上海中医药大学
《分子生物学技术在中医药研究中的应用》教案（1）
课程名称 分子生物学技术在中医药研究中的应用 总学时数 48
专业 中医基础和中医临床专业 授课教师 方肇勤、管冬元、潘志强
内容
绪论、重组质粒
时数
5
本次课目的要求
了解分子生物学常用技术的沿革、任务和在中医药学中的地位和作用。
了解分子生物学的常用载体质粒及其特征。
掌握重组质粒方法。
本次课的重点难点
重点放在中医药研究中的应用，解决为何用、如何用。要求深入浅出地介绍，例举中医药研究事例说明。
分子生物学的常用载体质粒及其特征。
方法：理论部分一道进行，然后实验。
本次课的应用教具
多媒体设备。
重组质粒实验及有关仪器设备。
实验25 重组质粒
实验目的
1．放大某一基因片段，用于探针、基因功能检测、报道基因研究等。方法是：把某一DNA片段插入到相应的载体（比如质粒、噬菌体、哺乳类细胞表达载体等），给予扩增，用以标记探针、测序、cDNA库建立、基因功能检测等多种分子生物学实验。因此重组质粒就成为中医药实验研究中最为常规的实验。
通常，扩增目的DNA主要借助两类方法，即PCR技术和载体重组技术，鉴于PCR技术受到酶的性能和方法学等多方面的限制，某些DNA和超过一定长度DNA的扩增会有困难，所以载体重组技术倍受青睐。
2．DDPCR产物的克隆和测序。
3．RACE PCR产物的克隆和测序。
4．构建基因库、cDNA库，等。
常用的载体主要有质粒、λ噬菌体、粘粒载体等，哺乳类细胞表达载体是一种经改造的质粒，其中使用最广泛的是质粒。
质粒是一类双链、闭环的DNA分子，存在于细菌体中，独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。通过改造，实验室常用质粒被赋予了以下几种特性：
1．含有多克隆位点区域，可方便地插入目的DNA片段。
2．对细菌的可转移性，即在实验中，可将质粒诱导入细菌。
3．选择标记。常用的有抗生素抗性基因。这样，一旦质粒进入细菌，便可使该细菌对相应的抗生素产生抵抗能力，在含这一抗生素的琼脂平板上传代。
4．在细菌体内可获得较高的拷贝数，例如一种叫pUC的质粒，在单一细菌体中的拷贝数可达500-700个。因此，质粒已成为分子生物学中使用最为广泛的载体。
本实验介绍的质粒全长3000个碱基对（bp），在质粒的 10-110 bp段为多克隆位点区域，含有 Xba I、EcoR I、Kpn I、Sma I、Hind III、BamH I、Sac I等多种限制性内切酶的位点。
原 理
采用由EcoR I切割开的pGEM-7质粒，以及由EcoR I切割大鼠促性腺激素释放激素（rGnRH）基因启动子并分离出的-171~-432 rGnRH DNA片段，用T4噬菌体DNA连接酶将GnRH启动子DNA片段与切割开质粒DNA片段重新连接成一个环状的DNA分子，即把目的基因（GnRH启动子DNA）插入质粒DNA，实现质粒重组。
实验准备（略）
实验步骤
标记试管（内容、日期），插入碎冰，依次加入：
H2O 3 ul
50ng/ul pGEM-7 DNA 2 ul
5ng/ul -171- -432 rGnRH DNA 2 ul
盖上盖，放入45℃水浴×5min，插入冰内，开盖，再加入：
10×T4噬菌体DNA连接酶缓冲液 1ul
5mM ATP 1ul
T4噬菌体DNA连接酶 1ul
指拨混匀，用离心机将管壁溶液甩至管底，16℃ 过夜。
实验结果
得到10ul的重组质粒，可用于转化大肠杆菌。
注意事项
1．当采用其它质粒和插入片段时，可以参照本实验采用的浓度和用量。鉴于不同长度的插入片段、不同末端的载体和片段，两者的最终浓度在不同的实验室有各自的经验，浓度会有一些变化，操作时可以参考。
2．鉴于非中央空调实验室室温会随四季、昼夜波动，往往高于16℃。因此，16℃恒温水浴通常放在4℃冷库（或4℃冰箱）之中。使用前须检查水浴槽中是否有充足的水及其水温。
3．质粒选择的要求。质粒的选择主要依据实验目的决定。类似的实验不同公司往往有大量的不同型号质粒可供选择，此时通常要考虑质粒上多克隆位点中是否有与插入片段相匹配的限制性内切酶位点。我们建议购买前先征询有关经常使用类似质粒的专家的建议，采用一些使用起来顺手且性能可靠的质粒。
4．插入片段的处理。当插入片段两端缺少与质粒相匹配的末端时，可以采用相应的酶补平末端，形成钝端，使之可以与载体上的钝端相连接。由于载体钝端自身环化，使重组成功率极大地下降，因此建议采用以下质粒的5’去磷酸化处理，以减少载体的自身环化，提高重组的成功率。
5．不同末端的插入片段和载体，重组的成功率不同。当载体两端为粘端而序列互补时，或互为钝端时，载体便有可能自身环化，而自身环化是重组失败最常见的现象。因此，为提高重组的成功率，可以选择适当的酶，切开质粒和插入片段，造成一侧为钝端、一侧为粘端，或两侧粘端的序列不能互补，或两侧粘端3’、5’伸出不一致；甚至修饰插入片段，比如先补平插入片段两端，再选择插入片段一端独具的限制性内切酶处理，使之一端为平头（钝端），另一端为粘端，等等。这样的处理可以提高重组的成功率。
6．质粒的5’去磷酸化。质粒酶切两端可以采用Calf intestinal alkaline phosphatase（CIAP，小牛肠碱性磷酸酯酶）去磷酸化。方法是在酶切质粒之后，直接在反应体积中加入1个单位的CIAP，混匀，温浴5分钟。具体温度为：质粒切口5’端凹陷进去的和钝端的用50℃；质粒切口5’端突出的用37℃。
7．实验台安排。
8．酶的安全使用要求：随时插入-20℃冰盒或插入冰内，使用后立即放回-20℃冰箱。
9．实验记录的要求，材料准备与实验方法分开，右上角注明年月日。实验报告的要求，类于讲义的材料与方法，以及实验结果。要求详细准确。
10．实验的无菌概念要求。
