上海中医药大学：分子生物学技术在中医药研究中的应用：05DNA实验

上海中医药大学 《分子生物学技术在中医药研究中的应用》教案（4） 课程名称 分子生物学技术在中医药研究中的应用 总学时数 48 专业 中医基础和中医临床专业 授课教师 方肇勤、管冬元、潘志强 内容 组织总RNA抽提与含量测定、总RNA电泳与转移、RTPCR的反转录 时数 11  本次课目的要求  了解真核细胞RNA的特性。 掌握一步法从肝组织中提取总RNA的理论与技术。 RNA电泳与转移的理论与技术。 RTPCR的反转录的理论与技术。  本次课的重点难点 组织总RNA抽提、含量测定关键技术与常见问题。 总RNA电泳、转移关键技术与常见问题。 RTPCR的反转录关键技术与常见问题。  本次课的应用教具  组织总RNA抽提、含量测定实验及有关仪器设备。 总RNA电泳、转移部分实验及有关仪器设备。 RTPCR的反转录部分实验及有关仪器设备。   上海中医药大学 《分子生物学技术在中医药研究中的应用》教案（5） 课程名称 分子生物学技术在中医药研究中的应用 总学时数 48 专业 中医基础和中医临床专业 授课教师 方肇勤、管冬元、潘志强 内容 RT PCR的PCR部分和电泳检测 时数 3  本次课目的要求  RTPCR的PCR部分和电泳检测。  本次课的重点难点  RTPCR和电泳检测的常见问题和解决办法。  本次课的应用教具  RTPCR实验及有关仪器设备。   上海中医药大学 《分子生物学技术在中医药研究中的应用》教案（6） 课程名称 分子生物学技术在中医药研究中的应用 总学时数 48 专业 中医基础和中医临床专业 授课教师 方肇勤、管冬元、潘志强 内容 Northern Blot 时数 6  本次课目的要求  了解Northern Blot方法的原理。 掌握随机引物法标记DNA探针的原理与技术。 同位素安全技术。  本次课的重点难点  Northern Blot方法的原理。 随机引物法标记DNA探针。 同位素安全技术。 介绍Northern Blot的预杂交和杂交。 介绍放射自显影，洗膜、曝光、读片。  本次课的应用教具  Northern blot教学录象。   实验6 组织总RNA提取 实验目的 1．了解某一特定组织或细胞某一特定mRNA转录量的变化，如RT-PCR、Northern blot等。 2．了解某一特定组织或细胞全部mRNA转录量的变化，如DD-PCR、基因芯片等。 3．获得某一特定组织或细胞全部mRNA，以便建立cDNA库等。 4．获得某一特定组织或细胞全部RNA。 以上工作的前提是制备纯净且完整的RNA。 现代医学研究表明，人类的绝大多数疾病都是由若干基因表达的改变所引起的。根据生物学“中心法则”原理，基因的表达包括转录与翻译两个阶段。其中，由DNA到RNA的转录过程受到各种因素的调节，其调节水平反映出某种或某些特定的因素对相关基因表达的调节能力。已有的研究一再表明，中医药所发挥的治疗与预防作用是直接或间接调整了基因的转录而实现的。 RNA主要由rRNA（占总量的80-85％），tRNA和核内小分子RNA（占总量的10-15％）以及mRNA（占总量的1-5％）所构成。理论上认为每克组织（或108个培养细胞）可提取5-10mg RNA。 提取总RNA的方法有多种，比如： 1）本实验介绍的方法，类似于本实验的Trizol方法（今天我们会介绍这样的方法），均称为一步法，方便而快捷。缺点是RNA的获得量偏低，质量不够纯净。 2）超离心方法，可以获得丰富且质量高的RNA。缺点是实验时间比较长，要求离心过夜。 3）其它一些试剂盒，主要是利用某些特定的介质吸附RNA，驱除其它杂质，以后洗脱纯净的RNA。可以在短时间内获得纯净的RNA。但是价格比较昂贵。 原 理 本实验又称异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法。方法采用强RNA酶抑制剂异硫氰酸胍，抑制RNA酶的活性，防止RNA的降解；酚/氯仿使蛋白质变性。离心后，RNA选择性地进入无DNA和蛋白质的水相。之后通过异丙醇沉淀，75%乙醇洗涤等，便可得到较为完整与纯洁的总RNA。 实验准备（略） 实验步骤 （参照GIBCO BRC公司有Trizol试剂盒） 1．引颈处死小鼠，剖腹切取肝脏组织50mg（或106-107个细胞），加入1ml Trizol液，剪碎，快速匀浆。 2．22℃，静置5min。 3．加入氯仿0.2ml，颠倒15s。 4．22℃，静置3min。 5．离心：4℃×15000转/分×15min。 6．取上清液0.5ml。 7．加入0.5ml异丙醇，混匀。 8．22℃，静置10min。 9．离心：4℃×15000转/分×10min。 10．弃上液。 11．加入1ml 4℃ 75%乙醇。 12．离心：4℃×10000转/分×5min。 13．弃上液，真空干燥5min。 14．用高压消毒过的去离子水25ul水冰上溶解，-70℃保存。 15．紫外分光光度计测定RNA的含量： 取样本5ul加入石英比色杯内，加入蒸水0.8ml，充分混匀。与蒸水对照。读260nm、280nm两个测得值，记录。计算： OD260为1时，为40ug RNA，所以计算如下： 样本RNA含量（ug/ul）= OD260*160*40/1000 当OD值260/280<1.8时，提示有蛋白或酚的污染。 实验结果 得到比较纯净的肝组织总RNA。 据参考文献，分光光度计读数 260/280 值为 1.85±0.04。 注意事项 1．实验过程中要求创造一个无RNA酶污染的环境。主要包括两个方面的工作，其一，极力避免来源于操作者的手及实验的器皿和试剂等外源性RNA酶的污染；其二，尽力抑制组织细胞中内源性RNA酶的活力，并尽可能地去除。 2．由于RNA酶到处存在，不易失活，极易造成污染而导致RNA的降解，造成实验失败。因此建议所有用品均应严格按要求消毒，注明RNA专用。严格按无菌操作要求操作。通常用于RNA抽提与保存的塑料制品用DEPC水室温下浸泡过夜，再高压消毒。注意，DEPC处理的水和容器，必须高温灭活DEPC，以免其日后抑制其它酶的活性，导致实验失败。玻璃制品泡酸反复冲洗后，250℃干烤3小时以上。 3．去除内源性RNA酶的方法可用酚/氯仿反复抽提几次，直至中间的蛋白层基本消失。我们的经验是至少抽提3次以上。 4．实验过程中应将组织充分匀浆，一般可先将组织块用剪刀剪碎，以利于快速匀浆。 5．在酚/氯仿抽提过程中，一定要颠倒混匀充分，这样才能使蛋白质充分变性，才能充分去除蛋白质与RNA酶。为了提高RNA的纯度，该步骤可以重复若干次。 6．抽提过程中，由于异硫氰酸胍是RNA酶的强抑制剂，在整个实验过程中不会产生RNA的降解。但在加入75%乙醇洗涤时，以及RNA干燥和加水溶解时须防止RNA酶的污染。 7．在吸取上清时，切不可将上清与酚交界处的蛋白及下面的酚吸起，造成RNA的污染。因此，通常轻轻吸取上清，且留有部分上清，以免搅起紧邻着的酚。 8．若需抽提大量RNA时，以上试剂、试管可按比例放大。所获RNA建议分装，以免使用过程中反复冻融。 9．如果是培养细胞，先收集细胞，用PBS缓冲液反复漂洗3次，再加D溶液混匀细胞，后面的实验过程一致。 实验8 Northern blot 实验目的 1．定量分析某一特定基因mRNA的转录与否，以及转录的水平。 2．比较两个或两个以上不同组织某一已知基因转录的差异。 3．比较两个或两个以上不同组织某一未知基因转录的差异。 由于此方法具有稳定、可靠、假阳性少等特点，多年来一直深受广大研究者的喜爱。其结果可以同时反映某一特定基因RNA分子量的大小及其数量。在中医药实验中通常以此来判别某一中医药方法对某一已知基因转录的调控作用。例如我们的GnRH、N-ras、白蛋白研究。 通常观察某一分子的变化有两个层次，蛋白水平的和核酸水平的。两者的含量变化均与其生成、代谢有关，而两者的作用发挥还关系到其质量、修饰、环境条件等因素，这些变化采用观察蛋白与核酸的量是不能回答的，所以对Northern blot的结果要有客观的分析。 类似目的的实验主要为RTPCR。 原 理 采用变性凝胶电泳，使RNA分子由小到大排列于凝胶之中。应用虹吸原理，将RNA转移至硝酸纤维素膜，烘干，使RNA牢固地结合在硝酸纤维素膜上。与放射性标记的探针杂交，杂交后，洗去未被杂交上的探针和游离的同位素，将硝酸纤维素膜放射自显影，使胶片上出现对应于相应分子量mRNA的条带。最后，对条带进行光密度扫描，并统计分析。 实验准备（略） 实验步骤 1．RNA电泳 取10ug RNA旋转真空干燥，溶于20ul新配的样品缓冲液。置样品于65℃水浴中5分钟，迅速移入冰中冷却，再加4ul上样缓冲液，混匀。移胶至电泳槽内，注入电泳缓冲液1×MOPS，浸没凝胶，轻轻拔去疏子。接通电源，负极靠近上样孔。吸取样品24ul，注入上样孔内。开启电源，电压调至100V。电泳约2小时，至溴酚蓝移至前缘时，关闭电源。 轻轻取出凝胶，移至紫外透射反射分析仪上检查电泳结果。在凝胶一侧放把尺，拍照。 2．RNA转移至硝酸纤维素膜 取一洁净的容器，注入20×SSC，容器上缘架一水平玻璃板。取2-4层滤纸，纸宽同凝胶长，纸长足以经玻璃板两侧浸入20×SSC中。待滤纸全都湿透后，滚动移液管赶走滤纸间及其与玻璃板间的气泡。切去凝胶上样孔及以上部分，在凝胶第一上样孔处切去一小角，作为记号，把凝胶底朝上放于滤纸上，用移液管赶走凝胶与滤纸间的气泡。把硝酸纤维素膜裁成凝胶大小，对应凝胶剪去一小角，先浸湿于双蒸水中，再浸于20×SSC中，取出平放于凝胶之上，缺角处与凝胶缺角处对齐。用移液管赶走凝胶与硝酸纤维素膜间的气泡。膜上置2-4层20×SSC浸湿的滤纸，用移液管赶走滤纸与硝酸纤维素膜间的气泡。 用4张保鲜膜沿凝胶4侧盖住凝胶旁的滤纸、玻璃和容器，以防止凝胶外形成虹吸短路，以及容器内的缓冲液干燥。在胶上滤纸之上方，铺4-6厘米厚的卫生纸，上置一平玻板，玻板上压一300-500克的重物。过夜。 次日上午，取出凝胶与硝酸纤维素膜，在投射紫外灯仪上确认RNA已全部转移至硝酸纤维素膜上。把该膜夹于两张洁净的滤纸间，在80℃真空干燥箱中真空干燥两小时。 3．探针标记（此工作与膜转移于同一天进行。） 水 14 ul OLB 5 ul BSA （ 10mg/ml ） 1 ul DNA （ 30-50 ng ） 2 ul 100℃×5min, 37℃×10min, 4℃×5min α[32P]dCTP （50uCi） 2.5 ul 大肠杆菌聚合酶K片段 0.5 ul 混匀，4℃ 过夜，次日再加 大肠杆菌聚合酶K片段 0.5 ul 半小时后加入终止液 50 ul 4．离心柱分离探针 1）柱的制备 取消毒过的蓝吸头，用小玻璃珠或玻璃纤维放入吸头，堵住出口，将混匀的Sephadex G50（中号）移入吸头至满。取1.5ml Eppendorf管，剪去盖，放入10ml离心管中。将蓝吸头插入Eppendorf管，可自制一套圈或用一垫圈套于蓝吸头前部，以保证吸头尖距1.5ml管底部约1-2厘米。1600×g离心4分钟，弃去1.5ml管中的TE液，再用100ul TE液加入小柱，离心，如此反复两次平衡柱子。 2）分离 用镊子取出原1.5ml管，取一新的1.5ml管放入10ml离心管，插上平衡过的小柱。将标记的探针液，加入小柱，1600×g离心4分钟，小心取出1.5ml管，将分离的到的探针移入一标签过的1.5ml管，盖紧盖子。 5．探针变性 将含探针的1.5ml管置于沸水中5分钟变性，迅速移入冰中冷却。 6．杂交 将硝酸纤维素膜在2×SSC中浸湿，以防碎裂，然后放入杂交袋中，四周封口，剪去一角注入10毫升预杂交液，挤去气泡，封口，置此袋于40℃水浴摇床中摇晃预杂交1小时以上。取出袋，拭干，剪去一角，将变性了的探针加入，挤去气泡，封口。为防止含同位素的探针泄漏，外再封一杂交袋。置此袋于40℃水浴摇床中摇晃杂交过夜。 7．洗膜 取出袋，拭干，剪去一角，将杂交液注入50ml管中，存于4℃冰箱，以备再用。剪去袋的四周，置此袋于2×SSC/0.1％SDS液中，取出膜，晃洗于此液。移膜入新的2×SSC/0.1％SDS液中，于50℃中晃洗半小时，如此重复一次。 8．曝光 取上膜封于杂交袋中。在暗室中打开片盒，放X光胶片于增感屏上，再放上膜，盖上盒，将片盒存于-70℃冰箱中。一天后冲片，视显影强弱，缩短或延长曝光时间。 实验结果 1．电泳后，凝胶在紫外透射反射分析仪上可清楚地见到18S、28S两条明显的橘红条带，以及前后不等强度的橘红显色。 2．X光胶片上可见杂交带。杂交背景低。 3．如果比较不同样品的话，可能会见到在同一分子量的区域见有曝光深浅不等的杂交带，为了准确定量，可以借助于激光光密度计扫描分析。 注意事项 1．本方法采用同位素标记，整个实验过程中务须严格遵守同位素操作规则，注意安全。 2．实验过程中，由于RNA容易被RNA酶降解，因此，要注意无菌操作，以防RNA酶污染。 3．硝酸纤维素膜在剪取等操作过程中，不要被污染与破碎，更不能直接用手拿，而应用扁平摄子小心摄取。 4．在使用虹吸法将RNA转移至硝酸纤维素膜上时，要注意将气泡排除干净，并且用保鲜膜封好凝胶四周，以免形成短路，使转移失败，这样的事例不少见。 5．含有RNA的硝酸纤维素膜80℃干燥后，如果实验必须中断，可将硝酸纤维素膜用保鲜袋包好，保存于-20℃冰箱中。 6．如果作某一基因表达的半定量分析，可以同时或分别与内参基因探针杂交，以明确不同样本的上样量是否一致。方法是将目的基因光密度与内参基因光密度的比值作为半定量参数，进行统计分析。 7．硝酸纤维素膜洗去探针后可用于新探针的杂交。洗去探针的方法如下： 把硝酸纤维素膜置于70℃的0.1×SSC/0.1％SDS中晃洗20分钟，弃去此液，如此条件洗3次。通常一张膜可以反复杂交3次以上。 8．用于Northern blot实验中固定RNA的材料主要有硝酸纤维素膜与尼龙膜。其中硝酸纤维素膜具有成本低、杂交信号本底较低等优点；同时，也有对结合力不够强、重复使用的次数不多等缺点。而尼龙膜具结合力强、可反复使用等优点；却有成本高、杂交信号高等缺点。可以根据实验室的具体情况和经验选用。 9．用于核酸杂交的分子探针有DNA探针、cDNA探针、RNA探针以及人工合成的寡核苷酸探针等多种。Northern blot技术最合适的探针为cDNA探针。如果选用基因组DNA探针时，要尽可能使用基因的编码序列（外显子部分）作为探针，而避免使用内含子及其它非编码序列，否则探针中可能因高度重复序列存在引起非特异性杂交而出现假阳性结果。RNA探针因为操作不方便，常不被采用。寡核苷酸探针较适合于基因点突变分析，但是由于这类探针分子量小，标记后不容易纯化，往往给实验带来困难。 10．用于核酸杂交的分子探针的标记物有同位素、生物素、地高辛、荧光素等。其中，同位素是目前国内外研究中应用最多的一类探针标记物，因其具有灵敏度高、特异性强、杂交本底低等优点。而且，其曝光时间可以随意调节，以获得最佳曝光效果；实验结束，膜经洗脱后可以反复使用多次，这也是其优点。 11．探针的同位素标记方法有多种，其中缺口平移法与随机引物法最为常用。采用缺口平移法标记同位素时，使用的标记物应在脱氧核三磷酸的α-磷酸位上；所使用的DNase I 浓度一定要适当，过高则导致缺口过多，从而使探针长度过短，过低则不足以形成足量的缺口，从而使标记效率下降；反应温度一定要控制在14-16℃之间；另外，单链DNA和RNA不能采用此方法进行标记。随机引物法除能进行双链DNA标记外，也可用于单链DNA和RNA探针的标记。此法操作方便，标记活性高，因而为多数实验室所采纳。目前已经有许多种探针标记的试剂盒，可以方便的择用。 实验9 RTPCR 实验目的：观察某一特定基因转录量的变化。反转录酶聚合酶链式反应（RTPCR）以其灵敏度高，要求样品量少，实验周期短而倍受青睐。有人将RTPCR实验结果与Northern blot结果等进行比较分析，发现两种不同方法所得到的实验结果相一致。 类似的有Northern blot、原位杂交，甚至原位PCR等。 原 理 首先，以目的基因mRNA为模板，利用反转录酶的活性，合成对应的cDNA。然后在模板cDNA、目的基因特异引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依靠Taq DNA聚合酶的酶促反应，通过变性、退火、延伸的反复循环中，扩增出大量特异的目的DNA产物。最后，扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳分离，显色，并进行图象分析。 实验准备（略） 实验步骤 1．分光光度计检测RNA的浓度与纯度 各样品总RNA取5ul加入1ml水中测OD值，当OD260/OD280≥1.8时，方可使用。根据以下公式计算RNA的浓度： 样品总RNA含量（ug/ul）=OD260×稀释倍数×40/1000 2．反转录 dNTP（each 10mM） 2ul 5×buffer 4ul DTT（100mM） 1ul RNAsin（40U/ul） 1ul 随机引物（100uM） 1ul 组织总RNA 2ug 加水至 18ul 65℃ 5min，快速插入冰水中，冰上加入： RNAsin（40U/ul） 1ul M-MLV反转录酶（200U/ul）1ul 37℃ 60min，94℃ 5min（灭活逆转录酶）。-20℃保存。 3．PCR扩增 dNTP（each 0.5mM） 2ul 10×buffer 4ul MgCl2 （25mM） 4ul 上游引物（4uM） 1ul 下游引物（4uM） 1ul 反转录产物 4ul Taq DNA聚合酶（5U/ul） 0.4ul 加水至 40ul 石腊油 25ul PCR反应条件为94℃ 3min； 94℃ 40s，55℃ 1min，72℃ 2min，30个循环； 72℃ 5min→4℃ 保存。 4．电泳 取PCR产物20ul与上样缓冲液4ul混匀后，上样于1.6%的琼脂糖凝胶中，其中一孔加DNA marker，80V电压，电泳1小时。紫外透射仪下查看，并拍照。 5．图象处理 取电泳凝胶的底片，用KS400型图象分析系统进行光密度扫描，以目的基因光密度值与对应内参基因光密度值的比值作为该样品中目的基因的相对转录量。最后以目的基因的相对转录量为参数进行半定量统计分析。 实验结果 在紫外透射仪上，琼脂糖凝胶于DNA marker相应分子量的位置，可见清晰的DNA条带。 通过光密度值与对应内参基因条带的光密度值的比值，可作为该基因的相对转录量进行半定量分析。 注意事项 1．该实验使用的样品为RNA，因此在反转录过程中，要特别注意防止RNA酶的污染。为此在反转录过程中除使用RNA酶抑制剂外，所使用的枪头、试管，水等均建议用DEPC处理。 2．在做2个样品以上的实验时，不管是反转录反应还是PCR反应都应先配置试剂的共同混合物（共同混合物包括RNase Free dH2O，Buffer，dNTP，Taq酶，MgCl2等），然后分装到每个反应管中，以保证各试管不同试剂的用量一致，减少实验误差，同时还能减少试剂的损失。 3．取反转录酶等酶类时，要轻轻混匀，避免起气泡。分取之前要轻轻地离心收集到反应管底部，因其粘度高，所以要慢慢地分取。 4．为防止RNA分解，应避免多次冻融，应将RNA少量分装后保存于-70℃中。 5．最佳的PCR条件，因PCR扩增仪的不同、试管不同而有所不同，所以最好先用内参基因作PCR反应，以摸索最佳的PCR条件。 6．目的基因PCR引物的选取常常是实验成功与否的关键。一般来说，引物的长度在18-30个碱基之间，引物过短会使特异性降低；引物碱基尽可能随机分布，（G+C）含量在45-55%左右；引物内部不应形成二级结构，两个引物之间不应有互补链存在；引物3’末端的末位碱基最好选C、G而不选A、T。 7．反转录反应可选择随机引物（Random 9mers）、Oligo dT Primer和目的基因的下游引物三者之中的任一种。但它们之间有细微的差异，其中随机引物适合于链比较长或具有发夹结构的RNA，并适合所有种类的RNA（rRNA、mRNA、tRNA）；Oligo dT Primer只适合于具有poly（A）尾的mRNA，且扩增片段的位置不能离poly（A）尾太远，其反转录效率很高；目的基因的下游引物常常是在目的基因RNA的序列已知情况下使用，其特异性很强。我们是对于那些丰度低的mRNA，可以同时采用不同的欲扩增基因的下游引物反转录，这样，同一反转录产物可以同时开展若干PCR，而且由于引物相对单纯，PCR成功的可能性大。 8．由于反转录酶的工作温度较低（一般为37℃或42℃），在反转录反应之前，RNA模板处理不当，容易形成二级结构，或模板与引物之间有非特异性结合。所以，先要将RNA模板与引物在没有反转录酶的反应混合物用65℃，甚至70℃处理5至10分钟。这样可以充分破坏RNA的二级结构，且引物和RNA模板之间可以准确配对。同时65℃处理后，样品要迅速置于冰水中冷却，并在冰上将反转录酶加入反应体系中。