上海中医药大学
《分子生物学技术在中医药研究中的应用》教案（3）
课程名称 分子生物学技术在中医药研究中的应用 总学时数 48
专业 中医基础和中医临床专业 授课教师 方肇勤、管冬元、潘志强
内容
酶切质粒、电泳分离插入片断、凝胶中回收DNA片段
时数
7
本次课目的要求
了解限制性内切酶及其生物学特性。
掌握选用内切酶切割质粒的理论与技术。
电泳鉴定酶切结果的理论与技术。
从凝胶中回收DNA的理论与技术。
本次课的重点难点
限制性内切酶及其生物学特性。
限制性内切酶切割质粒及常见问题。
灌制凝胶。
电泳鉴定酶切结果与分析。
从凝胶中回收DNA。
本次课的应用教具
内切酶切割质粒实验及有关仪器设备。
电泳鉴定酶切实验及有关仪器设备。
从凝胶中回收DNA实验及有关仪器设备。
实验29
酶切重组质粒，电泳分离所插入的DNA
一．实验目的
1．鉴定。鉴定所培养的单菌落中是否含有重组质粒，或仅含有自身环化的质粒。如前所述，前者电泳后会出现大小不等的两条DNA条带，一条为线性质粒载体的DNA，另一条为插入的目的基因；后者仅有一条载体的DNA条带。比如DDPCR、RACEPCR、细胞库筛选、基因重组，等。
2．收获。通过电泳分离，使载体与插入目的基因分开，便于分别回收载体和已大量扩增了的插入目的基因。比如探针用片段。
二．本实验由2个部分组成：
1）酶切重组质粒；
2）DNA的琼脂糖凝胶电泳（纯化的方法）。
三．关于限制性内切酶
本实验选用的限制性内切酶是分子生物学中最为常用的工具酶。通常不同的限制性内切酶分别能识别一小段双链DNA序列，长度多在4-6个核苷酸，且呈双重对称的DNA序列，并将其切断。
利用这种特性，可以选择适当的酶来切割所需的DNA片段，或选择适当的酶切开载体，造成载体的粘端序列与插入DNA的粘端序列相同，以便于重组质粒。具体酶的特性、识别位点等可以参考不同公司的试剂目录（见图）。
四．琼脂糖凝胶电泳介绍
DNA的琼脂糖凝胶电泳是分子生物学实验中使用广泛的技术，该技术利用DNA分子在电场下向电场一极迁徙的特性，在pH中性的条件下，DNA分子由阴极向阳极迁徙。其间，DNA分子量大，摩擦阻力大，在凝胶的孔隙中迁徙得慢；分子量小，摩擦阻力小，迁徙快，在电泳一定时间后，大小不等得DNA分子可以得到有效得分离。同样分子量的DNA环状的较线性的迁徙速度快。分离的DNA可以方便地用溴乙锭染色，方法是1）在灌胶时直接把溴乙锭混入凝胶，或2）电泳后将凝胶浸入溴乙锭染液（我们推荐前者），染色后在紫外透射灯下可以看到橘红色的DNA条带，在一般实验室最低分辨能力（肉眼可见的）约为50-100ng。
电泳仪介绍（见图）。
电泳仪放法（见图）。
原 理
采用限制性内切酶EcoR I切开插入DNA与质粒载体，将这一反应液上样于琼脂糖凝胶，电泳，使分子量小的插入DNA前移，并与分子量大的在电泳中滞后的质粒载体DNA分开。（见图）
实验准备（略）
实验步骤
1．酶切质粒
取一洁净的1.5ml Eppendorf管，编好号，插入冰中，依次加入：
水 7ul
10×缓冲液 2ul
重组质粒 10ul
EcoR I 1ul
20ul
盖上盖，混匀，将反应物甩入管底，置37℃水浴中温育1小时。
2．灌胶
将粘胶纸粘于灌胶模槽的两端，制成灌胶模。放入梳子。将模放于水平台上。
取一烧杯，放入：
琼脂糖 1.2 g
5×TBE 20 ml
水 79 ml
100 ml
混匀，加热，至琼脂糖彻底溶解。待稍冷后，加入5ul饱和的溴乙锭，轻晃混匀，然后轻轻倒入模子。用吸头吸去表面小泡。待冷却成胶。
如果梳子大且角锐利，应该离模具底部远些，以防拔梳子时将凝胶底部拔穿。
3．上样电泳
将胶两头粘胶纸揭去，移入电泳槽，梳子一侧靠近操作者，注入1×TBE缓冲液，浸没凝胶，轻轻拔出梳子。接上电源：阳极远离上样孔，阴极靠近上样孔（DNA向阳极移动）。加3ul上样缓冲液入酶切反应液，混匀，插入冰内。加1ul上样缓冲液入3ul小量制备的重组质粒，混匀，插入冰内。上样次序：由右向左。（幻灯）。第一孔：3ul标准品梯度DNA，第二孔：3ul未经切割的重组质粒DNA，第三孔：10ul含上样缓冲液的酶切反应液。加样时，加样头尖端插入上样孔内1/3高度，轻轻将样品推入，使比重较大的样品自然沉入上样孔底。
避免刺入前后凝胶和刺穿凝胶底部（幻灯）。开启电源，电压调至100V。通常半小时后检查。
实验结果
置凝胶于长波紫外透射仪上，可见清晰的呈淡橘红色的标准品若干梯度条带、一条对应于2000-2500bp的未被切割的环状含插入片段的质粒和分别对应于250bp和3000bp的两条DNA条带。前面一条约250bp的DNA条带即放大了的插入DNA片段，后面一条为线状的质粒DNA（见图）。
注意事项
1．若所制备的质粒不能被内切酶切割，可用酚/氯仿抽提一次。
2．如前所述，一些限制性内切酶对乙醇敏感，比如EcoR I。一旦样品有痕量乙醇污染，会引起酶的失活，难以切开DNA。此时，可以将样品试管开盖，置于70℃干浴器中若干分钟，使乙醇逐渐挥发，这样十分有效。
3．常见错误
（1）溶解凝胶时，凝胶沸腾后立即外溢。因此，加热溶解凝胶时操作人员不能离开。
（2）上样的错误：前后左右和底部的凝胶被刺破，样品漏掉或电泳条带的形态不好。尤其是底部刺穿，样品遗失十分可惜。形成原因是没有经验和手法不好。介绍手法。另外，样品温度过高或上样缓冲液含量不够，比重不够，上样时样品漂浮起来，溢出孔外。
（3）电极放反。有时电极没有放反，但接入电源时被接反，结果一样，使DNA样品倒迁徙，立即移出凝胶，工作失败。因此，建议电泳前仔细检查，电泳一段时间后，观察染料确实向前移出后，方可离开。
（4）电泳时间过头。电泳时间通常视分离片段的大小而定，一般为半小时至1小时。如果电泳时间过长，目的DNA可能会迁移出凝胶外，实验失败。因此建议使用定时器或含有定时功能的电泳电源。
（5）凝胶自灌胶模具上滑落下来。由于观察电泳结果要将凝胶自灌胶模具推移至紫外透射仪上，且往往紫外透射仪安放在暗室，这样需要将凝胶自电泳槽中移出，搬迁。在此过程中容易发生凝胶自灌胶模具上滑落。避免的方法是以食指抵在灌胶模具槽的一端，槽向食指倾斜，使凝胶靠在食指上，左右由于有槽的两侧侧壁护着，保证凝胶不致滑落。
（6）凝胶滑入电泳缓冲液。当紫外透射观察后，如果不同片段的分离尚不彻底，需要进一步电泳时，要将凝胶放回电泳槽。此时，凝胶因脱离过模具，粘附不紧，容易自模具中滑入槽内的电泳缓冲液中。若未及时发现，通电后会造成DNA迁徙出凝胶。因此要求凝胶确保未移动后方可通电继续电泳。
（7）凝胶浓度不对。过浓或过稀。介绍手册上的方法：大约小片段（100bp左右）用2%左右凝胶，大片段（500bp以上）用1%左右，可以用到0.8%。
（8）电泳缓冲液比例或内容不对，偶尔也可以见到。
4．电泳后的DNA条带会在凝胶中自行扩散，因此要求电泳后立即观察，以免条带扩散。
实验30 从凝胶中回收DNA
实验目的
从凝胶中回收DNA是分子生物学中经常要做的工作。为此，已发展了许多方法，比如：
1）低熔点凝胶。
2）透析袋电泳分离。
3）凝胶挖槽电泳分离。
4）用QIAquick Gel Extraction Kits回收凝胶中的DNA。
由于后者具有效率高、所回收DNA的纯度高，且能大大缩短了实验的时间，业已形成产品。然而，我们在比较以上不同的实验方法时发现，采用S&S NA45 DEAE膜DNA的回收率最高，并具有很高的纯度，是一种值得推荐的方法，因此本实验介绍S&S NA45 DEAE膜DNA的回收方法。
原 理
本实验所用的S&S NA45 DEAE膜上有0.45um的微孔，当电泳时，DNA与RNA可被该膜所阻拦，并结合到该膜上。通常，该膜每平方厘米上可结合7ug的DNA或RNA，最大可达到20ug。用NET缓冲液洗去膜上的残留凝胶，再用高盐NET将DNA从膜上洗脱下来，通过乙醇沉淀，可得到纯净的DNA。
实验准备（略）
实验步骤
1．停止电泳，在拟分离回收的DNA之前，用单面刀片在凝胶上切一条垂直的缝，用扁头镊将NA膜缓缓插入缝中，下缘抵凝胶底部。如所分离DNA条带之后紧跟有另一DNA条带，为避免污染，可在两条DNA带之间插入另一张NA膜，起到阻隔随后DNA的作用。（幻灯）
2．继续电泳，在长波紫外透射灯下观察DNA条带全部结合到膜上，停止电泳。
3．取出膜，迅速在NET缓冲液中晃洗，以去除膜上残留的凝胶。剪去不含DNA的膜（可在长波紫外透射灯下操作）。
4．将含DNA的膜放入Eppendorf管中，移入150~250ul高盐NET缓冲液，使膜浸没于高盐NET缓冲液中，于65℃水浴中温育15分钟，间或混匀一下。
5．移出高盐NET缓冲液入一新管，以另50ul高盐NET缓冲液洗膜一次。
6．汇合两次高盐NET缓冲液，加两倍体积的无水乙醇，混匀。
7．置-20℃冰箱内存放5小时。
8．在4℃下，1.4万转离心10分钟，弃上清，迅速移入预冷的75％乙醇，在4℃下，1.4万转离心10分钟，弃上清。
9．离心真空干燥2~4分钟。
10．视所分离DNA的量，以适量的水，约10-20ul，溶解DNA于冰上。
实验结果
DNA的回收率应在90％以上。
注意事项
1．电泳时间严格控制，不可以过头，以免污染。
2．整个实验过程中，不可使膜干燥。
3．注意防止凝胶断裂，尤其在切割以后。但是，断裂了不要担心，可以仔细拼上，继续电泳。
4．高盐和低盐缓冲液千万不可以搞错。
