：温度低，尿素不会溶解，既溶解的还会析出结晶；加入40％胶后，温度偏高则易引起凝胶过早聚合，影响灌胶。因此灌胶的室温和凝胶液的温度很重要，建议严格按方法要求操作。一些没有恒温条件的实验室，建议在气温较低的季节，采用空调或取暖装置，使室温控制在22℃左右。不然，所有器皿温度过低，会引起尿素析出结晶，导致灌胶失败。
5．按G、A、T、C、G、A、T、C次序上样的目的既使之位于4个泳道两侧G、C条带紧邻，便于读片判断G、C的先后；又可以万一在某一个泳道出现异常时，比如有小的气泡、凝胶破裂等，有另一泳道结果备用。
二、中医药对单基因转录（mRNA）作用的研究
实验6 组织总RNA提取（已经实验操作）
实验7 mRNA的分离
实验8 Northern blot（已经部分实验操作）
实验9 RTPCR（已经实验操作）
实验10 原位杂交
三、中医药对多基因转录（mRNA）作用的研究
实验11 cDNA Array 和 Micro Array
cDNA Array 即cDNA列阵，或译作矩阵，由排列在96孔板大小的少到几十个，多至上万个不同基因的cDNA点组成。
MicroArray被译作“基因芯片”，或译作“微矩阵”，这个矩阵由点在大如载玻片，小如指甲大小面积的固定介质表面的上百至数千个特定的基因组成。是cDNA Array的微型化。
MicroArray的工作原理是将欲研究细胞组织的RNA通过不同的方式转录成cDNA，转录过程中或之后给予荧光等标记，制成探针，然后在严格的条件下使该探针与微矩阵上的基因杂交，杂交后，把未杂交的基因洗脱，在一定的条件下，观察杂交结果，以了解某特定组织中基因转录的多寡和特征。如果两个组织的RNA用不同发光色彩的荧光标记，同时进行杂交，由于两个组织杂交后所激发的荧光色彩不同，微矩阵上与甲组织特有探针结合则产生甲探针的光色，与乙组织特有探针结合则产生乙探针的光色，两种探针同时结合则产生相兼色。这样在一块基因芯片上就可以方便、迅速、大规模地观察两个不同组织基因转录的异同。
在基因芯片问世的短短几年来，一些改进型的基因芯片技术陆续问世，并迅速形成产品。比如GeneChip。其特点为，1）容量大，每个芯片上可以达39000个基因，因此，单位时间内识别的基因多且快；2）在基因矩阵上每个点由上下两排更小的矩阵组成，每排由16-20个与某一mRNA不同区域对应的25个寡核苷酸组成。上下两行中，上行为正常基因序列，下行为中间有点突变的序列。这样在相同严格的杂交和洗脱条件下，上行基因16-20个点应该全部阳性反应，而下行基因因含有点突变，退火结合后不够稳定，会被洗脱。因而这样仅上行呈阳性的杂交才算有效。所以在避免假阳性方面具有别的芯片所无法比拟的优势。还如discoveryARRAY。该芯片把RFDD-PCR（限制性片段差异展示PCR）技术与MicroArray技术结合在一道。由于mRNA拷贝为PCR所放大，极大丰富地扩增了一些微量转录的mRNA，使之得以清晰地反映在Array上。我国也开始了基因芯片的研制和开发。上海的联合基因公司目前推出了不同的基因芯片，并提供技术服务。这给国内的研究提供了方便，同时产品以其价格便宜，具有很大的竞争优势。一些中医药院校和医院已开始运用这些技术，并得到初步的研究结果。
通过对现状的回顾，可以看出，当前的基因芯片技术还有着以下不足：
1．由于人类基因组测序尚未完成，许多基因还不明朗，因此，基因芯片由于所含基因数不全，以致大量的可能有变化的基因漏网，而明显影响到研究结果。正由于如此，在目的类似的DDPCR实验中可以发现许多新的基因片段。
2．小鼠、大鼠的基因测序工作还没有大面积铺开，需要更晚些时候才能完成。
3．由于由于哺乳类动物基因组数量大，测同一细胞组织，就目前的基因芯片规模，整个基因组需要许多块芯片，研究工作量、研究成本会很高。
4．研究费用高昂。
5．实验数据庞大，且大量的基因功能还不明朗，因此给进一步研究带来困难。
虽然如此，基因芯片技术已展现出绚丽的前景：
1．随着人类、大鼠、小鼠，甚至兔、狗、猴等基因组测序完成，将有可能生产出全套基因组芯片，使基因芯片完全实用。不似眼前，花钱不少，遗漏基因许多。
2．当基因芯片生产技术趋于成熟，得以象目前轿车、家用电器生产的批量化、规模化，将有可能降低生产成本，降低售价，便于普及。
3．一旦类似高效的蛋白芯片技术的解决，与基因芯片的配套使用，将会对生命科学研究取得质的突破。
4．计算机技术的发展，读片分析自动化程度增加，将使基因芯片技术更加实用。
5．不同基因功能研究的积累，以及基因功能研究技术的发展与普及，使基因芯片研究的后续工作得以有效的开展，基因芯片的学术价值将得到革命性的发展。
与基因芯片原理类似的有cDNA Array。CLONTECH Laboratories公司的Atlas cDNA Expression Arrays是其代表。其cDNA Array的矩阵点由肉眼可见大小的cDNA点组成，点于96孔板大小的硝酸纤维素膜上。工作原理是，抽提组织的总RNA或进一步分离mRNA，用反转录酶和同位素反转录mRNA成cDNA探针，与膜上的cDNA杂交，放射自显影。不同的组织分别用一张膜。其放射自显影结果可以用肉眼识别。该公司还配套有分析软件，实验结果扫描后可以通过软件比较不同组织基因转录的差异。因此该Array的优点为1）不要求专用仪器设备，一般实验室均可以操作。2）实验结果肉眼可以识别，以便调整曝光时间，以获取最佳实验结果。3）配套有分析软件，可以借助普通扫描仪和计算机分析实验结果。
但是我们使用下来有以下一些缺点：1）一般组织绝大部分的RNA丰度不够，导致大多数杂交的重复性差。由此造成定量的困难和错误，给后续研究带来困难。2）制膜的技术性问题。比如小鼠Array的杂交背景高，影响到实验结果的分析。3）软件在消除背景方面的智能化技术尚不成熟，影响到结果的分析。4）Array的基因数量少，约1200个。远远不能与一般组织大量转录的mRNA匹配。
与此技术类似的Array，有单病种Array（如前面所介绍，也可以是MicroArray），但是制作在硝酸纤维膜上的Array以其价廉方便似乎更有优势。其原理是，通过对某一疾病基因谱改变的了解，依据若干不同基因谱变化的特征，设计出针对单病种的Array。这些Array上所含的基因有限，包含了某一病种不同基因谱的关键基因，因而成本低，适用于临床的辅助诊断。
中科院上海细胞研究所德国马普学会联合实验室所开发的cDNA Array，在96孔板大小的纤维素膜上点制成含16000个左右基因的Array。信息量大。由于基因点小而密，肉眼无法识别，要求专门设备阅读和分析。
考虑到基因芯片要求有特殊的设备和专门的技术培训，在一些条件比较差的地区开展不易；而cDNA Array实验技术与Souhtern blot、Northern blot类似，不需要专门添置设备，实验结果的放射自显影可以直接用肉眼判断，适用于一般普通的实验室，为此我们介绍cDNA Array。本实验以美国CLONTECH的Atlas cDNA Expression Arrays为例。
原理
CLONTECH将目前许多研究领域热门的上千个基因分类点于带正电荷的尼龙膜上。这些基因大多已证明在不同的生物学进程中起到关键作用，比如癌基因、抑癌基因、细胞循环调节因子、离子通道、DNA结合蛋白、细胞表面抗体、细胞粘附受体、细胞信号和细胞外联系等，从而实验将提供较大信息量的结果。同时，将质粒和噬菌体DNA作为阴性对照点于矩阵之侧，以验证杂交的特异性。伴随有一些看家基因的cDNA作为阳性对照以观察正常mRNA的丰度。以上各基因名称及在GenBank中的编号该公司有专门材料提供。
实验首先将1ug的mRNA在含相应同位素和试剂盒提供优化了的引物的反应液中反转录成cDNA探针。然后用此探针与cDNA Array尼龙膜上的cDNA杂交，在严格的洗膜后放射自显影，然后进行分析，比较不同基因或不同膜上同一基因表达的多寡。该公司还有配套的计算机图象分析软件。
实验结果
在放射自显影的X光片上见有不同深浅的杂交斑点，在斑点矩阵的周围有一些看家基因的定位杂交点。可以通过试剂盒提供的印有网格的塑料膜确定不同基因表达的变化，或借助于该公司设计的分析软件对扫描入计算机的图象进行处理。
注意事项
1．通常cDNA Arrays是用来比较两个标本以上的mRNA表达的变化，因此具体操作时可以同时标记两个或两个以上的探针，每一个探针的标记方法同上。为了减少上样误差，除mRNA外，其余试剂可以先统一配置，混匀，然后分别加入不同来源的mRNA中进行探针的标记。
2．我们曾作过比较，采用总RNA不理想，mRNA浓度不够，背景高。采用mRNA的效果比较理想，因此我们推荐采用mRNA标记探针。mRNA的分离方法请参见本书有关章节的论述。
3．常用的同位素有[α-32P]dATP和[α-33P]dATP，我们使用下来，[α-32P]dATP效果比较好，曝光时间短，变化明显，灵敏度高。对于那些强反应的部位，可以方便地调整曝光时间，取得最佳效果。[α-33P]dATP则要求较长的曝光时间，对比反而不够灵敏。
4．当鲑精DNA浓度很高时，一旦冷却，不易溶解，因此可以变性后，趁热直接加入已加热的ExpressHyb，并混匀。
5．探针的变性是必须的。常见的问题是标记完探针，分离去未标记的同位素后，忘记将探针变性，引起实验失败。
四、中医药对广泛基因差异转录（mRNA）作用的研究
实验12 DDPCR
实验目的：同时观察大量未知基因转录变化。
中医药治疗疾病通过改变和调整哪些基因的转录，不同产地的天然中药其有效成分表达的不同是由于那些基因表达差异所造成的，中医证的变化主要有那些基因变化的基础，等等。这类问题摆在中医科学工作者面前，要求解决。但是，茫茫基因，从而着手？以往的研究主要观察一至若干个已知与某病相关的基因与疾病或证的关系，但由于基因不是单独存在的，其表达调控有赖于其他许多基因产物的调节，反过来，其产物也会对其他基因产生调节和影响。那么复杂的生命现象通过观察若干个基因往往是难以满足研究的要求的。而DDPCR技术的产生，提供了便捷的工具。
原理
DDPCR技术利用了PCR技术，实验首先提取欲观察不同细胞或组织的总RNA，然后分别加入三个锚引物，H-T11-C、H-T11-G和H-T11-A，使三个引物的11个T（胸苷）选择性地结合到mRNA的A（腺苷）尾上，在反转录酶的作用下，将所有的mRNA反转录成cDNA。再以这一含cDNA的反应液为模板，分别加入以上三个锚引物，和若干随机引物，如AAGCTTGATTGCC，AAGCTTCGACTGT等，PCR放大位于某一特定锚引物与随机引物相应序列的所有cDNA，反应体中加入α[33P]dATP或α[35S]dATP。将两个或两个以上细胞系或组织的锚引物与随机引物相一致的PCR产物相邻上样于变性测序凝胶上，电泳，使不同大小的PCR片段得到分离，然后放射自显影，曝光。如果两个或两个以上细胞系或组织mRNA相同，在相邻泳道对应的胶片上可以见到并列的显影条带，如果转录的量不同，则两条片段的深浅阔窄会有不同；如果某一基因仅仅在某一组织独特的表达，则会在对应于该组织的泳道上出现显影条带，而相邻的组织泳道上则空白。以后，可以分离这些独特表达的基因，做进一步的Northern blot鉴定，基因克隆重组，鉴定，测序，并与GenBank比较，以明确差异表达的基因为何基因，或新的基因。
实验步骤
1．分子量标准品的标记
分子量标准品经Hpa II切割的pBR 322暴露出5’端伸出的GC序列：
pBR322 1ul
5×RT Buffer 4ul
0.1 M DTT 0.5ul
α[32P]dCTP 5ul
2mM dA/T/GTP 0.5ul
AMV RT 1ul
42℃×30min.
2mM dNTP 1ul
42℃×10min.
0.5M EDTA 1ul
TE 108ul
65℃×10min.
4℃×5min.
将上清加入Sephedex G50柱，2000rpm离心3分钟。
收集离心产物约100ul（标记过的不同分子量大小的pBR 322片段）。
测cpm，1ul约在3-4×105。
2．DDPCR
（1）将RNA反转录成cDNA
取0.5ml试管，标记编号如下，然后依次加入（单位ul）：
组织1（Z1） 组织2（Z2）
试管号 1 2 3 4 5 6
水 9.4 9.4 9.4 9.4 9.4 9.4
5×RT Buffer 4 4 4 4 4 4
dNTP（250uM） 1.6 1.6 1.6 1.6 1.6 1.6
RNA（0.1ug/ul） 2 2 2 2 2 2
H-T11-M（每管2ul） （A） （C） （G） （A） （C） G）
65℃×5min，37℃×10min，加入：
MMLV反转录酶 1 1 1 1 1 1
37℃×50min，75℃×5min。
以上试管可存入4℃冰箱，或插入冰中，用于DDPCR实验。
（2）DDPCR的PCR部分
1）准备PCR混合物
水 60
10×PCR Buffer 12
dNTP（25uM） 9.6
α-[33P]dATP 1.5
Taq酶 1.2
混匀。
2）取0.5ml试管，标记编号如下，然后依次加入
随机引物1（H-AP-1）
试管号 1-1 1-2 1-3 1-4 1-5 1-6
H-AP-1 2 2 2 2 2 2
H-T11-M（每管2ul） （A） （A） （C） （C） （G） （G）
以上反转录混合物（2ul）（Z1）（Z2） （Z1） （Z2） （Z1） （Z2）
以下PCR混合物 14 14 14 14 14 14
混匀。（这里仅以1个随机引物为例，通常实验要求8-32个随机引物。）
液体石蜡 20 20 20 20 20 20
盖上盖，放入PCR仪，按以下程序运行：
94℃ 30 s.
40℃ 2 min.
72℃ 30 s.
40个循环，再：
72℃ 5 min.
（3）电泳、分析
电泳的方法、过程同测序电泳。按试管编号次序上样。每管样品取3.5ul，加上样染液2ul，盖上盖，80℃水浴2min.，插入冰中，上样。电泳、干胶、曝光等方法同测序。所不同的是在揭胶后，要求利用上样时所剩余的含有上样缓冲液的样品作为标记墨水，分别点于凝胶的上下角上。由于该上样物含有染料和同位素，放射自显影后在X光片上会出现相应黑点，与凝胶上的蓝色点对应，以便以后估计不同差异片段方位之用。电泳的反射自显影结果如以下图示。
（4）差异DNA片段的筛选与扩增
将干燥的凝胶上覆盖X光自显影胶片，置于X光读片箱上，依据实验揭胶时在凝胶角上所点的放射自显影墨水标记，对准胶片与凝胶的位置，使胶片上的条带对应凝胶上相应的位置。然后用铅笔或针依据胶片的位置标记到凝胶上有兴趣的片段位置。一般取DNA片段在300-500bp间的作进一步分析。用刀片将响应大小的凝胶连同所粘附的3MM滤纸一道切割下来。将被切割后的凝胶再重新用X光胶片曝光，检测所切割的凝胶是否为有兴趣的片段所在。如果切割正确，则第二次曝光后，该条带会消失，或部分消失。同时可以依据第二次曝光的结果，调整凝胶的切割，以确保所切割的凝胶系有兴趣基因的所在。
将此凝胶小片段，浸没于盛于1.5ml微离心管的100ul水中，室温下30分钟，然后置于沸水中煮20分钟，插入冰中。离心2分钟，吸取上清。以后取该上清2-5ul作为模版，PCR放大，PCR反应容积达40ul，电泳鉴定放大产物的分子量是否与DDPCR电泳反射自显影的分子量一致，当有足够的PCR产物（200ng-1000ng），且分子量一致，则从凝胶中回收PCR产物。该产物有两个用途，1）作为探针，做Northern blot，以鉴定是否确实在两个样品中基因转录存在差异；2）一旦存在差异，将此剩余的PCR产物作为插入片段，克隆重组入适当载体，筛选、鉴定，培养放大，质粒小量制备，用于测序和其他用途。
测序结果要求与GenBank比较，以明确基因是否为已知基因。如果是已知基因，可以进一步检索其已有报道，了解基因的功能，考虑进一步的研究；如果为新的基因，则建议建立cDNA库，并筛选获得该基因的全长cDNA，以便日后的基因功能研究。
实验结果
注意事项
1．实验之初，要求严格无菌操作，以防RNA酶污染。
2．要求无DNA污染的纯净总RNA，因此，必要时可选用GH公司Message-Clean kit及按其说明处理RNA样品，以消除可能存在的痕量DNA。也可以采用一些mRNA分离试剂盒或自备分离柱，分离mRNA。
3．为防止加样误差，建议做复管。我们曾进行过比较，DDPCR有着非常好的重复性，表现在绝大部分基因扩增的一致性和这些基因产物数量的一致性。仅在100bp分子量大小的区域可能会出现1-2个不一致的条带。因此当条件限制时，可以考虑仅做单管。
4．DDPCR实验之时，所加试剂变化多，试管多，所以要求操作规范严格，以避免出错。
5．DDPCR的工作量集中在以后的大量的Northern blot及后续工作，工作量巨大，研究者要有充分的准备。
实验13 cDNA库建立
实验14 基因全序列cDNA库筛选
实验15 RACE PCR
RACE PCR是当前比较热门的技术。RACE是Rapid Amplification of cDNA Ends的缩写，是迅速扩增cDNA末端的意思。其扩增的方法是采用PCR。因而缩写作RACE PCR。本方法的特点是可以在实验条件和经验相对比较差，而且在较短的时间内完成对一些基因片段的全部表达序列完成测定。由于方法简单，复加PCR的特点，可以同时对若干基因进行筛选，提高cDNA库筛选的效率。
因此，在中医药研究中发现一些比较小的基因片段，可以尝试该方法，筛选全基因的克隆。
原理
根据所欲筛选基因的已有片段的序列，并参照cDNA库插入基因两端载体或引物的序列，依据实验需要设计出已有片段5’或3’端的一至二对引物，以cDNA库为模版进行PCR。电泳鉴定PCR产物，取条带单一者克隆、测序。如果PCR放大的cDNA测序结果在引物所在原目的基因片段附近的序列与引物与目的基因片段一致的话，提示实验成功，且所扩增的部分系位于原目的基因片段与cDNA库载体或引物之间的序列。如果所扩增的序列总长度与Northern blot所示分子量大小一致的话，表明该基因的全部克隆已经得到。完成了cDNA库的筛选。不然要求依据新延伸的部分进一步设计引物，开展下一轮的RACE PCR，直至将全部基因扩增完毕。
实验结果
1．实验顺利的话，可以在紫外透射仪上看见清晰的呈淡橘红色的一条PCR产物，其分子量大小符合期望结果。
2．有不少实验会不顺利。主要表现有：1）有许多条带；2）没有明确的条带，前后呈拖带状，或中间似有一些条带；3）没有条带。
相应的解决的方法：1）找出其中分子量最接近的一二个条带，从凝胶中回收，作进一步的PCR，希望得到单纯的条带。如果出现类似与前面的多条带结果，表明引物的特异性不强，参照已知基因片段序列，重新设计引物。2）常见的情况是依据已知基因所设计的引物特异性不强所致。可以重新设计引物。3）建议重复PCR，如果结果同前，且对照PCR呈阳性，排除PCR方法或试剂的因素，则建议检查cDNA库的质量。当cDNA库的质量没有问题，则要求重新设计引物。并参照以下注意事项。
注意事项
1．PCR要求高质量的模版，对于那些大的片段尤其如此。RACE所使用的模版主要来源于cDNA库。cDNA库有不同的构建方法：有采用λ噬菌体的、有采用质粒的，也有采用PCR的。如果所采用的cDNA库的背景不甚清楚，建议向所获得实验室了解构建库所用载体或引物近插入片段端的序列，以便设计RACE PCR所用序列。
2．Touchdown PCR。许多情况下，Touchdown PCR可以有效改善PCR的实验结果。该方法的基本思路是：在PCR循环的早期若干个循环（5~10个），将PCR所期望的退火/延伸温度由高（典型的为提高3~10℃）逐渐降低，比如80℃、78℃、76℃、74℃、72℃等，最后达到期望的退火温度。其目的是通过由高而低的温度变化，选择两个引物的最佳退火温度，以提高引物退火的特异性。
3．其它关于PCR的注意事项请参见PCR等有关章节。
4．引物设计要求Tm至少70℃，即至少长22mers，以25~30mers为好，其中C/G的比例建议在45~60%之间。两个引物的Tm一致。
五、中医药对单基因表达产物（蛋白）作用的研究
实验16 Western blot
实验17 ELISA
实验18 免疫组织化学
实验19 单克隆抗体制备技术
六、中医药对多基因表达产物（蛋白）作用的研究
实验20 双向等电聚焦凝胶电泳
七、中医药对基因转录调控的研究
实验21 报道基因
实验22 基因功能检测
实验23 Footprint
实验24 凝胶阻滞分析
八、分子生物学的一些基本技术
实验25 重组质粒（已经实验操作）
实验26 质粒转化大肠杆菌（已经实验操作）
实验27 阳性单菌落扩增与小量DNA制备（已经实验操作）
实验28 大量质粒DNA制备
实验29 酶切重组质粒，电泳分离所插入的DNA（已经实验操作）
实验30 从凝胶中回收DNA（已经实验操作）
