上海中医药大学
《分子生物学技术在中医药研究中的应用》教案（2）
课程名称 分子生物学技术在中医药研究中的应用 总学时数 48
专业 中医基础和中医临床专业 授课教师 方肇勤、管冬元、潘志强
内容
质粒转化大肠杆菌、阳性菌落扩增、质粒小量制备
时数
12
本次课目的要求
掌握质粒转化大肠杆菌理论与技术。
掌握阳性菌落扩增，质粒小量制备理论与技术。
本次课的重点难点
质粒转化大肠杆菌技术。
涂皿鉴定技术。
阳性克隆扩增技术。
少量质粒制备技术。
本次课的应用教具
质粒转化大肠杆菌实验及有关仪器设备。
阳性菌落扩增，质粒小量制备实验及有关仪器设备。
实验26
质粒转化大肠杆菌
该实验主要有两个用途：
1．重组质粒的鉴定。当质粒的重组或其它载体重组后，通常会发生质粒的重组失败，包括质粒的自身环化。因而要求进行筛选，把重组成功的质粒找出来。在目前常用的质粒和其它载体中含有相应的抗生素抗性基因，一旦重组成功，质粒环化（包括自身环化），抗生素抗性基因表达，被转化的大肠杆菌便具备抗相应抗生素的能力，可以含该抗生素的培养基中生长传代，不然，重组失败，大肠杆菌便不能抵抗该抗生素而死亡。
2．为扩增质粒和其它载体作准备。由于大肠杆菌繁殖快，在适宜的条件下繁殖一代仅需要20~30分钟，而且常用质粒可以在大肠杆菌中达到几百个拷贝，因此，通过对转化成功的大肠杆菌培养，可以在短时内极大地扩增目的质粒。（作为分子生物学用大肠杆菌，是经过实验室改造过的工程菌。）
原 理
本实验通过CaCl2对特定的大肠杆菌处理，制备感受态的细菌。这些细菌可使每微克超螺旋质粒DNA，如一些插入目的DNA片段的重组质粒，产生5×106~2×107 个转化的菌落。当质粒与这些大肠杆菌混合后，质粒粘附在大肠杆菌的表面，在42℃的温度时，大肠杆菌出现热休克，质粒可通过大肠杆菌细胞膜上形成的空隙进入菌体内。随后，加入LB培养液，于37℃振动培养可使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性基因，提高转化效率。转化成功的大肠杆菌可以在相应抗生素培养皿中传代，形成菌落。
实验准备（略）
实验步骤
自-70℃冰箱中取出受感态大肠杆菌，插入湿冰中溶解约15分钟，轻轻混匀。吸取50ul移入1.5ml管，并立刻将细菌放回-70℃冰箱。
细菌 50 ul
DNA 5 ul
轻轻混匀，静置冰上30分钟。
于42℃水浴中热休克细菌45秒，迅速移入湿冰中，静置2分钟，加入900ul LB培养液，放入37℃恒温箱摇床，225rpm摇晃培养1小时。分别取50ul和100ul涂于两只含氨卞青霉素的LB琼脂平板皿上，待干燥后，倒置，存放于37℃的培养箱中过夜。
次日，检查各培养皿中是否出现菌落。
实验结果
转化成功，培养皿中可见散在的菌落，其中加入100ul培养液的培养皿中的菌落数约为50ul培养液培养皿的一倍。
转化失败，培养皿上无菌落，或菌落布满如苔样，后者提示可能是抗生素浓度不够或失效。
注意事项
1．本实验采用的质粒含氨卞青霉素的抗性基因，因而采用含氨卞青霉素琼脂板作选择。常用的抗性基因还有四环素、金霉素等，要求明确以准备适宜的抗生素板。
2．整个实验须严格按照无菌操作要求进行，由于琼脂板含有抗生素，所以当实验环境干净者，可以直接放在普通实验台上操作。
3．接种环或自制玻璃涂棒在煤气灯上消毒后，须冷后方可涂皿。对于那些缺少实验室经验的研究人员，我们建议采用成L型的自制玻璃涂棒，这样由于L型的下端与琼脂板的接触面大，不易将琼脂板划破。
4．培养皿在皿底作标记，写明内容、日期、操作者等，倒置放入培养箱。
5．感受态大肠杆菌的制备：
（1）在无污染的条件下，用LB扩增大肠杆菌，并离心收集。
（2）4℃条件下，用0.1 mol/L CaCl2重悬沉淀，再离心沉淀，以洗去LB培养液。
（3）4℃条件下，用0.1 mol/L CaCl2重悬沉淀，分装备用。大约50ml的LB培养液的大肠杆菌，溶于2ml的CaCl2中（每ml LB培养液大约含108成活的大肠杆菌，LB培养的菌落要求划皿约16-20小时的菌落）。
实验27 阳性单菌落扩增与小量DNA制备
目 的
1．为进一步鉴定重组质粒提供适量的质粒DNA。
排除自身环化。鉴定方法主要有：
（1）PCR法及其利弊。采用载体两端的引物进行PCR，一旦插入成功，则可以在电泳的凝胶中见到与插入片段分子量大小一致的PCR产物。
（2）Southern blot法及其利弊。将培养皿上的菌落转移到硝酸纤维素膜上，变性、固定，以插入片段为探针作Southern blot。重组成功者，在相应的菌落位置上可以见到放射自显影的黑点，培养皿上对应的菌落即为重组成功者。
（3）酶切鉴定法及其利弊。
2．提供一定数量的DNA以满足一些实验，比如1）测序、2）准备杂交用的探针。这便是本实验的两个主要目的。
有关微型真空柱和离心柱的利弊。原理与本实验近似，区别在于DNA的回收不是采用酒精沉淀，而痕量乙醇，这将妨碍一些对乙醇敏感的酶的活性，使后续的工作困难。
原 理
挑选单一菌落，培养扩增。离心收集扩增了的大肠杆菌，用碱性液裂解细菌，再经酸性溶液形成钾-SDS-蛋白质-膜复合物，离心后，此复合物与细菌染色体DNA、高分子量的RNA得到沉淀，而细菌中小分子量的质粒DNA溶于上清之中。上清经乙醇沉淀后，得到质粒DNA。
实验准备（参考教材）
Falcon 2070管/LB培养液/黄吸头照片。
含阳性菌落的培养皿4种情况照片。
实验步骤
1．第一天（通常为下午）
从琼脂平板上挑取单一菌落，接种到Falcon管内的5ml LB培养液（含氨卞青霉素）中。放入37℃恒温摇床，225-250 rpm剧烈摇晃培养过夜（O/N）。
2．第二天（通常上午开始）
（1）吸取1.5ml培养液，移入Eppendorf管中，台式离心机室温下1.4万转离心2分钟，弃上清，重复一至二次，以取得较大的沉淀。剩余培养液存入4℃冰箱。
（2）弃上清，加入100ul溶液I，盖上盖，剧烈震荡（可以将管底抵于试管架面上，划15下），充分浮悬细胞沉淀，置-20℃冰箱内5分钟。
（3）自冰箱中取出试管，加入200ul溶液II，轻轻颠倒混匀，放于冰上5分钟。
（4）加入150ul溶液III，轻轻颠倒混匀，放于冰上15分钟。
（5）放入台式离心机，室温下1.4万转离心3分钟，将上清移入一新的Eppendorf管，加入1ml 100％乙醇，混匀，放入-20℃冰箱5分钟。
（6）自冰箱中取出试管，迅速移入4℃环境下的台式离心机，1.4万转离心5分钟，小心弃去上清，倒置试管于纸巾上流尽乙醇。
（7）加入300ul TE和2ul RNase，重浮悬沉淀，放试管于37℃的水浴中温育30分钟。
（8）加入3M NaAC 34ul，混匀，加入1ml预冷的100％乙醇，-20℃存放5分钟。
（9）自冰箱中取出试管，迅速移入4℃环境下的台式离心机，1.4万转离心5分钟，弃去上清。
（10）加入1ml预冷的75％乙醇，迅速移入4℃环境下的台式离心机，1.4万转离心10分钟，弃去上清。
（11）旋转真空干燥10分钟。于冰上，溶解沉淀于20ul水中。
实验结果
通常可获得3~5ugDNA。
注意事项
1．在培养箱温度不够稳定等因素的影响下，有时隔夜后没有菌落形成，此时不必急于怀疑实验失败。建议再倒置培养一些时候，比如等到中午，或更晚一些时候，培养皿上会出现菌落。
2．挑取菌落必须是单菌落，而不是那些融合的菌落。如果培养皿上的菌落全部融合，则建议重新划板培养，直至有单菌落为止。不然一旦混有不同的菌落，可能会给以后的实验带来麻烦。
3．离心要求平衡。方法是保证离心机转子对面两侧的试管孔内有含有相等数量的离心物和试管，使两侧平衡。如果仅有一个离心管，则要求对面放置另一根相同规格的离心管，管内加入与样品数量相等的水。具体方法可以参考生化有关书籍。
4．DNA的离心通常采用1.4万转的转速，10分钟的时间，这足以满足沉淀DNA的要求。
5．沉淀DNA或RNA离心时，应把Eppendorf管盖的连接蒂指向外侧，以保证离心后沉淀位于管底靠连接蒂的一侧，当DNA或RNA量少至难以辨认时，吸取上清之际，可避免吸头触及这一区域把所需沉淀吸起。
6．室温下，DNA沉淀容易浮起，所以整个操作过程应保持在4℃环境下进行，手指持试管上部，切勿接触试管底部。
7．吸取上清时动作要轻而快，加入75％乙醇时，应将乙醇沿管壁轻轻加入，以免将沉淀冲起。
8．通常，实验对RNA污染不是有严格要求的话，比如做酶切鉴定的话，实验的7、8、9步骤可以免去。这样可以提高实验速度。我们的实验将免去这些步骤。
9．离心后大肠杆菌的裂解物会黏附于管壁和浮于离心液表面，为避免大肠杆菌的裂解物堵塞吸头，可以一面将吸头推出气体，一面插入表面含有大肠杆菌的裂解物的离心液。
