第三十六章
微生物检验的质量控制
质量控制（ Quality control）
? 是临床微生物学实验室为了保证检验结
果实事求是地反映客观存在而建立的操
作程序体系。在微生物学检验的过程中，
定性试验、手工操作、主观判断是主要
的工作方式，容易导致错误的结果。如
何在操作过程避免这些可变因素对结果
的影响，保证结果的准确性、可靠性和
可重复性，是质量控制的主要目标。
微生物检验的质量控制
? 室内质量控制
– 室内质量控制是由实验室内部制定并实施的，
是质量保证的核心和基础
? 室间质量控制评价
– 室间质量控制评价是由实验室外部的组织或
机构对实验室进行的质量评价
第一节 室内质量控制
一、人员与组织管理
? 必须经过广泛的基础训练教育，包括微生
物学、医学基础、临床医学知识的学习，
专业化的实验技能培训。
? 需要在实际工作中接受有经验的微生物学
家监督下的日常严格训练。
? 除了专业理论知识和操作技能外，技术人
员高度的责任心和高尚医德是特别需要的。
人员与组织管理
? 所有微生物检验的技术人员必须不断学
习
? 继续教育、短期或长期的培训班，去设
备先进、业务水平高的实验室进修。参
加学术交流会，专题讨论会，及时研读
近期专业期刊。
人员与组织管理
? 微生物实验室内应至少配有一名经严格
训练并长期从事于微生物检验的技术人
员
– 全面负责，指导、培训和考核下级和新进的
技术人员
– 与临床医师和护理人员经常性接触，传输微
生物学的新知识、新进展
– 随时了解微生物实验室的报告质量。
二、操作手册
? 实验室内必须要具备一本根据本实验室
条件而编写的标准操作程序手册。
? 间隔一段时间进行修订，删去过时淘汰
的内容，补充新的技术方法。
? 赋予手册近似于法律的地位，使之成为
全体工作人员操作时共同遵守的标准程
序。不得随意更改或简化。
操作手册一般包括以下内容：
1,各级人员的职责和权限
2,实验室安全措施
3,标本采集和处理指南
4,本室开展的检验项目及最低鉴定要求
5,培养基和试剂的配制方法
6,质量控制方案
7,常用参考数据
8,其他制度
三、培养基的质量控制
? 培养基是分离培养微生物的必需品。
? 质量直接关系到分离培养的成败。
? 对来自著名的微生物培养基生产公司的培养基，
质量比较稳定。只要按照说明书的要求贮存，
在有效期内使用可获得满意效果。
? 对自制的培养基应进行以下程序的质量控制。
原材料的挑选
? 制作培养基的原材料，成分复杂，变异较大。
应挑选各成分较稳定的试剂，各种化学试剂一
般应选用分析纯。
? 制作 MH培养基的原材料，尚有胸腺嘧啶和
Ca++, Mg++离子浓度的要求。
? 使用干粉培养基配制时，应对每一批号的干粉
培养基进行登记并进行以下的质控程序。
配制过程
? 按照实验室内操作手册中，培养基的配
制方法、配制步骤和注意事项进行。
? 作好配制记录及培养基上的标签，注明
培养基的名称，本批配制量、配方、配
制者，配制日期以及有效日期。
培养基的一般质量控制
? 外观
– 每种培养基均应标注清楚。
– 培养基应澄清，无混浊，有浓度要求的培养基如
1%马尿酸钠培养基应观察失水情况，使用时需补
充失去的水分，最好使用螺旋盖试管。
– 固体培养基应无菌落生长，不干裂。
– 一般平板培养基 2-8℃ 可贮存 1-2周。用塑料袋密封，
冷藏可使用一月，兔血平板至多用一周。培养基与
容器边缘分离则应弃去不用。
无菌试验
? 培养基制作完成灭菌后，应对每批培养基的灭
菌效果进行检测。
? 分装后进行灭菌的培养基一般随机抽取 5%-
10%的量，置 35℃ 孵箱中 24小时，证明无菌生
长为合格。
? 无菌手续分装的培养基则应将全部培养基置
35℃ 孵箱中 24小时，进行无菌试验。
? 对选择性培养基，应取部分培养基加入 10-20
倍无抑制性肉汤培养基如 TSB,稀释抑制物质，
置 35℃ 孵箱中 24小时，证明无菌生长为合格。
培养基的量
? 斜面培养基的长度不超过试管的 2/3。双
糖铁培养基，底层至少有 1cm的直立段。
? MH平板的厚度应为 4mm,即直径为
90mm的平皿，注入 25ml的培养基即可。
? 其他平板厚度一般为 3mm,在 90mm直
径的平皿中注入 15-20ml的培养基。
培养基 pH
? 配制完成的培养基其 pH应与规定的 pH相
差± 0.2之内，
? 应在室温条件下用 pH计法测定。
? 不宜用试纸或目视比色法测定。
性能试验
? 每一批新配制的、新购入的培养基，无
论是分离，选择和鉴别培养基，均应用
已知性质的标准菌株进行预测。能否达
到预期目标，合格者方可使用。
测定各种培养基性能的菌种
培养基 质控菌株 判定标准
羊血琼脂平板
生长试验
溶血反应
杆菌肽敏感（纸片法）
Optochin敏感（纸片法）
金黄色葡萄球菌 ATCC25923
大肠埃希菌 ATCC25922
肺炎链球菌 ATCC19615
化脓性链球菌 ATCC6305
化脓性链球菌 ATCC6305
B群链球菌
肺炎链球菌
涎链球菌
生长
生长
生长,α溶血
生长,β溶血
>10mm,敏感
<10mm,耐药
15~18mm,敏感
<15mm,耐药
测定各种培养基性能的菌种
巧克力色血琼脂平板
生长试验
淋病奈瑟菌
脑膜炎奈瑟菌
流感嗜血杆菌
肺炎链球菌
生长
SS平板 鼠伤寒沙门菌
伤寒沙门菌
福志贺菌
大肠埃希菌
肠球菌
生长，黑色菌落中心
生长，无色透明菌落
生长，无色透明菌落
部分抑制生长，红色
混浊菌落
部分抑制生长
测定各种培养基性能的菌种
麦康凯平板 大肠埃希菌
伤寒沙门菌
生长，红色混浊菌落
生长，无色透明菌落
中国蓝琼脂 大肠埃希菌
伤寒沙门菌
生长，蓝色菌落
生长，无色菌落
营养琼脂 金黄色葡萄球菌
福志贺菌
大量生长
大量生长
厌氧血平板 脆弱拟杆菌
产气荚膜梭菌
生长
生长,β溶血
测定各种培养基性能的菌种
弯曲菌琼脂 空肠弯曲菌
大肠埃希菌
生长
部分抑制
TCBS平板 霍乱弧菌
副溶血性弧菌
生长，黄色菌落
生长，蓝绿色菌落
沙保弱琼脂 白色念珠菌
大肠埃希菌
生长
部分或完全抑制
需氧血液增菌液 肺炎链球菌
化脓性链球菌
铜绿假单胞菌
白色念珠菌
生长
测定各种培养基性能的菌种
厌氧血液增菌液 脆弱拟杆菌 生长
碱性蛋白胨水 霍乱弧菌
大肠埃希菌
大量生长
抑制生长
各种鉴别培养基的测试菌种
培养基 阳性对照菌 阴性对照菌
赖氨酸脱羧酶 迟缓爱德华菌 费枸橼酸杆菌
鸟氨酸脱羧酶 产气肠杆菌 费枸橼酸杆菌
精氨酸双水解酶 阴沟肠杆菌 普通变形杆菌
蛋白胨水（靛基质） 大肠埃希菌 阴沟肠杆菌
各种鉴别培养基的测试菌种
葡萄糖磷酸盐蛋白胨水
MR
V-P
大肠埃希菌
阴沟肠杆菌
阴沟肠杆菌
大肠埃希菌
枸橼酸盐（西蒙氏） 产气肠杆菌 迟缓爱德华菌
苯丙氨酸脱氨酶 雷极变形杆菌 费枸橼酸杆菌
各种鉴别培养基的测试菌种
O-F试验管（葡萄糖） 铜绿假单胞菌（氧化型）
大肠埃希菌（发酵型）
洛菲不动杆菌（不利用）
硝酸盐还原 大肠埃希菌 洛菲不动杆菌
胆汁 -七叶苷 粪肠球菌 化脓性链球菌
脱氧核糖核酸琼脂 粘质沙雷菌 表皮葡萄球菌
氰化钾肉汤 产气肠杆菌 迟缓爱德华菌
各种鉴别培养基的测试菌种
丙二酸盐 产气肠杆菌 迟缓爱德华菌
尿素琼脂 雷极变形杆菌（快）
肺炎克雷白菌（慢）
大肠埃希菌
半固体琼脂动力试验 大肠埃希菌 肺炎克雷白菌
用于测试分离培养基性能的菌株
? 原则上应使用预期最难生长的细菌菌种，并且
应少量接种。
? 将接种物制成 0.5管 McFarland标准浊度管的浓
度，以 1,10稀释后，接种 0.001ml接种于培养
基上。
? 如需观察多项性能，可使用多种菌株来完成，
– 如羊血琼脂平板
? 用乙型溶血性链球菌观察透明溶血情况
? 用草绿色链球菌观察草绿色溶血情况。
选择性分离培养基
? 应能使目的菌生长，而其他菌受抑制不
生长。
? 选择性增菌培养基可使用一定比例的目
的菌与其他菌的混合菌液接种，观察目
的菌是否增殖，而其他细菌则被抑制生
长。
四,试剂、抗血清和染色液的
质量控制
试剂及染色液
? 用于测定细菌各种生物学特性的试剂，
必须注明配制或购入的日期，并须注意
有效日期及贮存条件。
? 由于试剂的稳定性不一致，有时须在测
试同时进行阳性和阴性对照试验。
抗血清的质量控制
? 抗血清的来源必须可靠。并根据制造者的使用
说明，使用与保存。应在抗血清上注明购入的
日期。
? 如为冻干制品，则还应注明配成水溶液的日期。
? 未使用的抗血清应澄清。任何混浊与颜色改变，
应视为杂菌污染，不应使用。
? 第一次使用时，应用已知菌效价和特异性进行
测定。合格者方可使用。
? 以后每次使用时须观察是否澄清透明，每月用
标准菌株进行一次测定。
各种试剂的监控菌种 试剂
试剂 阳性对照菌 阴性对照菌 监控频度
新鲜血浆（凝固酶测定） 金黄色葡萄球菌 表皮葡萄球菌 每天
3%过氧化氢 金黄色葡萄球菌 A化脓链球菌 每天
5μg/片新生霉素纸片 金黄色葡萄球菌 腐生葡萄球菌 每批
,x”因子试剂条 嗜沫嗜血杆菌 流感嗜血杆菌 每批，以后每周
,v”因子试剂条 副流感嗜血杆菌 流感嗜血杆菌 每批，以后每周
各种试剂的监控菌种 试剂
,x+v” 因子试剂条 流感嗜血杆菌
副流感嗜血杆菌
嗜沫嗜血杆菌
氧化酶试剂 铜绿假单胞菌 大肠埃希菌 每批，以后每次
靛基质试剂 大肠埃希菌 产气肠杆菌 每批，以后每天
甲基红试剂 大肠埃希菌 产气肠杆菌 每批，以后每周
V-P试剂 产气肠杆菌 大肠埃希菌 每批，以后每周
各种试剂的监控菌种 试剂
硝酸盐还原试剂 大肠埃希菌 醋酸钙不动杆菌 每批，以后每周
三氯化铁（苯丙氨酸
脱氨酶试验）
奇异变形杆菌 大肠埃希菌 每批，以后每周
三氯化铁（马鸟酸钠
水解试验）
B群链球菌 A群链球菌 每批，以后每次
10%去氧胆酸钠 肺炎链球菌 涎链球菌 每批，以后每周
各种染色液的监控菌株
染色液
染色液 阳性对照菌 阴性对照菌 监控频度
革兰染色液 金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌 每天
萋 -纳抗酸染色液 结核分支杆菌 每次
阿尔培特异染颗粒
染色液
白喉棒状杆菌 每次
密尔荚膜染色液 肺炎克雷白菌 每批
鞭毛染色液 普通变形杆菌 福志贺菌 每次
常用的抗血清和监控菌株
抗血清 监控菌株
肺炎链球菌 肺炎链球菌
链球菌
A群
B群
C群
D群
化脓性链球菌
无乳链球菌
似马链球菌
粪肠球菌
常用的抗血清和监控菌株
致病性大肠埃希菌
多价 Ⅰ
多价 Ⅱ
多价 Ⅲ
大肠埃希菌 O26,B6
大肠埃希菌 O86,B7
大肠埃希菌 O18,B21
常用的抗血清和监控菌株
志贺菌属
A群
B群
C群
D群
痢疾志贺菌
福志贺菌
鲍志贺菌
宋内志贺菌
常用的抗血清和监控菌株
沙门菌
A~F群多价
A群,O2;a
B群,O4;b;1,2
O4;i;1,2
C1群,O6,7;k;1,2
O6,7;c;1,5;vi
C2群,O6,8;d;1,2
D1群,O9;gm
O9;d;vi
E群,O3,15;eh;1,6
F群,O11;i;1,2
沙门菌属、种
甲型副伤寒沙门菌
乙型副伤寒沙门菌
鼠副伤寒沙门菌
汤卜逊沙门菌
丙型副伤寒沙门菌
弗吉尼亚沙门菌
肠炎沙门菌
伤寒沙门菌
钮因顿沙门菌
阿伯丁沙门菌
抗生素与抗生素纸片
? 用于诊断的抗生素纸片
? 用于指导临床抗菌治疗的体外药敏试
验用抗生素粉剂、原液和纸片。
抗生素与抗生素纸片贮存
? 常用的抗生素粉剂、原液和纸片容易失
效，应贮存于 — 20℃ 条件中。从制造日
起，保存一般不超过一年。
? 对日常工作需要的抗生素则可贮存于 4℃
冰箱中，效期为 1周。
体外抗菌药物敏感试验的质量
控制
? 体外抗菌药物敏感试验是临床进行抗菌
治疗的指导性实验，其结果的正确性直
接关系到抗菌治疗的成败。
? 临床上常用的方法有纸片扩散法和稀释
法
– 操作繁琐，影响因素多
纸片扩散法的质量控制
药敏实验的培养基
? 合格的 MH琼脂
? 每批新购入的 MH琼脂应使用标准菌株、
已知在控的药敏纸片和标准方法进行测
试，符合要求才可使用。
? 培养基的制作应按照规定执行，平板厚
度应为 4mm
– （ 相当于在直径为 150mm的平皿倒 60-70ml,
直径为 100mm的平皿倒 25-30ml培养基）
药敏实验的培养基
? 无 菌试验合格。
? 普通储存条件（ 2-8℃ ）下可使用 7天。
? 使用前将平板放 35℃ 孵育箱 30min,使平
板中培养基表面不残留多余的水分。
? 保存过久或脱水严重的平板，不应使用。
药敏实验的培养基
? 室温下 MH琼脂的 pH应为 7.2-7.4
? pH过低，降低氨基糖苷类和大环内酯类
抗生素的抗菌活性，增强青霉素类抗生
素的抗菌活性
? 可使用表面电极来测量已制作完成的平
板。
药敏实验的培养基
? MH培养基中的胸腺嘧啶核苷和胸腺嘧啶含量
尽可能低
? 过量的胸腺嘧啶核苷和胸腺嘧啶抵消磺胺类和
甲氧苄胺嘧啶的抗菌效应，抑菌环缩小甚至消
失，导致假耐药报告。
? 可用磺胺甲基异恶唑 /甲氧苄胺嘧啶纸片对粪肠
球菌 ATCC29212或 ATCC33186在 MH平板上
进行测试，如有清晰的抑菌环，直径大于等于
20mm,则为胸腺嘧啶核苷和胸腺嘧啶含量合
格。
药敏实验的培养基
? Mg2+和 Ca2+等离子的含量将会影响氨基糖苷类
和四环素的对铜绿假单胞菌的药敏实验结果。
含量过高，抑菌环变小，反之则扩大。
? 在 MH培养基上不能生长的菌株则应使用改良
的培养基
– 嗜血杆菌属用 HTM培养基
– 淋病奈瑟菌用 GC琼脂基础加生长添加剂
– 肺炎链球菌和其它链球菌用 5%脱纤维羊血 MH培养
基
菌悬液浓度标准
? 常规用于纸片扩散法的菌悬液浓度为
1.5× 108CFU/ml,相当于 0.5管麦氏浊度标准管
或其它光学
? 等同物（如乳胶颗粒悬液）。浊度标准管应按
规定配制，并用分光光度计在 625nm处测定吸
光度值为 0.08-0.10，为符合标准。
? 每月更换标准管。
? 使用前用旋涡混合仪剧烈振荡混匀（乳胶颗粒
悬液只能用手振摇）后使用。
含药纸片
? 纸片含药量高低是影响抑菌环大小的重
要因素
? 影响纸片含药量的因素：
– 直径、密度、吸水性、纸片本身的酸碱度、
金属离子等
– 制备方法：以冷冻干燥法制备的质量最好
纸片的保存：
? 含药纸片应冷冻保存
? 从药物制造日起在 -20℃ 最多可保存一年。
? 少量正在使用的纸片可在 2-8℃ 保存一周
? 某些不稳定的抗生素如亚胺培南、头孢克洛、
棒酸复合制剂等应冷冻保存至使用前
? 保存过程中应保持干燥，使用前应置室温平衡
1-2h,防止纸片表面产生冷凝水，用毕及时冷
藏或冷冻保存。
? 新购入的含药纸片每批用标准菌株和在控培养
基，用标准方法进行测定，符合要求方可使用。
实验过程及结果测量
? 配制好的菌悬液应在 15min内接种至 MH平板，
接种后的平板应在室温平放 3-5min,使平板表
面的多余水分被吸收。
? 在 150mm直径的平皿上最多不能超过 12张，
100mm直径的平皿不能超过 5张，以保证各纸
片之间的中心间距不少于 24mm,与平皿边缘
的距离不少于 15mm。
? 纸片一旦接触琼脂表面，则不应再移动位置。
实验过程及结果测量
? 贴好纸片的平板应在 15min内翻转，置
35℃ 孵育箱中 18-24h,平板最多 2只叠放
在一起，以保证整个平板受热均匀。
? 结果的测量应使用带表卡尺或精确度达
1/10mm的其它量具。
5,质控菌株
用于纸片扩散法的质控菌株有：
– 金黄色葡萄球菌 ATCC25923；
– 大肠埃希菌 ATCC25922、
– 大肠埃希菌 ATCC35218（ 用于 β内酰胺酶抑制剂复合制剂）；
– 铜绿假单胞菌 ATCC27853；
– 粪肠球菌 ATCC29212；
– 流感嗜血杆菌 （用于 HTM培养基） ATCC49247,49766；
– 淋病奈瑟菌 （用于 GC琼脂） ATCC49226；
– 肺炎链球菌 （用于 5%羊血 MH琼脂） ATCC49619。
6,抑菌环的质控范围
? 每一种含药纸片对标准质控菌株测定的
结果应符合规定的范围。
? 这些范围有 95%的可信区间，亦即在连
续 20个试验的结果中只能有一个结果超
出表中所列的范围，任何有一个以上的
结果超出即认为是失控，需要寻找原因
加以纠正。
表 36- 6 常用抗菌药物纸片对质
控菌株的抑菌环直径允许范围
（ mm）
质控测定次数
? 每批新的 MH琼脂和含药纸片必须用质控
菌株进行检测。
? 每天与常规标本一起测定质控菌株以监
控整个操作过程。
质控测定次数
? 只有在符合以下条件时才可减少测定次
数：
①与常规标本一起连续测定质控菌株 30日；
②每种药物与相应的每种细菌的 30个抑菌环
直径只有少于 3个结果超出规定的范围 。
质控测定次数
? 达到以上要求以后，可执行每周一次检测。
? 如发现有一个不符合的结果，应立即寻找原因，
如果发现诸如质控菌株错误、含药纸片种类错
误或标准菌株被污染等明显的错误，加以纠正
后重新测定；
? 如果不能发现原因，则须立即改为每日检测，
直至问题解决。
纸片扩散法常见的错误原因
? 偶然一次质控结果错误，一般可认为是
统计学上的随机变异。
结果确实失控时常见的原因
①质控结果记录错误；
②量取抑菌环直径时读数错误；
③标准菌株被污辱或其它改变；
④接种的菌悬液太浓或过淡；
⑤ 0.5管麦氏浊度标准管未摇匀或已过期失
效；
结果确实失控时常见的原因
⑥孵育温度或气体环境不正确；
⑦ MH培养基质量有无问题；
⑧含药纸片失效。
? 当发现有结果失控时，首先观察药敏平板，常
可发现一些问题。
? 前 4条原因经重复实验后一般都能解决。
? 如果重复实验后仍为失控，则必须恢复每日质
控，直至找到原因，问题解决为止。
（二） 稀释法
培养基
? 应使用 MH肉汤,pH为 7.2-7.4，
? 将 Ca2+浓度调节至 25mg/L,Mg2+浓度调节至
10 mg/L -12.5mg/L，
– 可用铜绿假单胞菌 ATCC27853株对庆大霉素的
MIC测定值与表中的预期值比较来确定培养基中
Ca2+,Mg2+的浓度，如果 MIC值偏低，则应添加。
? 每一批新配制的培养基均应用标准菌株进行测
定,MIC值应符合表中的范围，否则应废弃。
2,抗微生物药
? 抗微生物药的标准品或参考品可来自国家权
威鉴定机构，如中国药品生物制品鉴定所，亦
可来自生产厂商提供的标明效价的标准品或参
考品。但不能使用口服药、外用药的制成品做
药敏试验。
? 许多种抗菌药物粉剂状态比配制成溶液稳定，
但自生产日期起保存时间一般不超过一年。已
配制成溶液的抗生素应尽快使用，保存条件及
时间见表 36- 7。
表 36- 7抗菌药物溶液的保存条
件及时间
3,接种量
? 在液体培养基中不宜大量接种，因为极少
数的耐药菌生长将造成判断错误。
? 可以接受的最终测试浓度为 5× 105CFU/ml，
? 微量稀释法为 5× 104CFU/ml。
4,质控菌株
? 用于稀释法质控的理想质控参考菌株的
MIC值应落在一系列被测抗微生物药物
浓度的中间浓度附近。
? 金黄色葡萄球菌 ATCC25923对绝大多数
抗微生物药物极其敏感，因而不适宜用
于稀释法质控。
常用于稀释法质控的菌株
? 大肠埃希菌 ATCC25922,35218
? 铜绿假单胞菌 ATCC27853
? 金黄色葡萄球菌 ATCC29213,43300
? 粪肠球菌 ATCC29212,51299
? 流感嗜血杆菌 ATCC49247,49766
? 淋病奈瑟菌 ATCC49226
? 肺炎链球菌 ATCC49619
常用于稀释法质控的菌株
? 大肠埃希菌 ATCC35218用于 β内酰胺酶
抑制剂复合制剂的质控
? 金黄色葡萄球菌 ATCC29213,43300可
用于苯唑西林盐琼脂筛选试验的质控
? 粪肠球菌 ATCC29212,51299可用于氨
基糖苷类高水平药敏和万古霉素耐药筛
选的质控。
5,质控 MIC的允许范围
? 表列出了单一药物对质控菌株的 MIC范
围。这些范围与纸片扩散法一样有 95%
的可信区间，亦即在连续 20个试验的结
果中只能有一个结果超出表中所列的范
围，任何有一个以上的结果超出即认为
是失控，需要寻找原因加以纠正。
七、仪器
1、高压灭菌器和干热灭菌器
? 最好在灭菌器装上温度记录装置，以保证整个
灭菌过程中保持合适的温度。
? 为了保证灭菌的彻底，可用生物指示剂嗜热脂
肪芽胞杆菌（ Bacillas Stearothermophilus）
ATCC7953,12980的培养液或菌片（含菌量
为 5× 106cfu/片），化学指示剂如变色的指示
带等监视灭菌效果。
? 环氧乙烷消毒器应使用枯草杆菌（ Bacillus
subtilis ATCC9372） 为生物指示剂。
高压灭菌器和干热灭菌器
? 对新购买的灭菌器必须进行灭菌性能检
测。以后定期（每月一次）检测。对大
容量的灭菌器还应在不同部位放置灭菌
指示物，以全面评价灭菌性能。
2、培养箱、冰箱、水浴箱
? 应在每日工作开始和结束时记录温度。
如不符合要求，则应进行调整。
? 在这些设备上应设有报警装置，以便及
时提醒。
? 隔水式培养箱和水浴箱需要定期加水
? 冰箱需定期除霜。
3、二氧化碳培养箱
? 须每天检查箱内的 CO2含量，可用 CO2测
量仪，也可用血气分析仪测定。
? 可用淋病奈瑟菌或脑膜炎奈瑟菌等 CO2
依赖细菌进行生长试验。
4、厌氧罐或厌氧箱
? 在罐中或厌氧箱内用美蓝或刃天青作为
指示剂，无氧时均无色。
? 也可用诺维梭菌作为生物指示剂进行生
长试验。
? 罐中的催化剂钯颗粒须经常置 160℃ 1.5小
时重新活化。
5、生物安全柜
? 若须更换滤网，则须由专门技术人员进
行。
? 对紫外线必须每三个月检查一次消毒性
能。
6、细菌培养仪：
? 对每批号培养瓶须进行少量生长试验。
应保证在有效期内使用。对仪器的每个
瓶位须定期进行校正，保证应有的灵敏
度 。
7、微生物鉴定仪：
? 应及时更新系统操作软件，使之能识别
最新认识的微生物。
? 定期对仪器的探测部位进行清洁，并使
用标准模板进行校正。
? 对每批号的鉴定卡、条、板用标准菌株
进行一次测定，并核对每个反应和药敏
试验的结果。
七、标本检验过程的质量控制
? 微生物学实验室除了上述仪器、试剂、
人员等进行质量控制外，还应对标本检
验过程中涉及的每个环节进行全程质量
控制。
（一） 检验项目的申请
? 临床医师应准确把握检验项目的适用范
围、标本采集时机和结果的临床意义，
选择合理的检验项目和适当的标本送检。
并正确书写检验申清单。
标本采集和运送
? 微生物学实验室人员应向临床医师和护士讲解
各种标本的采集要求和临床意义，有义务帮助
和指导他们采集标本
? 最好行床边接种
? 标本的采集应在病程的急性期，使用抗生素之
前，选用无菌容器送检，必要时需冷藏，保温
或厌氧处理
微生物学实验室在收到标本后，核对申请单上
内容和所送标本是否相符，送检的标本是否符
合微生物学检验要求。如果不符，应注明理由
退回。
（二） 直接诊断
? 培养前的涂片非常必要和重要，可以提供很多
有用的信息。
1,对脓、脑脊液、胸腹水等无菌部位来的标
本，可直接发现病原体，尤其是形态特征典型
者。可作为初步报告给临床医师，采取医疗措
施。
2,对痰液标本的涂片检查，可确定标本是否
合格。并发现病原体。
3,对尿液标本的涂片检查，可发现病原体并
进行初步计数，为直接药敏试验奠定了基础。
4,给下一步培养基和培养方法的选择提供了
信息。
（三） 分离培养和鉴定
? 分离培养：
? 对不同标本和临床诊断，应使用多种适合于可
疑病原菌生长的培养基和培养条件，或根据标
本直接涂片选择不同的培养方法
– 如对呼吸道标本应同时接种羊血琼脂平板、巧克力
血琼脂平板、麦康复凯平板和沙保弱琼脂，并将巧
克力血平板置 5%-10%CO2 35℃ 环境中培养；
– 粪便标本应同时接种 SS平板、麦康凯平板或中国蓝
平板；
– 在血液增菌培养期间，应至少在 24h~48h盲目翻种
一次，以后有可疑细菌生长即刻翻种，以尽早发现
病原菌。
鉴定：
? 按照鉴定程序执行，尤其不可省略菌落形态观
察和涂片染色镜检,以正确引导下一步鉴定
? 氧化酶试验不应在糖类发酵选择性平板上进行，
以免假阴性结果出现。
? 在肠道选择性平板上应挑取菌落进行生化反应，
生化反应符合，血清学凝集阳性者可确认报告。
– 单凭血清学凝集或直接从肠道选择性平板上挑取菌
落进行血清学凝集，会因为交叉抗原的存在或抗原
的丢失而导致假阳性或假阴性。每次血清凝集试验
时，应用生理盐水作对照。防止粗糙型菌落造成的
假凝集。
鉴定：
? 使用自动化鉴定仪或编码方式鉴定的结
果，必须与标本的来源、临床诊断、原
始平板上菌落的形态及涂片染色结果进
行核对，以防错误的鉴定结果。
八、室内全面质量控制
? 实验室人员要对以上各项的质量控制内容进行
全面实施
? 对人员要及时进行培训和考核
? 设立实验室审核人员，对标本和结果报告进行
核对
? 在日常标本中掺入模拟标本，进行盲点试验
? 发现误差，应及时找出原因，进行改进。对于
一人工作的小型实验室，则由个人负责全面的
质量控制，自我核对，定期与参考实验室核对
并接受考评。
九、标准菌株的来源和保存
? （一）、标准菌株的来源
标准菌株是指具有典型的、稳定的生理生化特
征，并被国际社会所认可的菌株。
? 我国的卫生部药物生物制品鉴定所菌种保藏中
心，美国菌种保藏中心（ American Type
Culture Collection,ATCC） 等。
? 各级临床检验中心下发的质控菌株也可作为实
验室质控用的具有一定特征的标准菌株。
（二）、标准菌株的保存
? 一般保存法：
– 将细菌种于半固体培养基中,35℃ 培养 18-
24小时后封盖 1cm厚的无菌石蜡油，置 4℃ 保
存。适用于肠杆菌科等细菌的保存；
– 对链球菌、脑膜炎奈瑟菌等苛养菌在血平板
上或血清培养基中移种培养。
– 由于细菌经多次移种，性状可能发生变异。
– 简单、适用于大多数的实验室
表 36- 8 常见细菌的一般保存法
及保存时间
2,冷冻干燥法,
? 是最可靠的菌种保藏方法，它具有不改
变菌种性状和保存时间长等优点，但需
有专门的冷冻干燥设备 。
第二节 室间质量控制评价
一,机构
? 各级临床检验中心和参考实验室
? 负责定期或不定期地通过各项熟练程度考核和
盲点试验检查各实验室的工作质量和水平，进
行总结和评估，针对各个薄弱环节，举办各种
培训班。
? 通过定期或不定期地举办各种学习班，提高各
级技术人员的技术水平，学习新的知识。并提
供或督促有关部门提供合格的标准化的试剂、
抗血清、培养基等实验必需品。
各级实验室可同时接受国内、国际多个质量控
制机构或参考实验室的质量评价。
二、室间质量控制的一般性检
查项目
? 各级临床检验中心对各参加的实验室进行常规
性的检查，包括有否制定各种制度及其执行情
况。
1,培养基和试剂的配制记录、培养基的保存
方法、灭菌质量、有效期。
2,室内全面质量控制的建立，室内工作人员
的熟练程度的考核和盲点试验的进行情况，细
菌检验的操作手册及操作的规范性。
3,设备的操作卡，操作人员的操作水平，设
备的使用、保养、维修记录。
质控管理机构
模拟标本或菌种
实验室
在规定时间完成鉴定
评价分析
总结提高
三、熟练程度的考核
四、盲点试验
? 为了准确反映受控实验室日常处理临床标本的
实际水平及能力，较好的方法是进行未知标本
的盲点质量控制（ quality control blind
unknown）。 由质控管理机构将模拟标本混入
临床普通标本，送入实验室进行常规测定。实
验室主管及实验操作者不知道哪一个标本是来
自质控机构的。实验结果由质控管理机构负责
收回，进行评价。
五、质控结果的分析与评价
? 质控管理机构对每次质控结果进行统计
分析，将每一实验室的结果与标准进行
比较。
? 根据参加的规模和鉴定的正确数，计算
鉴定正确率及所有参加实验室的平均分，
以及每个实验室的得分。
质控结果的分析与评价
? 美国以百分制计算
? 世界卫生组织对每一个正确的鉴定得 3分；部
分正确但可以接受的鉴定结果得 2分；鉴定结
果部分错误得 1分；完全错误的 0分。
? 英国国家微生物学质量控制实验室的计算公式
为
标本鉴定正确数 — 平均实验室正确数
得分 =
实验室平均正确数的标准差
高于平均值得正分。低于平均值得负分，如果
得分低于 -1.96则表示实验室水平较差，需要进
行学习和帮助。
微生物检验的质量控制
质量控制（ Quality control）
? 是临床微生物学实验室为了保证检验结
果实事求是地反映客观存在而建立的操
作程序体系。在微生物学检验的过程中，
定性试验、手工操作、主观判断是主要
的工作方式，容易导致错误的结果。如
何在操作过程避免这些可变因素对结果
的影响，保证结果的准确性、可靠性和
可重复性，是质量控制的主要目标。
微生物检验的质量控制
? 室内质量控制
– 室内质量控制是由实验室内部制定并实施的，
是质量保证的核心和基础
? 室间质量控制评价
– 室间质量控制评价是由实验室外部的组织或
机构对实验室进行的质量评价
第一节 室内质量控制
一、人员与组织管理
? 必须经过广泛的基础训练教育，包括微生
物学、医学基础、临床医学知识的学习，
专业化的实验技能培训。
? 需要在实际工作中接受有经验的微生物学
家监督下的日常严格训练。
? 除了专业理论知识和操作技能外，技术人
员高度的责任心和高尚医德是特别需要的。
人员与组织管理
? 所有微生物检验的技术人员必须不断学
习
? 继续教育、短期或长期的培训班，去设
备先进、业务水平高的实验室进修。参
加学术交流会，专题讨论会，及时研读
近期专业期刊。
人员与组织管理
? 微生物实验室内应至少配有一名经严格
训练并长期从事于微生物检验的技术人
员
– 全面负责，指导、培训和考核下级和新进的
技术人员
– 与临床医师和护理人员经常性接触，传输微
生物学的新知识、新进展
– 随时了解微生物实验室的报告质量。
二、操作手册
? 实验室内必须要具备一本根据本实验室
条件而编写的标准操作程序手册。
? 间隔一段时间进行修订，删去过时淘汰
的内容，补充新的技术方法。
? 赋予手册近似于法律的地位，使之成为
全体工作人员操作时共同遵守的标准程
序。不得随意更改或简化。
操作手册一般包括以下内容：
1,各级人员的职责和权限
2,实验室安全措施
3,标本采集和处理指南
4,本室开展的检验项目及最低鉴定要求
5,培养基和试剂的配制方法
6,质量控制方案
7,常用参考数据
8,其他制度
三、培养基的质量控制
? 培养基是分离培养微生物的必需品。
? 质量直接关系到分离培养的成败。
? 对来自著名的微生物培养基生产公司的培养基，
质量比较稳定。只要按照说明书的要求贮存，
在有效期内使用可获得满意效果。
? 对自制的培养基应进行以下程序的质量控制。
原材料的挑选
? 制作培养基的原材料，成分复杂，变异较大。
应挑选各成分较稳定的试剂，各种化学试剂一
般应选用分析纯。
? 制作 MH培养基的原材料，尚有胸腺嘧啶和
Ca++, Mg++离子浓度的要求。
? 使用干粉培养基配制时，应对每一批号的干粉
培养基进行登记并进行以下的质控程序。
配制过程
? 按照实验室内操作手册中，培养基的配
制方法、配制步骤和注意事项进行。
? 作好配制记录及培养基上的标签，注明
培养基的名称，本批配制量、配方、配
制者，配制日期以及有效日期。
培养基的一般质量控制
? 外观
– 每种培养基均应标注清楚。
– 培养基应澄清，无混浊，有浓度要求的培养基如
1%马尿酸钠培养基应观察失水情况，使用时需补
充失去的水分，最好使用螺旋盖试管。
– 固体培养基应无菌落生长，不干裂。
– 一般平板培养基 2-8℃ 可贮存 1-2周。用塑料袋密封，
冷藏可使用一月，兔血平板至多用一周。培养基与
容器边缘分离则应弃去不用。
无菌试验
? 培养基制作完成灭菌后，应对每批培养基的灭
菌效果进行检测。
? 分装后进行灭菌的培养基一般随机抽取 5%-
10%的量，置 35℃ 孵箱中 24小时，证明无菌生
长为合格。
? 无菌手续分装的培养基则应将全部培养基置
35℃ 孵箱中 24小时，进行无菌试验。
? 对选择性培养基，应取部分培养基加入 10-20
倍无抑制性肉汤培养基如 TSB,稀释抑制物质，
置 35℃ 孵箱中 24小时，证明无菌生长为合格。
培养基的量
? 斜面培养基的长度不超过试管的 2/3。双
糖铁培养基，底层至少有 1cm的直立段。
? MH平板的厚度应为 4mm,即直径为
90mm的平皿，注入 25ml的培养基即可。
? 其他平板厚度一般为 3mm,在 90mm直
径的平皿中注入 15-20ml的培养基。
培养基 pH
? 配制完成的培养基其 pH应与规定的 pH相
差± 0.2之内，
? 应在室温条件下用 pH计法测定。
? 不宜用试纸或目视比色法测定。
性能试验
? 每一批新配制的、新购入的培养基，无
论是分离，选择和鉴别培养基，均应用
已知性质的标准菌株进行预测。能否达
到预期目标，合格者方可使用。
测定各种培养基性能的菌种
培养基 质控菌株 判定标准
羊血琼脂平板
生长试验
溶血反应
杆菌肽敏感（纸片法）
Optochin敏感（纸片法）
金黄色葡萄球菌 ATCC25923
大肠埃希菌 ATCC25922
肺炎链球菌 ATCC19615
化脓性链球菌 ATCC6305
化脓性链球菌 ATCC6305
B群链球菌
肺炎链球菌
涎链球菌
生长
生长
生长,α溶血
生长,β溶血
>10mm,敏感
<10mm,耐药
15~18mm,敏感
<15mm,耐药
测定各种培养基性能的菌种
巧克力色血琼脂平板
生长试验
淋病奈瑟菌
脑膜炎奈瑟菌
流感嗜血杆菌
肺炎链球菌
生长
SS平板 鼠伤寒沙门菌
伤寒沙门菌
福志贺菌
大肠埃希菌
肠球菌
生长，黑色菌落中心
生长，无色透明菌落
生长，无色透明菌落
部分抑制生长，红色
混浊菌落
部分抑制生长
测定各种培养基性能的菌种
麦康凯平板 大肠埃希菌
伤寒沙门菌
生长，红色混浊菌落
生长，无色透明菌落
中国蓝琼脂 大肠埃希菌
伤寒沙门菌
生长，蓝色菌落
生长，无色菌落
营养琼脂 金黄色葡萄球菌
福志贺菌
大量生长
大量生长
厌氧血平板 脆弱拟杆菌
产气荚膜梭菌
生长
生长,β溶血
测定各种培养基性能的菌种
弯曲菌琼脂 空肠弯曲菌
大肠埃希菌
生长
部分抑制
TCBS平板 霍乱弧菌
副溶血性弧菌
生长，黄色菌落
生长，蓝绿色菌落
沙保弱琼脂 白色念珠菌
大肠埃希菌
生长
部分或完全抑制
需氧血液增菌液 肺炎链球菌
化脓性链球菌
铜绿假单胞菌
白色念珠菌
生长
测定各种培养基性能的菌种
厌氧血液增菌液 脆弱拟杆菌 生长
碱性蛋白胨水 霍乱弧菌
大肠埃希菌
大量生长
抑制生长
各种鉴别培养基的测试菌种
培养基 阳性对照菌 阴性对照菌
赖氨酸脱羧酶 迟缓爱德华菌 费枸橼酸杆菌
鸟氨酸脱羧酶 产气肠杆菌 费枸橼酸杆菌
精氨酸双水解酶 阴沟肠杆菌 普通变形杆菌
蛋白胨水（靛基质） 大肠埃希菌 阴沟肠杆菌
各种鉴别培养基的测试菌种
葡萄糖磷酸盐蛋白胨水
MR
V-P
大肠埃希菌
阴沟肠杆菌
阴沟肠杆菌
大肠埃希菌
枸橼酸盐（西蒙氏） 产气肠杆菌 迟缓爱德华菌
苯丙氨酸脱氨酶 雷极变形杆菌 费枸橼酸杆菌
各种鉴别培养基的测试菌种
O-F试验管（葡萄糖） 铜绿假单胞菌（氧化型）
大肠埃希菌（发酵型）
洛菲不动杆菌（不利用）
硝酸盐还原 大肠埃希菌 洛菲不动杆菌
胆汁 -七叶苷 粪肠球菌 化脓性链球菌
脱氧核糖核酸琼脂 粘质沙雷菌 表皮葡萄球菌
氰化钾肉汤 产气肠杆菌 迟缓爱德华菌
各种鉴别培养基的测试菌种
丙二酸盐 产气肠杆菌 迟缓爱德华菌
尿素琼脂 雷极变形杆菌（快）
肺炎克雷白菌（慢）
大肠埃希菌
半固体琼脂动力试验 大肠埃希菌 肺炎克雷白菌
用于测试分离培养基性能的菌株
? 原则上应使用预期最难生长的细菌菌种，并且
应少量接种。
? 将接种物制成 0.5管 McFarland标准浊度管的浓
度，以 1,10稀释后，接种 0.001ml接种于培养
基上。
? 如需观察多项性能，可使用多种菌株来完成，
– 如羊血琼脂平板
? 用乙型溶血性链球菌观察透明溶血情况
? 用草绿色链球菌观察草绿色溶血情况。
选择性分离培养基
? 应能使目的菌生长，而其他菌受抑制不
生长。
? 选择性增菌培养基可使用一定比例的目
的菌与其他菌的混合菌液接种，观察目
的菌是否增殖，而其他细菌则被抑制生
长。
四,试剂、抗血清和染色液的
质量控制
试剂及染色液
? 用于测定细菌各种生物学特性的试剂，
必须注明配制或购入的日期，并须注意
有效日期及贮存条件。
? 由于试剂的稳定性不一致，有时须在测
试同时进行阳性和阴性对照试验。
抗血清的质量控制
? 抗血清的来源必须可靠。并根据制造者的使用
说明，使用与保存。应在抗血清上注明购入的
日期。
? 如为冻干制品，则还应注明配成水溶液的日期。
? 未使用的抗血清应澄清。任何混浊与颜色改变，
应视为杂菌污染，不应使用。
? 第一次使用时，应用已知菌效价和特异性进行
测定。合格者方可使用。
? 以后每次使用时须观察是否澄清透明，每月用
标准菌株进行一次测定。
各种试剂的监控菌种 试剂
试剂 阳性对照菌 阴性对照菌 监控频度
新鲜血浆（凝固酶测定） 金黄色葡萄球菌 表皮葡萄球菌 每天
3%过氧化氢 金黄色葡萄球菌 A化脓链球菌 每天
5μg/片新生霉素纸片 金黄色葡萄球菌 腐生葡萄球菌 每批
,x”因子试剂条 嗜沫嗜血杆菌 流感嗜血杆菌 每批，以后每周
,v”因子试剂条 副流感嗜血杆菌 流感嗜血杆菌 每批，以后每周
各种试剂的监控菌种 试剂
,x+v” 因子试剂条 流感嗜血杆菌
副流感嗜血杆菌
嗜沫嗜血杆菌
氧化酶试剂 铜绿假单胞菌 大肠埃希菌 每批，以后每次
靛基质试剂 大肠埃希菌 产气肠杆菌 每批，以后每天
甲基红试剂 大肠埃希菌 产气肠杆菌 每批，以后每周
V-P试剂 产气肠杆菌 大肠埃希菌 每批，以后每周
各种试剂的监控菌种 试剂
硝酸盐还原试剂 大肠埃希菌 醋酸钙不动杆菌 每批，以后每周
三氯化铁（苯丙氨酸
脱氨酶试验）
奇异变形杆菌 大肠埃希菌 每批，以后每周
三氯化铁（马鸟酸钠
水解试验）
B群链球菌 A群链球菌 每批，以后每次
10%去氧胆酸钠 肺炎链球菌 涎链球菌 每批，以后每周
各种染色液的监控菌株
染色液
染色液 阳性对照菌 阴性对照菌 监控频度
革兰染色液 金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌 每天
萋 -纳抗酸染色液 结核分支杆菌 每次
阿尔培特异染颗粒
染色液
白喉棒状杆菌 每次
密尔荚膜染色液 肺炎克雷白菌 每批
鞭毛染色液 普通变形杆菌 福志贺菌 每次
常用的抗血清和监控菌株
抗血清 监控菌株
肺炎链球菌 肺炎链球菌
链球菌
A群
B群
C群
D群
化脓性链球菌
无乳链球菌
似马链球菌
粪肠球菌
常用的抗血清和监控菌株
致病性大肠埃希菌
多价 Ⅰ
多价 Ⅱ
多价 Ⅲ
大肠埃希菌 O26,B6
大肠埃希菌 O86,B7
大肠埃希菌 O18,B21
常用的抗血清和监控菌株
志贺菌属
A群
B群
C群
D群
痢疾志贺菌
福志贺菌
鲍志贺菌
宋内志贺菌
常用的抗血清和监控菌株
沙门菌
A~F群多价
A群,O2;a
B群,O4;b;1,2
O4;i;1,2
C1群,O6,7;k;1,2
O6,7;c;1,5;vi
C2群,O6,8;d;1,2
D1群,O9;gm
O9;d;vi
E群,O3,15;eh;1,6
F群,O11;i;1,2
沙门菌属、种
甲型副伤寒沙门菌
乙型副伤寒沙门菌
鼠副伤寒沙门菌
汤卜逊沙门菌
丙型副伤寒沙门菌
弗吉尼亚沙门菌
肠炎沙门菌
伤寒沙门菌
钮因顿沙门菌
阿伯丁沙门菌
抗生素与抗生素纸片
? 用于诊断的抗生素纸片
? 用于指导临床抗菌治疗的体外药敏试
验用抗生素粉剂、原液和纸片。
抗生素与抗生素纸片贮存
? 常用的抗生素粉剂、原液和纸片容易失
效，应贮存于 — 20℃ 条件中。从制造日
起，保存一般不超过一年。
? 对日常工作需要的抗生素则可贮存于 4℃
冰箱中，效期为 1周。
体外抗菌药物敏感试验的质量
控制
? 体外抗菌药物敏感试验是临床进行抗菌
治疗的指导性实验，其结果的正确性直
接关系到抗菌治疗的成败。
? 临床上常用的方法有纸片扩散法和稀释
法
– 操作繁琐，影响因素多
纸片扩散法的质量控制
药敏实验的培养基
? 合格的 MH琼脂
? 每批新购入的 MH琼脂应使用标准菌株、
已知在控的药敏纸片和标准方法进行测
试，符合要求才可使用。
? 培养基的制作应按照规定执行，平板厚
度应为 4mm
– （ 相当于在直径为 150mm的平皿倒 60-70ml,
直径为 100mm的平皿倒 25-30ml培养基）
药敏实验的培养基
? 无 菌试验合格。
? 普通储存条件（ 2-8℃ ）下可使用 7天。
? 使用前将平板放 35℃ 孵育箱 30min,使平
板中培养基表面不残留多余的水分。
? 保存过久或脱水严重的平板，不应使用。
药敏实验的培养基
? 室温下 MH琼脂的 pH应为 7.2-7.4
? pH过低，降低氨基糖苷类和大环内酯类
抗生素的抗菌活性，增强青霉素类抗生
素的抗菌活性
? 可使用表面电极来测量已制作完成的平
板。
药敏实验的培养基
? MH培养基中的胸腺嘧啶核苷和胸腺嘧啶含量
尽可能低
? 过量的胸腺嘧啶核苷和胸腺嘧啶抵消磺胺类和
甲氧苄胺嘧啶的抗菌效应，抑菌环缩小甚至消
失，导致假耐药报告。
? 可用磺胺甲基异恶唑 /甲氧苄胺嘧啶纸片对粪肠
球菌 ATCC29212或 ATCC33186在 MH平板上
进行测试，如有清晰的抑菌环，直径大于等于
20mm,则为胸腺嘧啶核苷和胸腺嘧啶含量合
格。
药敏实验的培养基
? Mg2+和 Ca2+等离子的含量将会影响氨基糖苷类
和四环素的对铜绿假单胞菌的药敏实验结果。
含量过高，抑菌环变小，反之则扩大。
? 在 MH培养基上不能生长的菌株则应使用改良
的培养基
– 嗜血杆菌属用 HTM培养基
– 淋病奈瑟菌用 GC琼脂基础加生长添加剂
– 肺炎链球菌和其它链球菌用 5%脱纤维羊血 MH培养
基
菌悬液浓度标准
? 常规用于纸片扩散法的菌悬液浓度为
1.5× 108CFU/ml,相当于 0.5管麦氏浊度标准管
或其它光学
? 等同物（如乳胶颗粒悬液）。浊度标准管应按
规定配制，并用分光光度计在 625nm处测定吸
光度值为 0.08-0.10，为符合标准。
? 每月更换标准管。
? 使用前用旋涡混合仪剧烈振荡混匀（乳胶颗粒
悬液只能用手振摇）后使用。
含药纸片
? 纸片含药量高低是影响抑菌环大小的重
要因素
? 影响纸片含药量的因素：
– 直径、密度、吸水性、纸片本身的酸碱度、
金属离子等
– 制备方法：以冷冻干燥法制备的质量最好
纸片的保存：
? 含药纸片应冷冻保存
? 从药物制造日起在 -20℃ 最多可保存一年。
? 少量正在使用的纸片可在 2-8℃ 保存一周
? 某些不稳定的抗生素如亚胺培南、头孢克洛、
棒酸复合制剂等应冷冻保存至使用前
? 保存过程中应保持干燥，使用前应置室温平衡
1-2h,防止纸片表面产生冷凝水，用毕及时冷
藏或冷冻保存。
? 新购入的含药纸片每批用标准菌株和在控培养
基，用标准方法进行测定，符合要求方可使用。
实验过程及结果测量
? 配制好的菌悬液应在 15min内接种至 MH平板，
接种后的平板应在室温平放 3-5min,使平板表
面的多余水分被吸收。
? 在 150mm直径的平皿上最多不能超过 12张，
100mm直径的平皿不能超过 5张，以保证各纸
片之间的中心间距不少于 24mm,与平皿边缘
的距离不少于 15mm。
? 纸片一旦接触琼脂表面，则不应再移动位置。
实验过程及结果测量
? 贴好纸片的平板应在 15min内翻转，置
35℃ 孵育箱中 18-24h,平板最多 2只叠放
在一起，以保证整个平板受热均匀。
? 结果的测量应使用带表卡尺或精确度达
1/10mm的其它量具。
5,质控菌株
用于纸片扩散法的质控菌株有：
– 金黄色葡萄球菌 ATCC25923；
– 大肠埃希菌 ATCC25922、
– 大肠埃希菌 ATCC35218（ 用于 β内酰胺酶抑制剂复合制剂）；
– 铜绿假单胞菌 ATCC27853；
– 粪肠球菌 ATCC29212；
– 流感嗜血杆菌 （用于 HTM培养基） ATCC49247,49766；
– 淋病奈瑟菌 （用于 GC琼脂） ATCC49226；
– 肺炎链球菌 （用于 5%羊血 MH琼脂） ATCC49619。
6,抑菌环的质控范围
? 每一种含药纸片对标准质控菌株测定的
结果应符合规定的范围。
? 这些范围有 95%的可信区间，亦即在连
续 20个试验的结果中只能有一个结果超
出表中所列的范围，任何有一个以上的
结果超出即认为是失控，需要寻找原因
加以纠正。
表 36- 6 常用抗菌药物纸片对质
控菌株的抑菌环直径允许范围
（ mm）
质控测定次数
? 每批新的 MH琼脂和含药纸片必须用质控
菌株进行检测。
? 每天与常规标本一起测定质控菌株以监
控整个操作过程。
质控测定次数
? 只有在符合以下条件时才可减少测定次
数：
①与常规标本一起连续测定质控菌株 30日；
②每种药物与相应的每种细菌的 30个抑菌环
直径只有少于 3个结果超出规定的范围 。
质控测定次数
? 达到以上要求以后，可执行每周一次检测。
? 如发现有一个不符合的结果，应立即寻找原因，
如果发现诸如质控菌株错误、含药纸片种类错
误或标准菌株被污染等明显的错误，加以纠正
后重新测定；
? 如果不能发现原因，则须立即改为每日检测，
直至问题解决。
纸片扩散法常见的错误原因
? 偶然一次质控结果错误，一般可认为是
统计学上的随机变异。
结果确实失控时常见的原因
①质控结果记录错误；
②量取抑菌环直径时读数错误；
③标准菌株被污辱或其它改变；
④接种的菌悬液太浓或过淡；
⑤ 0.5管麦氏浊度标准管未摇匀或已过期失
效；
结果确实失控时常见的原因
⑥孵育温度或气体环境不正确；
⑦ MH培养基质量有无问题；
⑧含药纸片失效。
? 当发现有结果失控时，首先观察药敏平板，常
可发现一些问题。
? 前 4条原因经重复实验后一般都能解决。
? 如果重复实验后仍为失控，则必须恢复每日质
控，直至找到原因，问题解决为止。
（二） 稀释法
培养基
? 应使用 MH肉汤,pH为 7.2-7.4，
? 将 Ca2+浓度调节至 25mg/L,Mg2+浓度调节至
10 mg/L -12.5mg/L，
– 可用铜绿假单胞菌 ATCC27853株对庆大霉素的
MIC测定值与表中的预期值比较来确定培养基中
Ca2+,Mg2+的浓度，如果 MIC值偏低，则应添加。
? 每一批新配制的培养基均应用标准菌株进行测
定,MIC值应符合表中的范围，否则应废弃。
2,抗微生物药
? 抗微生物药的标准品或参考品可来自国家权
威鉴定机构，如中国药品生物制品鉴定所，亦
可来自生产厂商提供的标明效价的标准品或参
考品。但不能使用口服药、外用药的制成品做
药敏试验。
? 许多种抗菌药物粉剂状态比配制成溶液稳定，
但自生产日期起保存时间一般不超过一年。已
配制成溶液的抗生素应尽快使用，保存条件及
时间见表 36- 7。
表 36- 7抗菌药物溶液的保存条
件及时间
3,接种量
? 在液体培养基中不宜大量接种，因为极少
数的耐药菌生长将造成判断错误。
? 可以接受的最终测试浓度为 5× 105CFU/ml，
? 微量稀释法为 5× 104CFU/ml。
4,质控菌株
? 用于稀释法质控的理想质控参考菌株的
MIC值应落在一系列被测抗微生物药物
浓度的中间浓度附近。
? 金黄色葡萄球菌 ATCC25923对绝大多数
抗微生物药物极其敏感，因而不适宜用
于稀释法质控。
常用于稀释法质控的菌株
? 大肠埃希菌 ATCC25922,35218
? 铜绿假单胞菌 ATCC27853
? 金黄色葡萄球菌 ATCC29213,43300
? 粪肠球菌 ATCC29212,51299
? 流感嗜血杆菌 ATCC49247,49766
? 淋病奈瑟菌 ATCC49226
? 肺炎链球菌 ATCC49619
常用于稀释法质控的菌株
? 大肠埃希菌 ATCC35218用于 β内酰胺酶
抑制剂复合制剂的质控
? 金黄色葡萄球菌 ATCC29213,43300可
用于苯唑西林盐琼脂筛选试验的质控
? 粪肠球菌 ATCC29212,51299可用于氨
基糖苷类高水平药敏和万古霉素耐药筛
选的质控。
5,质控 MIC的允许范围
? 表列出了单一药物对质控菌株的 MIC范
围。这些范围与纸片扩散法一样有 95%
的可信区间，亦即在连续 20个试验的结
果中只能有一个结果超出表中所列的范
围，任何有一个以上的结果超出即认为
是失控，需要寻找原因加以纠正。
七、仪器
1、高压灭菌器和干热灭菌器
? 最好在灭菌器装上温度记录装置，以保证整个
灭菌过程中保持合适的温度。
? 为了保证灭菌的彻底，可用生物指示剂嗜热脂
肪芽胞杆菌（ Bacillas Stearothermophilus）
ATCC7953,12980的培养液或菌片（含菌量
为 5× 106cfu/片），化学指示剂如变色的指示
带等监视灭菌效果。
? 环氧乙烷消毒器应使用枯草杆菌（ Bacillus
subtilis ATCC9372） 为生物指示剂。
高压灭菌器和干热灭菌器
? 对新购买的灭菌器必须进行灭菌性能检
测。以后定期（每月一次）检测。对大
容量的灭菌器还应在不同部位放置灭菌
指示物，以全面评价灭菌性能。
2、培养箱、冰箱、水浴箱
? 应在每日工作开始和结束时记录温度。
如不符合要求，则应进行调整。
? 在这些设备上应设有报警装置，以便及
时提醒。
? 隔水式培养箱和水浴箱需要定期加水
? 冰箱需定期除霜。
3、二氧化碳培养箱
? 须每天检查箱内的 CO2含量，可用 CO2测
量仪，也可用血气分析仪测定。
? 可用淋病奈瑟菌或脑膜炎奈瑟菌等 CO2
依赖细菌进行生长试验。
4、厌氧罐或厌氧箱
? 在罐中或厌氧箱内用美蓝或刃天青作为
指示剂，无氧时均无色。
? 也可用诺维梭菌作为生物指示剂进行生
长试验。
? 罐中的催化剂钯颗粒须经常置 160℃ 1.5小
时重新活化。
5、生物安全柜
? 若须更换滤网，则须由专门技术人员进
行。
? 对紫外线必须每三个月检查一次消毒性
能。
6、细菌培养仪：
? 对每批号培养瓶须进行少量生长试验。
应保证在有效期内使用。对仪器的每个
瓶位须定期进行校正，保证应有的灵敏
度 。
7、微生物鉴定仪：
? 应及时更新系统操作软件，使之能识别
最新认识的微生物。
? 定期对仪器的探测部位进行清洁，并使
用标准模板进行校正。
? 对每批号的鉴定卡、条、板用标准菌株
进行一次测定，并核对每个反应和药敏
试验的结果。
七、标本检验过程的质量控制
? 微生物学实验室除了上述仪器、试剂、
人员等进行质量控制外，还应对标本检
验过程中涉及的每个环节进行全程质量
控制。
（一） 检验项目的申请
? 临床医师应准确把握检验项目的适用范
围、标本采集时机和结果的临床意义，
选择合理的检验项目和适当的标本送检。
并正确书写检验申清单。
标本采集和运送
? 微生物学实验室人员应向临床医师和护士讲解
各种标本的采集要求和临床意义，有义务帮助
和指导他们采集标本
? 最好行床边接种
? 标本的采集应在病程的急性期，使用抗生素之
前，选用无菌容器送检，必要时需冷藏，保温
或厌氧处理
微生物学实验室在收到标本后，核对申请单上
内容和所送标本是否相符，送检的标本是否符
合微生物学检验要求。如果不符，应注明理由
退回。
（二） 直接诊断
? 培养前的涂片非常必要和重要，可以提供很多
有用的信息。
1,对脓、脑脊液、胸腹水等无菌部位来的标
本，可直接发现病原体，尤其是形态特征典型
者。可作为初步报告给临床医师，采取医疗措
施。
2,对痰液标本的涂片检查，可确定标本是否
合格。并发现病原体。
3,对尿液标本的涂片检查，可发现病原体并
进行初步计数，为直接药敏试验奠定了基础。
4,给下一步培养基和培养方法的选择提供了
信息。
（三） 分离培养和鉴定
? 分离培养：
? 对不同标本和临床诊断，应使用多种适合于可
疑病原菌生长的培养基和培养条件，或根据标
本直接涂片选择不同的培养方法
– 如对呼吸道标本应同时接种羊血琼脂平板、巧克力
血琼脂平板、麦康复凯平板和沙保弱琼脂，并将巧
克力血平板置 5%-10%CO2 35℃ 环境中培养；
– 粪便标本应同时接种 SS平板、麦康凯平板或中国蓝
平板；
– 在血液增菌培养期间，应至少在 24h~48h盲目翻种
一次，以后有可疑细菌生长即刻翻种，以尽早发现
病原菌。
鉴定：
? 按照鉴定程序执行，尤其不可省略菌落形态观
察和涂片染色镜检,以正确引导下一步鉴定
? 氧化酶试验不应在糖类发酵选择性平板上进行，
以免假阴性结果出现。
? 在肠道选择性平板上应挑取菌落进行生化反应，
生化反应符合，血清学凝集阳性者可确认报告。
– 单凭血清学凝集或直接从肠道选择性平板上挑取菌
落进行血清学凝集，会因为交叉抗原的存在或抗原
的丢失而导致假阳性或假阴性。每次血清凝集试验
时，应用生理盐水作对照。防止粗糙型菌落造成的
假凝集。
鉴定：
? 使用自动化鉴定仪或编码方式鉴定的结
果，必须与标本的来源、临床诊断、原
始平板上菌落的形态及涂片染色结果进
行核对，以防错误的鉴定结果。
八、室内全面质量控制
? 实验室人员要对以上各项的质量控制内容进行
全面实施
? 对人员要及时进行培训和考核
? 设立实验室审核人员，对标本和结果报告进行
核对
? 在日常标本中掺入模拟标本，进行盲点试验
? 发现误差，应及时找出原因，进行改进。对于
一人工作的小型实验室，则由个人负责全面的
质量控制，自我核对，定期与参考实验室核对
并接受考评。
九、标准菌株的来源和保存
? （一）、标准菌株的来源
标准菌株是指具有典型的、稳定的生理生化特
征，并被国际社会所认可的菌株。
? 我国的卫生部药物生物制品鉴定所菌种保藏中
心，美国菌种保藏中心（ American Type
Culture Collection,ATCC） 等。
? 各级临床检验中心下发的质控菌株也可作为实
验室质控用的具有一定特征的标准菌株。
（二）、标准菌株的保存
? 一般保存法：
– 将细菌种于半固体培养基中,35℃ 培养 18-
24小时后封盖 1cm厚的无菌石蜡油，置 4℃ 保
存。适用于肠杆菌科等细菌的保存；
– 对链球菌、脑膜炎奈瑟菌等苛养菌在血平板
上或血清培养基中移种培养。
– 由于细菌经多次移种，性状可能发生变异。
– 简单、适用于大多数的实验室
表 36- 8 常见细菌的一般保存法
及保存时间
2,冷冻干燥法,
? 是最可靠的菌种保藏方法，它具有不改
变菌种性状和保存时间长等优点，但需
有专门的冷冻干燥设备 。
第二节 室间质量控制评价
一,机构
? 各级临床检验中心和参考实验室
? 负责定期或不定期地通过各项熟练程度考核和
盲点试验检查各实验室的工作质量和水平，进
行总结和评估，针对各个薄弱环节，举办各种
培训班。
? 通过定期或不定期地举办各种学习班，提高各
级技术人员的技术水平，学习新的知识。并提
供或督促有关部门提供合格的标准化的试剂、
抗血清、培养基等实验必需品。
各级实验室可同时接受国内、国际多个质量控
制机构或参考实验室的质量评价。
二、室间质量控制的一般性检
查项目
? 各级临床检验中心对各参加的实验室进行常规
性的检查，包括有否制定各种制度及其执行情
况。
1,培养基和试剂的配制记录、培养基的保存
方法、灭菌质量、有效期。
2,室内全面质量控制的建立，室内工作人员
的熟练程度的考核和盲点试验的进行情况，细
菌检验的操作手册及操作的规范性。
3,设备的操作卡，操作人员的操作水平，设
备的使用、保养、维修记录。
质控管理机构
模拟标本或菌种
实验室
在规定时间完成鉴定
评价分析
总结提高
三、熟练程度的考核
四、盲点试验
? 为了准确反映受控实验室日常处理临床标本的
实际水平及能力，较好的方法是进行未知标本
的盲点质量控制（ quality control blind
unknown）。 由质控管理机构将模拟标本混入
临床普通标本，送入实验室进行常规测定。实
验室主管及实验操作者不知道哪一个标本是来
自质控机构的。实验结果由质控管理机构负责
收回，进行评价。
五、质控结果的分析与评价
? 质控管理机构对每次质控结果进行统计
分析，将每一实验室的结果与标准进行
比较。
? 根据参加的规模和鉴定的正确数，计算
鉴定正确率及所有参加实验室的平均分，
以及每个实验室的得分。
质控结果的分析与评价
? 美国以百分制计算
? 世界卫生组织对每一个正确的鉴定得 3分；部
分正确但可以接受的鉴定结果得 2分；鉴定结
果部分错误得 1分；完全错误的 0分。
? 英国国家微生物学质量控制实验室的计算公式
为
标本鉴定正确数 — 平均实验室正确数
得分 =
实验室平均正确数的标准差
高于平均值得正分。低于平均值得负分，如果
得分低于 -1.96则表示实验室水平较差，需要进
行学习和帮助。
