第十五章 基因工程
所谓的遗传工程就是在分子水平上, 用人工方法提取
（ 或合成 ） 不同生物的遗传物质, 在体外切割, 拼接和重
新组合 。 然后通过载体把重组ＤＮＡ分子引入受体细胞,
使外源ＤＮＡ在受体细胞中进行复制和表达 。 按人们的需
要生产不同的产物或定向地创造生物的新性状, 并使之稳
定地遗传给下一代 。 所以基因工程 （ gene engineering） 也
称为遗传工程 （ genetic engineering）, 基因操作 （ gene
manipulation）, ＤＮＡ重组技术 （ recombination DNA
techniques） 。 有时人们还称它为基因克隆 （ gene cloning）
或分子克隆 （ molecular cloning） 。
遗传工程的基本操作程序大致包括：目的基因的制备,
载体的选择, 体外ＤＮＡ重组, 重组ＤＮＡ引入受体细胞,
克隆转化子的筛选, 重组ＤＮＡ的检测等 。
第一节 基因工程的酶学基础
一、限制性核酸内切酸（ restriction endonuclease）：
（ restriction enzyme） 。 限制性内切酶本来是微生
物细胞中用于专门水解外源ＤＮＡ的一类酶, 其功
能是避免外源ＤＮＡ的干扰或噬菌体的感染, 是细
胞中的一种防御机制 。
,大小和反应条件, 及切割ＤＮＡ
的特点, 可以将限制性内切酶分为三类：
Ⅰ 型酶,分子量较大, 反应需 Mg++,S-腺苷酰 -L-甲硫氨
酸 （ SAM）, ATP等 。 这类酶有特异的识别位点但没有特
异的切割位点, 所以在基因工程中应用不大 。
Ⅱ 型酶,分子量较小 （ 105Da）, 反应只需 Mg++的存在,
并且具有以下两个特点, 使这类酶在基因工程研究中, 得
到广泛的应用 。
?识别位点是一个回文对称结构, 并且切割位点也在这一
回文对称结构上 。
?许多 Ⅱ 型酶切割ＤＮＡ后, 可在ＤＮＡ上形成粘性末端,
有利于ＤＮＡ片段的重组 。
Ⅲ 型酶,这类酶可识别特定顺序, 并在这一顺序的 3’端
24~26bp处切开ＤＮＡ, 所以它的切割位点也是没有特异
性的 。
同裂酶 （ isoschizomers)：
指来源不同但识别相同靶序列的核酸内切酶。
同裂酶进行同样的切割，产生同样的末端。但有些
同裂、酶对甲基化位点的敏感性不同。
同尾酶 （ isocaudamer）：
指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘
性末端的核酸内切酶。利用同尾酶可使切割位点的
选择余地更大。
限制性核酸内切酶的命名原则：
第一个字母：大写，表示所来自的微生物的属名的
第一个字母。
第二、三字母：小写，表示所来自的微生物种名的
第一、二个字母。
其它字母：大写或小写，表示所来自的微生物的菌
株号。
罗马数字：表示该菌株发现的限制酶的编号。
例,EcoR I,来自于 Escheria coli RY13的第一个限
制酶。
二, 末端转移酶 （ terminal transferase）
（ terminal
deoxynucleotidyl transferase）, 它所催化的反应与
DNA pol I 相似, 所不同的是它不需要模板, 它可
以含有３ ’ －ＯＨ的ＤＮＡ片段为引物, 在３ ’ －
ＯＨ端加入核苷酸达几百个 。 末端转移酶常用于在
平头ＤＮＡ上合成一段寡聚核苷酸, 从而形成粘性
末端 。
平末端的另一种处理方式是利用衔接物（ linker）
进行处理，人工加上粘性末端。衔接物是一种人工
合成的小分子 DNA，约 10~20个核苷酸，其结构特
征是含有多种限制性核酸内切酶的酶切位点的回文
结构。如：
CCGGATCCGG
GGCCTAGGCC
将衔接物分子与平末端 DNA分子连接，再用限
制性核酸内切酶酶切，便可产生粘性末端。
这种方法的优点是克隆位点具有限制酶的酶切位点。
Hpa II Hpa II
BamH I 或 Sau3A
三, ＤＮＡ连接酶 （ DNAligase）
该酶常从Ｔ４噬菌体的受感细胞中提取, 是由
Ｔ４噬菌体基因组所编码的, 所以基因工程中常用
的连接酶是Ｔ４连接酶 。 它可催化ＤＮＡ中磷酸二
脂键的形成, 从而使两个片段以共价键的形式结合
起来 。
DNA连接酶对具有粘性末端的 DNA分子经退
火后能很好地连接, 对平末端的 DNA分子也可以
进行连接, 但连接效率较低, 必须加大酶的用量 。
四, 反转录酶 （ reverse transcriptase）
这类酶来自于反转录病毒，它可以ＲＮＡ为模板，催
化合成ＤＮＡ。目前常用的有禽源（ AMV）及鼠源（ M-
MLV）反转录酶两种。
五, DNA pol I及 Klenow片段
该酶常用于制备放射性比度比活体标记高得多的ＤＮ
Ａ探针, 探针的制备方法是采用所谓的缺口平移 （ nick
translation） 法制备的 。
该酶还用于裂口 （ gap） 修补, 反转录第二条链的合成
（ Klenow ）, 隐蔽末端的填平反应 （ Klenow ） 等 。
Klenow片段, DNA pol I 用枯草杆菌蛋白酶水解成两个片
段, 小片段 （ 36KD） 具有 5’ 3’ 核酸外切酶活性, 大片段
（ 76KD） 称为 Klenow片段, 具有 DNA链聚合及 3’ 5’核酸
外切酶的活性 。
Klenow
六,S1核酸酶：
来自于稻谷曲霉，该酶只水解单链 DNA，用
于将粘性末端水解成平末端及 cDNA发夹式结构的
处理。
七、碱性磷酸酶：
来自于大肠杆菌（ bacterial alkaline phosphatase
BAP）或小牛肠（ calf intestinal alkaline phosphatase
CIP），该酶用于脱去 DNA（ RNA） 5’末端的磷酸
根，使 5’-P成为 5’-OH，该过程称核酸分子的脱磷
酸作用。当需要 5’端同位素标记或为了避免 DNA片
段自身连接（或环化）时可进行脱磷反应。
第二节 目的基因的制备
一, 化学合成法：
1979年 Khorana首先成功地合成了 tRNA基因 。
在体外, 可以合成一系列长约几百ｂｐ的寡聚
核苷酸链, 然后按照基因的顺序将这些短的核苷酸
链连接起来 。
化学合成的不足之处在于,（ １ ） 要已知基因
的核苷酸顺序； （ ２ ） 基因不能太大, 这一方面是
测定核苷酸 （ 或氨基酸 ） 顺序比较困难, 另一方面
是因为每次仅能合成几百ｂｐ的短片段, 短片段越
多, 要连接成正确的基因顺序就越困难, 得率越低；
（ ３ ） 价格昂贵 。
化学合成的最大优点是可以合成一些分离较困
难的基因 。 同时, 所合成的基因不含内含子 。 在原
核生物中由于不能进行内含子剪接, 所以一旦将含
有内含子的基因引入原核生物中表达, 其产物往往
是没有活性的 。
由于化学合成法有上述一些优缺点, 所以这种
方法较多地用于合成一些比较小的基因, 如某些激
素基因 。 并也取得一些成功的例子, 例如胰岛素基
因, 生长激素释放抑制激素基因等 。
由于技术的进步, 目前已极少利用化学合成
法制备目的基因, 而是利用 DNA的化学合成法合
成一些短的 DNA片段作为探针 （ probe） 或 PCR的
引物 。
二, 从 cDNA文库或基因组文库中分离
cDNA文库及基因组文库的构造我们将在后面讨
论, 如果制备好了 cDNA文库或基因组文库, 那么
用原位杂交法来筛选 （ screening） 所需要的目的基
因所在的克隆子 。 将这一克隆子大量繁殖, 提取Ｄ
ＮＡ, 便可获得所需的目的基因 。
必要的时候还可以建立差示文库 （ differential
library） 。
三, ＰＣＲ法：
PCR（ polymerase chain reaction)技术是 Mullis于
1986年发明的一项体外快速大量扩增ＤＮＡ片段的
方法 （ 获 1994年诺贝尔奖 ） 。 其基本原理就是在体
外模拟体内 DNA复制的过程, 在反应系统中加入
欲被扩增的 DNA片段, 作为模板；人工合成的寡
聚核苷酸, 作为引物；耐热的 DNA聚合酶 （ Taq）
以及四种核苷酸三磷酸 。 反应时, 先加热至约 92℃,
使模板变性 。 降温至约 50℃ 使引物与模板结合 （ 退
火 ）, 加温至７２ ℃, 在 Taq酶作用下, 使新ＤＮ
Ａ链延伸 。 重复 92℃ （ 变性 ）, 50℃ （ 复性 ）,
72℃ （ 延伸 ） 的过程使ＤＮＡ片段得到不断的扩增,
可以重复几十个周期 。 ＤＮＡ片段将 2n（ ｎ为反应
周期数 ） 的倍数增加 。
四,mRNA差别显示分离目的基因
根据表达特征，真核细胞的基因可以分为两类：
一是所谓的看家基因（ house-keeping gene），另一
类是发育调控基因（ developmental regulated gene）。
在不同的生长时期、在个体的发育与分化的不
同阶段、在生物体对外界环境的压力的反应、在个
体的衰老与死亡等不同的环境下发育调控基因的表
达是不同的，这就是基因的差别表达（ differential
expression）。 mRNA的差别显示技术就是用来分
离这些差别表达的基因的一项有用的技术。
该技术是 P.Liang & A.D.Pardee 1992年建立的，全
称为 mRNA差别显示 PCR(mRNA differential display
reverse transcription chain reaction,DDRT-PCR)
原理,该技术是利用两组特殊的引物对差别表达的
基因进行扩增。
3’端引物,利用 mRNA的 poly A尾巴设计。根据
mRNA结构分析知道,poly A尾巴之前的两个碱基
只有 12种可能的排列组合：
根据这 12种排列组合，设计 12种不同的引物，这样
就将所有 mRNA分成了 12组。这些引物由 11~12个 T
及两个其它的碱基组成，用通式 5’-T11MN或 5’-
T12MN表示,M为 A,G,C的任一种,N为 A,G、
C,T的任一种。这种引物称 锚定引物 。
5’端引物, 5’端为 10个碱基（ 10-mer）组成的随机
引物。每一个随机引物都可能与总 mRNA中的某一
些分子发生杂交，杂交位点也可能在 mRNA的不同
位点上。
用一种 3’锚定引物和一种 5’随机引物进行扩增，可
获得 50~100条 100~500bp的 DNA扩增带。为了要寻
找更多的 DNA差异带，应使用全部的 12种锚定引
物以及尽可能多的 5’随机引物。
第三节 基因工程载体
载体 （ ｖｅｃｔｏｒ ） 是由在细胞中能够自主
复制的ＤＮＡ分子构成的一种遗传成分, 通过实验
手段可使其它的ＤＮＡ片段连接在它的上面, 而进
行复制, 作为基因工程的载体, 必须具备以下几个
性能：
?分子较小, 可携带比较大的ＤＮＡ片段 。
?能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复
制 。
?要有尽可能多种限制酶的切割位点, 但每一种限
制酶又要最少的切割位点 。
?有适合的标记, 易于选择 。
?有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表
达, 并且尽可能是高效的表达 。
?从安全角度考虑, 要求载体不能随便转移, 仅限
于在某些实验室内特殊菌种内才可复制等等 。
一, 质粒 （ plasmid） 载体
质粒是一种独立于染色体外的小分子环状ＤＮ
Ａ, 一般大小约 106~108D,可自身复制和表达, 有
的质粒还带有可做为选择性标记的抗药性基因, 所
以质粒经过适当改选后便可成为良好的载体 。
作为载体的质粒大多是由天然质粒经人工适当
改造而成的, 目前已有多种经改造的良好的质粒载
体 。
以 Ampr和
Tetr为选择
性标记，
克隆位点
在这两个
选择性标
记的单酶
切位点上。
选择
AmprTets或
AmpsTetr的
重组子。
（ 4363bp）
pUC系列,
是目前最常用的 E.coli质粒载体。包括 pUC7、
pUC8,pUC9,pUC12,pUC13,pUC18、
pUC19,pUC118,pUC119等。
优点,
?分子量更小，拷贝数更高：分子量在 3KB左右，
拷贝数可达每细胞 500~700个，因此不需要氯酶素
扩增。
?引入多克隆位点（ multiple cloning sites,MCS）方
便操作。
?引入 lacZ’基因方便筛选。
筛选原理 —— α互补 —— 兰白筛选：
Lac Z’是 lac Z基因的突变型，编码半乳糖苷酶 N端的
146个氨基酸（全长 1201氨基酸）。 MCS也在这个区域内。
这类载体的适合宿主细胞必须是 Z基因突变型，只具有 Z
基因 C端的序列。当两个 Z基因的突变产物在一起时可产
生蛋白质间的互补，称 α互补。
具有 α互补的细菌培养在含 IPTG（异丙基硫代 -β-D-半乳
糖苷）及 X-gal（ 5-溴 -4-氯 -3-吲哚 -β-D-半乳糖苷）的培养
基上会形成的兰色菌落。相反，不互补则产生白色的菌落。
X-gal本身是无色的，在半乳糖苷酶的水解下产生兰色的
物质（被水解为无色的半乳糖及深兰色的 5-溴 -4-氯靛兰），
因此菌落为兰色。如果在 MCS位点上插入 DNA片段导致
插入突变，则不能产生 α互补，因此菌落是白色的。
IPTG起诱导表达的作用，相当于乳糖，但它的诱导
效率远高于乳糖。
原核表达载体：
pGEM系列
包括 pGEM-3,pGEM-3Z,pGEM-3Zf（ -）、
pGEM-4,pGEM-4Z等。带有噬菌体编码的 RNA
聚合酶启动子 SP6及 T7启动子，可用于外源基因的
表达。
pGEX系列,
包括 pGEX-1,pGEX-1λT,pGEX-2T,pGEX-
3X等。该系列是一类融合表达载体，在克隆位点
上游有一个谷胱甘肽巯基转移酶（ glutathione S-
transferase,GST）基因的一个片段。融合位点上
有特异蛋白酶水解位点，方便 GST的去除。在 GST
上游有一个启动子 Ptac（ trp操纵子启动子与 lac操纵
子启动子的融合启动子），在 IPTG诱导下表达。
二、噬菌体（ bacterium phage,phage）载体：
1,λ噬菌体载体：
λ噬菌体的基因组结构：
A W B C D E F Z U V G H M L K I J b2
cI cro cII O P Q S R att int xis gam red cIII N
COS
COS
头部基因 尾部基因 功能不明区
溶原化 重组 早期控制 阻遏 DNA合成 溶菌
生长非必须区段
cI基因：溶原过程控制基因，
插入式载体：
λ噬菌体载体相对于质粒载体来说，克隆片段较大，所以
一般用于 cDNA文库或基因组文库的构建。
?cI基因插入失活：如 λ gt10,λNM1149等载体，在 cI基因
上有 EcoR I及 Hind III的酶切位点。外源基因插入后将导致
cI基因的失活。 cI基因失活后将导致噬菌体不能溶原化，
产生清晰的噬菌斑。相反，产生混浊的噬菌斑。
?Lac Z基因插入失活：如 charon16A载体，在非必须区段引
入 lac Z基因，在 lac Z基因上有 EcoR I位点，插入失活后利
用 X-gal法筛选（兰白筛选）。
由于 λ 噬 菌 体 包 装 时, 只 包 装 它 的 野 生 型 DNA
（ 48.5KB） 的 75%~105%左右的ＤＮＡ, 所以插入式载体
可携带的外源ＤＮＡ片段较取代式为小 。
cI
EcoR ILA 32.7 RA10.6
λgt 10
lac Z
LA 19.9 RA21.9
EcoR I
Charon 16A
取代式载体：野生型噬菌体染色体的中段对于噬菌
体的感染和复制是非必要的, 外源 DNA可以取代
这一片段, 例如 Charon 4A,λEMBL 3/ 4,Charon40
等 载体, 这些载体是用 Lac 5（ 乳糖操纵子的大部
分系列, 包括完整的 Lac Z） 替换入噬菌体的中间
区段, 同时将 Lac 5作为选择标记, 使用时用 EcoRI
水解, 去掉中间的片段, 再与欲克隆片段在体外进
行重组, 包装 。 而后, 感染 E.coli使之在 E.coli内繁
殖, 并裂解 E.coli,形成空斑 。
Lac 5
EcoR I EcoR I
EcoR I BanH I Sal I Sal I BamH I EcoR I
MCS MCS
Charon 4A
EMBL3/4
Charon 40
（左右臂连接） （三段自身连接） （插入片段）
为避免载体自身连接产生的假阳性，可采用双酶解的方法。
例如,λ EMBL 4
E B S S B E
EB S S BE
B S B S
B 欲克隆片 B
体外包装,
λ噬菌体 DNA体外重组后，一般必须经过体外包
装，然后以噬菌体感染的方式将重组 DNA导入
E.coli细胞内。这是因为以感染方式导入细胞的频
率可达 106~108/μgDNA，而以转染（ translation）的
方式导入的频率仅为 103~105/ μgDNA。
λ噬菌体的包装限制为野生噬菌体 DNA（约 48.5
kb）的 75%~105%。
2,M13噬菌体载体：
M13是一种含单键 （ +） DNA（ ssDNA） 的丝状
大肠杆菌噬菌体, 其基因组大小为 6.4kb。 这类载
体主要用来获得大量的单链ＤＮＡ片段, 这种单链
ＤＮＡ片段在遗传学研究中主要用来测定ＤＮＡ序
列 （ sanger双脱氧法 ）, 基因的定点突变研究, 异
源双链 DNA的分析等 。
M13噬菌体的特点,
?感染 Ecoli后, 在宿主细胞内会形成双链的复制型
ＤＮＡ （ replication form DNA,RF DNA） 。 可以
象质粒ＤＮＡ那样在体外进行纯化和操作 。
?成熟的噬菌体颗粒仅能感染 E.coli的 F+细胞, 这是
因为这种噬菌体的感染位点在性散毛上 。 但是无论
是 RF DNA或 ss DNA都能转染 E.coli的 F+或 F-细胞 。
?噬菌体颗粒的大小是受其ＤＮＡ的大小制约的,
这一点正好与 λ噬菌体相反 。 所以 M13噬菌体并不
存在包装限制的问题 。
RF DNA
M13载体：
?具有多克隆位点 (MCS)，方便克隆。许多 M13载体
的多克隆位点与质粒载体 pUC序列的多克隆位点是
相同的，在克隆位点选择上更为方便。
?可以定向地克隆 DNA片段, 克隆在 M13 RF DNA
分子上的双链 DNA片段, 到了子代噬菌体便成了
单链的形式 。 所以如果要同时分离ＤＮＡ分子中的
双链, 则需要两种独立的克隆 。 根据 M13的生物学
特性知道, M13子代噬菌体中总是只含有 （ ＋ ） 链,
所以 M13载体克隆的外源 DNA片段在子代噬菌体
中究竟是含有 DNA分子中的哪条链, 则完全取决
于外源ＤＮＡ克隆时的取向 。 这样一来, 为分别分
离外源ＤＮＡ分子的两条链带来一定的麻烦, 解决
这一问题的一个行之有效的方法就是定向克隆技术 。
M13mp18 MCS M13mp19 MCS
EcoRI BamHI HindIII PstI BglI BglI PstI HindIII BamHI EcoRI
B P P B
B P
B P B P
BamHI & PstI
三、质粒与噬菌体的重组载体：
1,cosmid载体：也称粘粒、柯撕载体。这是一类
用于克隆大片段 DNA的载体，它是由 λ噬菌体的 cos
（ cohesive）末端及质粒（ plasmid）重组而成的载
体。 cosmid载体带有质粒的复制起点、克隆位点、
选择性标记以及 λ噬菌体用于包装的 cos末端等，因
此该载体在体外重组后，可利用噬菌体体外包装的
特性进行体外包装，利用噬菌体感染的方式将重组
DNA导入受体细胞。但它不会产生子代噬菌体，
而是以质粒 DNA的形式存在于细胞内。
2、噬菌粒载体：
噬菌粒（ phagemid or phasmid）是由单链噬菌体
M13或 f1与质粒载体重组而成的新型载体。它具有
质粒的复制起点、选择性标记、多克隆位点等，方
便 DNA的操作，可在细胞内稳定存在；又具有单
链噬菌体的复制起点，在辅助噬菌体的存在下，可
进行噬菌体的繁殖，产生单链的子代噬菌体。
四,YAC载体与 YAC文库：
YAC（ yeast artificial chromosome，酵母人工染
色体）质粒载体是在人类基因组计划（ HGP）实施
的背景下发展起来的一类克隆特大片段的载体。这
类载体含有酵母菌的复制起点 ARS（ automatic
replication sequence,ARS），着丝粒 CEN
（ centromere），端粒 TEL（ telomere），以及选择
性标记和克隆位点；同时还含有大肠杆菌的复制起
始点，可以在大肠杆菌中以环状质粒的形式存在。
DNA体外重组后以原生质体转化的方式导入酵母
细胞。
这类载体克隆能力可达 1~2Mb。主要用于基因
组文库的构建。
原核生物主要载体用途小结,
载体
用途
质粒 λ cosmid M13 YAC
大片段 DNA克隆 — + + — +
基因文库构建 — + + — +
cDNA文库构建 + + — — —
序列分析 + — — + —
单链探针 — — — + —
工程菌 + — — — —
五、真核生物载体：
由于真核生物与原核生物在ＤＮＡ复制和转录
系统上存在着差异, 所以要求用不同的基因载体 。
真核生物基因工程载体的要求与原核生物基因
工程载体大体相似, 所不同的是：
?它除了含有真核基因的转录和复制的必要结构外,
还必须含有细菌的转录和复制的必要结构, 以便能
在细菌中大量繁殖 。
?含有细菌及哺乳动物细胞中的双重选择性标记,
这就是所谓的 穿梭质粒, 可在哺乳动物和原核生物
之间穿梭 。
植物基因工程载体：
用于植物基因工程的载体有 Ti质粒载体及病毒
载体两类。
Ti质粒是存在于根癌农杆菌的一种质粒。根癌
农杆菌感染植物时，会在植株的根 ——茎结合部产
生未分化的细胞团，即冠瘿瘤。有意思的是在形成
冠瘿瘤的同时，一部分 Ti质粒（ T DNA）可以重组
到植物染色体中去，这一特性使 Ti质粒有希望成为
有效的植物基因工程载体，事实上,Ti质粒是迄今
研究得最多的植物基因工程载体。
由于 Ti质粒的宿主范围较窄，仅感染某些双子叶植
物，因此人们又发展了另一类植物基因工程载体 —
— 病毒载体。常用的植物病毒载体有以下几类：
?ssRNA病毒：例如烟草脆裂病毒（ TRV），必须
先将单链 RNA反转录成双链的 cDNA，才可作为载
体。
?ssDNA病毒：例如双子痤病毒, 这类病毒可感染
单子叶植物, 所以是很有前途的一类载体 。
?dsDNA病毒：这是研究得最多的植物病毒载体,
例如花椰菜花叶病毒。
哺乳动物基因工程载体：
目前使用的哺乳动物基因载体大多由哺乳动物
病毒经改造而成 。 用得比较多的病毒有猴空泡病毒
（ SV40）, 单纯疱疹病毒 （ HSV）, Rous肉瘤病
毒, EB病毒等 。
在哺乳动物细胞内表达的载体必须考虑以下几
个表达元件：
?启动子与增强子
?终止信号与加尾信号
?剪接识别信号
?复制与选择元件
选择系统,
?HAT选择系统 —— 胸苷激酶、黄嘌呤鸟嘌呤磷酸
核糖转移酶（ XGPRT）、二氢叶酸还原酶（ DHFR）
系统：
嘌呤合成：
谷氨酰胺 +PRPP IMP AMP
GMP
FH4 FH2
H
XGPRT
天冬氨酸 UMP
CMP
TMP
FH4 FH2
T
TK
7,8二氢叶酸 +NADPH+H+ 5,6,7,8四氢叶酸 +NADP+
DHFR
氨甲喋呤抑制
选择原理：
? tk基因及 xgprt基因的筛选：受体细胞必须是相应的
tk-或 xgprt-dhfr-，将细胞培养在含 HAT（ H：黄嘌呤，
A：氨甲喋呤,T：胸苷）的培养基中。在 A存在下，
核苷酸的从头合成途径被阻断，不能合成 AMP、
TMP及 GMP。这三中核苷酸的合成只能有补偿途径
合成，必须具有 tk或 xgprt基因的存在细胞才可生长。
?dhfr基因的筛选：受体细胞必须是 dhfr-,将细胞培
养在含 HT的培养基中。
?新霉素抗性选择系统：
新霉素是原核生物的抗生素，对真核生物没有
抑制作用，但新霉素的类似物 G418对真核细胞及
原核细胞均具有抑制作用。新霉素抗性基因（ neo）
能在真核细胞中表达并能使 G418失活（ neo基因编
码一个磷酸转移酶），细胞可以生长。
?氯霉素乙酰转移霉检测系统：
氯霉素乙酰转移霉（ CAT）可使氯霉素乙酰化
而失去活性。当 cat基因在真核细胞内表达后，制
备细胞提取物，然后加入乙酰辅酶 A及 14C标记的
氯霉素，如果细胞中存在 cat，可使氯霉素乙酰化，
通过薄层层析将乙酰化及未乙酰化的氯霉素分开，
再用放射自显影检测。
带有小鼠乳腺病
毒 MMTV的 LTR
启动子（ PLTR），
gpt（ xgprt），加
尾信号等
带有 SV40早期
启动子（ PE），
加尾信号。原核
生物的启动子 T7
及 Ptac等。
第四节 重组 DNA导入受体细胞
一, 原核生物的转化 （ transfomation ） 与转染
（ transfection）
?E.coli的钙转化：细菌细胞在一定的生理状态 （ 感
受态 ）, 或经 CaCl2处理, 或制备成原生质体的情
况下, 都可吸收外源ＤＮＡ, 利用这一特性可将重
组ＤＮＡ导入受体细胞中, 用质粒作载体的遗传工
程一般使用这种方法 。
由于 E.coli不会自发地产生感受态, 因此 E.coli
的转化一般采用钙转化法 。 该方法是将 E.coli用冷
CaCl2(0℃ ) 致敏, 而后在高温 （ 42 ℃ ） 下热休克,
这样可使外原 DNA进入受体细胞 。
?E.coli的电穿孔转化：在高压电场下使细胞产生瞬
间的穿孔，这个穿孔足够大并可维持足够的时间，
使外原 DNA进入受体细胞。电穿孔法的转化效率
比钙转化法高 2~3个数量级。这种方法也可用于真
核生物的转染。
?原核生物的转染：转染是指转化感染
（ Transfection来自于 transfomation与 infection），
所以凡是以噬菌体（如 M13）或病毒为载体，以转
化的方法将 DNA导入细胞的方法均称为转染。因
此转染就方法来说与转化是一样的。
二、体外包装与转导（ transduction）：
以 λ噬菌体作为载体，常利用转导的方法将重组
DNA导入受体细胞。噬菌体载体在体外与目的 DNA
片段重组后，与噬菌体的头部蛋白及尾部蛋白混合
保温，让 DNA在体外进行包装，产生有感染能力的
噬菌体颗粒。利用这种噬菌体感染受体细胞从而将
重组 DNA导入受体细胞内。
包装蛋白的制备可采用单菌株法或双菌株法。单
菌株法是利用 cos突变的溶源菌。双菌株法则利用两
株不同的突变菌株，如 BHB2688是编码头部蛋白的 E
基因突变,BHB2690是编码头部蛋白的 D基因突变，
两个菌株经诱导后都能合成包装蛋白，但不能进行
包装，当两者的蛋白质混合后便具有包装能力。
三、真核生物的转染：
?磷酸钙转染技术：主要用于动物细胞的转染。将
DNA溶液加入到 CaCl2中，然后在强烈震荡下加入
由 Na2HPO4和 NaH2PO4组成的磷酸缓冲液，使溶
液产生磷酸钙沉淀并将 DNA包裹在沉淀中。将这
些沉淀加入到细胞中，利用细胞的胞饮作用将
DNA导入到细胞中。磷酸钙一方面可以增加细胞
的通透性，一方面可以避免 DNA被细胞内的核酸
酶水解。
?电穿孔法：原理与原核生物的电穿孔法一样，主
要用于植物细胞的转染。
?基因抢转染法：主要用于植物细胞的转染。利用
被电场或机械加速的金属微粒能够进入细胞内的基
本原理，先将 DNA溶液与钨、金等金属微粒一起
保温，使 DNA吸附在金属微粒表面，随高速的金
属微粒直接进入细胞内。
?激光微束穿孔法：主要用于叶绿体或线粒体的基
因工程操作。利用直径很小、能量很高的激光束在
细胞表面引起可逆性的穿孔，使 DNA进入细胞。
?显微注射法：主要用于动物细胞或植物的原生质
体，利用毛细管直接将 DNA注入细胞内。
?脂质体（ liposome）介导法：主要用于动物细胞或
植物的原生质体。将 DNA包裹在人工制备的磷脂
双分子层的膜状结构内，通过脂质体与细胞膜的融
合而将 DNA导入细胞内。
?多聚物介导法：用于动物细胞或植物的原生质体。
利用多聚物如 PEG、二乙胺乙基葡聚糖（ DEAE葡
聚糖）、多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸等与二价阳离子、
DNA混合形成沉淀颗粒，通过细胞的胞饮作用而
进入细胞内。
第五节 克隆子的筛选与鉴定
一、克隆子的筛选：利用载体的选择性标记进行筛
选。
二、克隆子的鉴定：
?遗传检测法：该方法要求克隆基因能够表达，并
利用相应的基因突变型作为受体细胞，当受体细胞
由突变型变为野生型时或赋予受体细胞特定的表型
时，我们基本可以确定所克隆的基因是否是目的基
因。
优点,简便、快速，结果较可靠。
缺点,基因必须表达并具有合适的受体细胞。
?凝胶电泳检测法：该方法利用凝胶电泳的方法检
测重组 DNA分子或克隆片段的大小（分子量）。
优点,简便、快速。
缺点,只能提供克隆片段大小的信息。
?免疫化学检测法：利用免疫学的原理，检测克隆
基因的表达产物。
放射性标记抗体检测法,该方法类似于原位杂交法。
优点,方法简便，一次可检测大量的克隆子。
缺点,克隆基因必须表达并具有相应的抗体。
放射性标
记抗体检
测法的原
理
滤膜
培养皿及菌落
抗体溶液
放射性标
记抗体检
测法的操
作程序
ELISA检测技术, ELISA（ enzyme linked immuno-
sorbent assay）是一种固相免疫检测技术。比较常
用的方法有用于检测抗原的双抗体夹心法和用于检
测抗体的间接法两种。因此，基因工程中用于检测
克隆基因表达产物的方法主要是双抗体夹心法。
优点：能进行定量检测，因此该方法更多地用于基
因表达产物的定量分析。
缺点：较繁琐。基因必须表达。
?分子杂交技术检测法：包括菌落或噬菌斑的原位
杂交技术。
优点,方法简便、快速。
缺点,必须具有相应的探针。
?杂交抑制翻译法：该方法用于 cDNA文库中目的基
因的筛选。其原理是利用 cDNA与 mRNA杂交后导
致 mRNA的不能翻译，从而筛选阳性克隆子。
优点,不需要克隆基因的表达，不需要探针或抗体。
缺点,较烦琐。
?DNA序列分析：该方法通常是用在目的基因筛选
后最终的鉴定。
各克隆子提取相应
的 cDNA
从 cDNA文库响应的
细胞提出 mRNA
混合杂交
无细胞翻译体系（麦胚或网织红细胞提取物）体外翻译
35S-甲硫氨酸标记
聚丙烯酰胺凝胶电泳
放射自显影
分析比较，找出目的蛋白不合成的克隆子即为目的基因
第六节 文库的构建
一,cDNA文库（ library）的构建
cDNA文库是指得到足够多的分别克隆的 cDNA
片段, 汇集这些克隆应包含某种细胞中各种 mRNA
的相应顺序, 每种顺序至少有一份拷贝, 这种克隆
片段的汇集体称为某种细胞的 cDNA文库 。
为了得到特定基因的 cDNA片段, 就需要先分
离出有功能的特定 mRNA。 所以首先必须考虑从什
么细胞, 用什么方法将ｍＲＮＡ提取出来 。 这是由
于不同细胞可限定合成不同的蛋白质, 这样在一些
组织细胞中除了含有普通蛋白质的 mRNA外, 还会
有数量较多的特定 mRNA。
mRNA的分离有许多种方法, 例如化学的方法,
物理的方法 （ 如差速梯度离心法 ） 等 。 有的还可以
利用真核生物的 mRNA具有的 poly A尾巴进行亲和
层析法分离 mRNA。 有的则采用几种方法联合使用,
其总的目标就是获得纯度高, 得率高的有活性的
mRNA。
在取得专性的 mRNA后, 接下来就是将 mRNA
通过反转录酶合成杂种 DNA链 （ DNA-RNA分子 ）,
在碱 （ KOH） 作用下水解 RNA链, 然后经 DNA聚
合酶作用再合成第二条 DNA链, 即形成双链 cDNA
分子, 将双链 cDNA插入载体后形成重组体, 并导
入细菌中, 随细菌的繁殖而扩增和克隆, 形成
cDNA文库
二、基因组文库的构建
基因文库 （ gene library）,用重组 DNA技术
将某种生物细胞的总 DNA或染色体 DNA的所有片
段随机地连接在载体上, 然后转移到适当的宿主细
胞中通过细胞增殖而构成各个片段的克隆 。 当制备
的克隆数目多到可以把某种生物的全部基因都包含
在内的情况下, 这一组克隆的总体就称为某种生物
的基因文库 。 同一定义也适用于线粒体或叶绿体Ｄ
ＮＡ的基因文库 。 由于制备ＤＮＡ片段的切点是随
机的, 所以每一克隆内所含的ＤＮＡ片段即可能是
一个或几个基因, 也可能是一个基因的一部分或除
完整基因外还包含着两侧的邻近ＤＮＡ顺序 。
基因文库的构建就是利用所谓的, 鸟抢法,, 使基因
组的 DNA片段随机地插入适当的载体中, 引入细胞进行大
量繁殖而构建的 。
用于构建基因文库的片段的产生大致有两种方法, 一
是用限制性内切酶完全消化基因组 DNA,这个方法有两个
特点 。 第一是假如所需的基因含有所用限制酶的识别位点,
那么这一基因将被克隆在两个或数个片段中, 给研究带来
一定的困难 。 第二, 一般常用的限制酶大多识别六个 bp序
列, 切割 DNA所产生的片段的平均大小相对比较小 （ 约
4kb即 46＝ 4096bp）, 因此整个基因文库要含有非常大量
的重组体, 这样应用分子杂交法进行筛选就十分费事费时 。
虽然可以用限制酶进行部分消化, 产生约 20kb的片段, 但
这种方法必须掌握好酶解的条件 。
用于制备基因文库的随机片段的另一种方法是
采用机械随机切割 。 这种方法可以制备大片段的
DNA（ 用噬菌体 λ作载体约 20kb,以 cosmid作载体
约 45kb ）, 从而克服上述的两处缺点 。 但是这种
方法的不是之处是：所制备的片段的末端顺序是随
机的, 还必须经过末端修复, 人工制造接头等手续
才能与载体ＤＮＡ进行连接 。
λ或 cosmid
载体, 因为它们的容量比较大, 可克隆大片段的
DNA。 虽然 cosmid载体比 λ载体的容量大, 但由于
文库的保存 （ cosmid载体在 E.coli中, λ载体在噬菌
体中 ） λ比 cosmid容易, 因此 λ载体用的更多些 。
基因组文库的克隆数：由于基因文库的 DNA片段
是随机克隆的，因此要保证任何一个基因在文库内
都能找到，基因组文库的克隆数量必须达到一定的
数量。 1975年 Clarke & Carbon提出一个计算公式：
ln(1-P)N=
ln(1-L/M)
P：任一基因在文库中出现的概率
L：克隆片段的平均大小
M：基因组的大小
例：人的基因组大小为 3x109bp，克隆片段的平均大小为
19kb,P=0.99。 N=7.3x105，即该文库的克隆子数必须达
到 73万。
三、差异文库（ differential library）的构建
差异文库又称差示文库、扣除文库（ subtracted
library）。用于克隆不同组织细胞或同一组织细胞
处于不同功能状态下基因表达差异的 cDNA文库。
这种方法特别适用于克隆在特定细胞中表达的基因、
在细胞周期特定阶段表达的基因、受生长因子调节
的基因、在特定发育阶段表达或参与发育调节的基
因等。它的 优点 在于不需要任何有关目的基因的核
苷酸序列信息，只要求有两种差异表达的细胞群体。
正常组织的 mRNA 异常组织的 mRNA
杂交
mRNA-cDNA +某些单链 cDNA
羟基磷灰石分离单链 cDNA
合成互补链成为 ds-DNA
克隆
cDNA
反转录
第七章 基因工程的应用
一、基础理论研究：
?基因的结构与功能。
?基因的人工定点突变。
?人类基因组计划
二、医学领域中的应用：
?疾病的诊断：包括遗传性疾病与传染性疾病。使
用的技术主要有 PCR技术,RFLP技术,LCR技术、
用于 ELISA技术的基因工程抗原、产前诊断等。
RFLP,restriction
fragment length poly-
morphism,限制性片
段长度多态性。
LCR,ligase chain
reaction，连接酶
链式反应。
?疾病的预防：基因工程 疫苗。
?疾病的治疗：基因工程药物、基因治疗。
基因治疗：指利用遗传学的原理治疗人类的疾病。
目前人类基因治疗主要集中在遗传性疾病、肿瘤及
某些传染性疾病。至 1997年初，全世界共记录了
2103例基因治疗病例（美国 1700例）。其中 68%是
治疗肿瘤的,19%是治疗遗传病的,12%治疗传染
性疾病等。
第一例基因治疗的疾病是 1990年 9月每个 FDA批准
的用 ada（腺苷脱氨酶）基因治疗 SCID（严重型联
合型免疫缺陷症。第一例接受治疗的是一位 4岁的
女孩，第二例是一位 9岁的女孩。
已投入使用（含临床试验）的基因工程疫苗
基因工程方法生产蛋白质药物的优势是非常明显的
我国在遗传病的基因治疗方面也开展地比较早。
1991年 7月，我国开始进行 HEMB（血友病 B，凝
血因子 IX突变）的基因治疗。从一批志愿接受基
因治疗的 HEMB患者中选择了两兄弟（伴性遗传）
进行治疗。效果明显,1994年通过卫生部的评审。
三、其它领域的应用
农作物,
主要在抗病虫害、抗逆性、提高品质等
方面的转基因作物。至 1998年 4月，世界各国
批准进行的大田实验已达 4387项。
畜牧业：
培养出了包括猪、牛、羊、马、鸡、鱼等多种
动物的转基因动物，涉及的基因有生长激素基因、
抗冻基因、抗病毒基因等。
生产贵重药物 —— 乳腺生物反应器，如：红细
胞生成素（肿瘤化疗的辅助药物）、乳铁蛋白（促
进铁的吸收）,1-抗胰蛋白酶（治疗囊性纤维化及
肺气肿）、凝血因子 VIII及 IX（治疗血友病）人血
清白蛋白（治疗烧伤）、等。预测到 2005年，年产
值可达 350亿美圆。
所谓的遗传工程就是在分子水平上, 用人工方法提取
（ 或合成 ） 不同生物的遗传物质, 在体外切割, 拼接和重
新组合 。 然后通过载体把重组ＤＮＡ分子引入受体细胞,
使外源ＤＮＡ在受体细胞中进行复制和表达 。 按人们的需
要生产不同的产物或定向地创造生物的新性状, 并使之稳
定地遗传给下一代 。 所以基因工程 （ gene engineering） 也
称为遗传工程 （ genetic engineering）, 基因操作 （ gene
manipulation）, ＤＮＡ重组技术 （ recombination DNA
techniques） 。 有时人们还称它为基因克隆 （ gene cloning）
或分子克隆 （ molecular cloning） 。
遗传工程的基本操作程序大致包括：目的基因的制备,
载体的选择, 体外ＤＮＡ重组, 重组ＤＮＡ引入受体细胞,
克隆转化子的筛选, 重组ＤＮＡ的检测等 。
第一节 基因工程的酶学基础
一、限制性核酸内切酸（ restriction endonuclease）：
（ restriction enzyme） 。 限制性内切酶本来是微生
物细胞中用于专门水解外源ＤＮＡ的一类酶, 其功
能是避免外源ＤＮＡ的干扰或噬菌体的感染, 是细
胞中的一种防御机制 。
,大小和反应条件, 及切割ＤＮＡ
的特点, 可以将限制性内切酶分为三类：
Ⅰ 型酶,分子量较大, 反应需 Mg++,S-腺苷酰 -L-甲硫氨
酸 （ SAM）, ATP等 。 这类酶有特异的识别位点但没有特
异的切割位点, 所以在基因工程中应用不大 。
Ⅱ 型酶,分子量较小 （ 105Da）, 反应只需 Mg++的存在,
并且具有以下两个特点, 使这类酶在基因工程研究中, 得
到广泛的应用 。
?识别位点是一个回文对称结构, 并且切割位点也在这一
回文对称结构上 。
?许多 Ⅱ 型酶切割ＤＮＡ后, 可在ＤＮＡ上形成粘性末端,
有利于ＤＮＡ片段的重组 。
Ⅲ 型酶,这类酶可识别特定顺序, 并在这一顺序的 3’端
24~26bp处切开ＤＮＡ, 所以它的切割位点也是没有特异
性的 。
同裂酶 （ isoschizomers)：
指来源不同但识别相同靶序列的核酸内切酶。
同裂酶进行同样的切割，产生同样的末端。但有些
同裂、酶对甲基化位点的敏感性不同。
同尾酶 （ isocaudamer）：
指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘
性末端的核酸内切酶。利用同尾酶可使切割位点的
选择余地更大。
限制性核酸内切酶的命名原则：
第一个字母：大写，表示所来自的微生物的属名的
第一个字母。
第二、三字母：小写，表示所来自的微生物种名的
第一、二个字母。
其它字母：大写或小写，表示所来自的微生物的菌
株号。
罗马数字：表示该菌株发现的限制酶的编号。
例,EcoR I,来自于 Escheria coli RY13的第一个限
制酶。
二, 末端转移酶 （ terminal transferase）
（ terminal
deoxynucleotidyl transferase）, 它所催化的反应与
DNA pol I 相似, 所不同的是它不需要模板, 它可
以含有３ ’ －ＯＨ的ＤＮＡ片段为引物, 在３ ’ －
ＯＨ端加入核苷酸达几百个 。 末端转移酶常用于在
平头ＤＮＡ上合成一段寡聚核苷酸, 从而形成粘性
末端 。
平末端的另一种处理方式是利用衔接物（ linker）
进行处理，人工加上粘性末端。衔接物是一种人工
合成的小分子 DNA，约 10~20个核苷酸，其结构特
征是含有多种限制性核酸内切酶的酶切位点的回文
结构。如：
CCGGATCCGG
GGCCTAGGCC
将衔接物分子与平末端 DNA分子连接，再用限
制性核酸内切酶酶切，便可产生粘性末端。
这种方法的优点是克隆位点具有限制酶的酶切位点。
Hpa II Hpa II
BamH I 或 Sau3A
三, ＤＮＡ连接酶 （ DNAligase）
该酶常从Ｔ４噬菌体的受感细胞中提取, 是由
Ｔ４噬菌体基因组所编码的, 所以基因工程中常用
的连接酶是Ｔ４连接酶 。 它可催化ＤＮＡ中磷酸二
脂键的形成, 从而使两个片段以共价键的形式结合
起来 。
DNA连接酶对具有粘性末端的 DNA分子经退
火后能很好地连接, 对平末端的 DNA分子也可以
进行连接, 但连接效率较低, 必须加大酶的用量 。
四, 反转录酶 （ reverse transcriptase）
这类酶来自于反转录病毒，它可以ＲＮＡ为模板，催
化合成ＤＮＡ。目前常用的有禽源（ AMV）及鼠源（ M-
MLV）反转录酶两种。
五, DNA pol I及 Klenow片段
该酶常用于制备放射性比度比活体标记高得多的ＤＮ
Ａ探针, 探针的制备方法是采用所谓的缺口平移 （ nick
translation） 法制备的 。
该酶还用于裂口 （ gap） 修补, 反转录第二条链的合成
（ Klenow ）, 隐蔽末端的填平反应 （ Klenow ） 等 。
Klenow片段, DNA pol I 用枯草杆菌蛋白酶水解成两个片
段, 小片段 （ 36KD） 具有 5’ 3’ 核酸外切酶活性, 大片段
（ 76KD） 称为 Klenow片段, 具有 DNA链聚合及 3’ 5’核酸
外切酶的活性 。
Klenow
六,S1核酸酶：
来自于稻谷曲霉，该酶只水解单链 DNA，用
于将粘性末端水解成平末端及 cDNA发夹式结构的
处理。
七、碱性磷酸酶：
来自于大肠杆菌（ bacterial alkaline phosphatase
BAP）或小牛肠（ calf intestinal alkaline phosphatase
CIP），该酶用于脱去 DNA（ RNA） 5’末端的磷酸
根，使 5’-P成为 5’-OH，该过程称核酸分子的脱磷
酸作用。当需要 5’端同位素标记或为了避免 DNA片
段自身连接（或环化）时可进行脱磷反应。
第二节 目的基因的制备
一, 化学合成法：
1979年 Khorana首先成功地合成了 tRNA基因 。
在体外, 可以合成一系列长约几百ｂｐ的寡聚
核苷酸链, 然后按照基因的顺序将这些短的核苷酸
链连接起来 。
化学合成的不足之处在于,（ １ ） 要已知基因
的核苷酸顺序； （ ２ ） 基因不能太大, 这一方面是
测定核苷酸 （ 或氨基酸 ） 顺序比较困难, 另一方面
是因为每次仅能合成几百ｂｐ的短片段, 短片段越
多, 要连接成正确的基因顺序就越困难, 得率越低；
（ ３ ） 价格昂贵 。
化学合成的最大优点是可以合成一些分离较困
难的基因 。 同时, 所合成的基因不含内含子 。 在原
核生物中由于不能进行内含子剪接, 所以一旦将含
有内含子的基因引入原核生物中表达, 其产物往往
是没有活性的 。
由于化学合成法有上述一些优缺点, 所以这种
方法较多地用于合成一些比较小的基因, 如某些激
素基因 。 并也取得一些成功的例子, 例如胰岛素基
因, 生长激素释放抑制激素基因等 。
由于技术的进步, 目前已极少利用化学合成
法制备目的基因, 而是利用 DNA的化学合成法合
成一些短的 DNA片段作为探针 （ probe） 或 PCR的
引物 。
二, 从 cDNA文库或基因组文库中分离
cDNA文库及基因组文库的构造我们将在后面讨
论, 如果制备好了 cDNA文库或基因组文库, 那么
用原位杂交法来筛选 （ screening） 所需要的目的基
因所在的克隆子 。 将这一克隆子大量繁殖, 提取Ｄ
ＮＡ, 便可获得所需的目的基因 。
必要的时候还可以建立差示文库 （ differential
library） 。
三, ＰＣＲ法：
PCR（ polymerase chain reaction)技术是 Mullis于
1986年发明的一项体外快速大量扩增ＤＮＡ片段的
方法 （ 获 1994年诺贝尔奖 ） 。 其基本原理就是在体
外模拟体内 DNA复制的过程, 在反应系统中加入
欲被扩增的 DNA片段, 作为模板；人工合成的寡
聚核苷酸, 作为引物；耐热的 DNA聚合酶 （ Taq）
以及四种核苷酸三磷酸 。 反应时, 先加热至约 92℃,
使模板变性 。 降温至约 50℃ 使引物与模板结合 （ 退
火 ）, 加温至７２ ℃, 在 Taq酶作用下, 使新ＤＮ
Ａ链延伸 。 重复 92℃ （ 变性 ）, 50℃ （ 复性 ）,
72℃ （ 延伸 ） 的过程使ＤＮＡ片段得到不断的扩增,
可以重复几十个周期 。 ＤＮＡ片段将 2n（ ｎ为反应
周期数 ） 的倍数增加 。
四,mRNA差别显示分离目的基因
根据表达特征，真核细胞的基因可以分为两类：
一是所谓的看家基因（ house-keeping gene），另一
类是发育调控基因（ developmental regulated gene）。
在不同的生长时期、在个体的发育与分化的不
同阶段、在生物体对外界环境的压力的反应、在个
体的衰老与死亡等不同的环境下发育调控基因的表
达是不同的，这就是基因的差别表达（ differential
expression）。 mRNA的差别显示技术就是用来分
离这些差别表达的基因的一项有用的技术。
该技术是 P.Liang & A.D.Pardee 1992年建立的，全
称为 mRNA差别显示 PCR(mRNA differential display
reverse transcription chain reaction,DDRT-PCR)
原理,该技术是利用两组特殊的引物对差别表达的
基因进行扩增。
3’端引物,利用 mRNA的 poly A尾巴设计。根据
mRNA结构分析知道,poly A尾巴之前的两个碱基
只有 12种可能的排列组合：
根据这 12种排列组合，设计 12种不同的引物，这样
就将所有 mRNA分成了 12组。这些引物由 11~12个 T
及两个其它的碱基组成，用通式 5’-T11MN或 5’-
T12MN表示,M为 A,G,C的任一种,N为 A,G、
C,T的任一种。这种引物称 锚定引物 。
5’端引物, 5’端为 10个碱基（ 10-mer）组成的随机
引物。每一个随机引物都可能与总 mRNA中的某一
些分子发生杂交，杂交位点也可能在 mRNA的不同
位点上。
用一种 3’锚定引物和一种 5’随机引物进行扩增，可
获得 50~100条 100~500bp的 DNA扩增带。为了要寻
找更多的 DNA差异带，应使用全部的 12种锚定引
物以及尽可能多的 5’随机引物。
第三节 基因工程载体
载体 （ ｖｅｃｔｏｒ ） 是由在细胞中能够自主
复制的ＤＮＡ分子构成的一种遗传成分, 通过实验
手段可使其它的ＤＮＡ片段连接在它的上面, 而进
行复制, 作为基因工程的载体, 必须具备以下几个
性能：
?分子较小, 可携带比较大的ＤＮＡ片段 。
?能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复
制 。
?要有尽可能多种限制酶的切割位点, 但每一种限
制酶又要最少的切割位点 。
?有适合的标记, 易于选择 。
?有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表
达, 并且尽可能是高效的表达 。
?从安全角度考虑, 要求载体不能随便转移, 仅限
于在某些实验室内特殊菌种内才可复制等等 。
一, 质粒 （ plasmid） 载体
质粒是一种独立于染色体外的小分子环状ＤＮ
Ａ, 一般大小约 106~108D,可自身复制和表达, 有
的质粒还带有可做为选择性标记的抗药性基因, 所
以质粒经过适当改选后便可成为良好的载体 。
作为载体的质粒大多是由天然质粒经人工适当
改造而成的, 目前已有多种经改造的良好的质粒载
体 。
以 Ampr和
Tetr为选择
性标记，
克隆位点
在这两个
选择性标
记的单酶
切位点上。
选择
AmprTets或
AmpsTetr的
重组子。
（ 4363bp）
pUC系列,
是目前最常用的 E.coli质粒载体。包括 pUC7、
pUC8,pUC9,pUC12,pUC13,pUC18、
pUC19,pUC118,pUC119等。
优点,
?分子量更小，拷贝数更高：分子量在 3KB左右，
拷贝数可达每细胞 500~700个，因此不需要氯酶素
扩增。
?引入多克隆位点（ multiple cloning sites,MCS）方
便操作。
?引入 lacZ’基因方便筛选。
筛选原理 —— α互补 —— 兰白筛选：
Lac Z’是 lac Z基因的突变型，编码半乳糖苷酶 N端的
146个氨基酸（全长 1201氨基酸）。 MCS也在这个区域内。
这类载体的适合宿主细胞必须是 Z基因突变型，只具有 Z
基因 C端的序列。当两个 Z基因的突变产物在一起时可产
生蛋白质间的互补，称 α互补。
具有 α互补的细菌培养在含 IPTG（异丙基硫代 -β-D-半乳
糖苷）及 X-gal（ 5-溴 -4-氯 -3-吲哚 -β-D-半乳糖苷）的培养
基上会形成的兰色菌落。相反，不互补则产生白色的菌落。
X-gal本身是无色的，在半乳糖苷酶的水解下产生兰色的
物质（被水解为无色的半乳糖及深兰色的 5-溴 -4-氯靛兰），
因此菌落为兰色。如果在 MCS位点上插入 DNA片段导致
插入突变，则不能产生 α互补，因此菌落是白色的。
IPTG起诱导表达的作用，相当于乳糖，但它的诱导
效率远高于乳糖。
原核表达载体：
pGEM系列
包括 pGEM-3,pGEM-3Z,pGEM-3Zf（ -）、
pGEM-4,pGEM-4Z等。带有噬菌体编码的 RNA
聚合酶启动子 SP6及 T7启动子，可用于外源基因的
表达。
pGEX系列,
包括 pGEX-1,pGEX-1λT,pGEX-2T,pGEX-
3X等。该系列是一类融合表达载体，在克隆位点
上游有一个谷胱甘肽巯基转移酶（ glutathione S-
transferase,GST）基因的一个片段。融合位点上
有特异蛋白酶水解位点，方便 GST的去除。在 GST
上游有一个启动子 Ptac（ trp操纵子启动子与 lac操纵
子启动子的融合启动子），在 IPTG诱导下表达。
二、噬菌体（ bacterium phage,phage）载体：
1,λ噬菌体载体：
λ噬菌体的基因组结构：
A W B C D E F Z U V G H M L K I J b2
cI cro cII O P Q S R att int xis gam red cIII N
COS
COS
头部基因 尾部基因 功能不明区
溶原化 重组 早期控制 阻遏 DNA合成 溶菌
生长非必须区段
cI基因：溶原过程控制基因，
插入式载体：
λ噬菌体载体相对于质粒载体来说，克隆片段较大，所以
一般用于 cDNA文库或基因组文库的构建。
?cI基因插入失活：如 λ gt10,λNM1149等载体，在 cI基因
上有 EcoR I及 Hind III的酶切位点。外源基因插入后将导致
cI基因的失活。 cI基因失活后将导致噬菌体不能溶原化，
产生清晰的噬菌斑。相反，产生混浊的噬菌斑。
?Lac Z基因插入失活：如 charon16A载体，在非必须区段引
入 lac Z基因，在 lac Z基因上有 EcoR I位点，插入失活后利
用 X-gal法筛选（兰白筛选）。
由于 λ 噬 菌 体 包 装 时, 只 包 装 它 的 野 生 型 DNA
（ 48.5KB） 的 75%~105%左右的ＤＮＡ, 所以插入式载体
可携带的外源ＤＮＡ片段较取代式为小 。
cI
EcoR ILA 32.7 RA10.6
λgt 10
lac Z
LA 19.9 RA21.9
EcoR I
Charon 16A
取代式载体：野生型噬菌体染色体的中段对于噬菌
体的感染和复制是非必要的, 外源 DNA可以取代
这一片段, 例如 Charon 4A,λEMBL 3/ 4,Charon40
等 载体, 这些载体是用 Lac 5（ 乳糖操纵子的大部
分系列, 包括完整的 Lac Z） 替换入噬菌体的中间
区段, 同时将 Lac 5作为选择标记, 使用时用 EcoRI
水解, 去掉中间的片段, 再与欲克隆片段在体外进
行重组, 包装 。 而后, 感染 E.coli使之在 E.coli内繁
殖, 并裂解 E.coli,形成空斑 。
Lac 5
EcoR I EcoR I
EcoR I BanH I Sal I Sal I BamH I EcoR I
MCS MCS
Charon 4A
EMBL3/4
Charon 40
（左右臂连接） （三段自身连接） （插入片段）
为避免载体自身连接产生的假阳性，可采用双酶解的方法。
例如,λ EMBL 4
E B S S B E
EB S S BE
B S B S
B 欲克隆片 B
体外包装,
λ噬菌体 DNA体外重组后，一般必须经过体外包
装，然后以噬菌体感染的方式将重组 DNA导入
E.coli细胞内。这是因为以感染方式导入细胞的频
率可达 106~108/μgDNA，而以转染（ translation）的
方式导入的频率仅为 103~105/ μgDNA。
λ噬菌体的包装限制为野生噬菌体 DNA（约 48.5
kb）的 75%~105%。
2,M13噬菌体载体：
M13是一种含单键 （ +） DNA（ ssDNA） 的丝状
大肠杆菌噬菌体, 其基因组大小为 6.4kb。 这类载
体主要用来获得大量的单链ＤＮＡ片段, 这种单链
ＤＮＡ片段在遗传学研究中主要用来测定ＤＮＡ序
列 （ sanger双脱氧法 ）, 基因的定点突变研究, 异
源双链 DNA的分析等 。
M13噬菌体的特点,
?感染 Ecoli后, 在宿主细胞内会形成双链的复制型
ＤＮＡ （ replication form DNA,RF DNA） 。 可以
象质粒ＤＮＡ那样在体外进行纯化和操作 。
?成熟的噬菌体颗粒仅能感染 E.coli的 F+细胞, 这是
因为这种噬菌体的感染位点在性散毛上 。 但是无论
是 RF DNA或 ss DNA都能转染 E.coli的 F+或 F-细胞 。
?噬菌体颗粒的大小是受其ＤＮＡ的大小制约的,
这一点正好与 λ噬菌体相反 。 所以 M13噬菌体并不
存在包装限制的问题 。
RF DNA
M13载体：
?具有多克隆位点 (MCS)，方便克隆。许多 M13载体
的多克隆位点与质粒载体 pUC序列的多克隆位点是
相同的，在克隆位点选择上更为方便。
?可以定向地克隆 DNA片段, 克隆在 M13 RF DNA
分子上的双链 DNA片段, 到了子代噬菌体便成了
单链的形式 。 所以如果要同时分离ＤＮＡ分子中的
双链, 则需要两种独立的克隆 。 根据 M13的生物学
特性知道, M13子代噬菌体中总是只含有 （ ＋ ） 链,
所以 M13载体克隆的外源 DNA片段在子代噬菌体
中究竟是含有 DNA分子中的哪条链, 则完全取决
于外源ＤＮＡ克隆时的取向 。 这样一来, 为分别分
离外源ＤＮＡ分子的两条链带来一定的麻烦, 解决
这一问题的一个行之有效的方法就是定向克隆技术 。
M13mp18 MCS M13mp19 MCS
EcoRI BamHI HindIII PstI BglI BglI PstI HindIII BamHI EcoRI
B P P B
B P
B P B P
BamHI & PstI
三、质粒与噬菌体的重组载体：
1,cosmid载体：也称粘粒、柯撕载体。这是一类
用于克隆大片段 DNA的载体，它是由 λ噬菌体的 cos
（ cohesive）末端及质粒（ plasmid）重组而成的载
体。 cosmid载体带有质粒的复制起点、克隆位点、
选择性标记以及 λ噬菌体用于包装的 cos末端等，因
此该载体在体外重组后，可利用噬菌体体外包装的
特性进行体外包装，利用噬菌体感染的方式将重组
DNA导入受体细胞。但它不会产生子代噬菌体，
而是以质粒 DNA的形式存在于细胞内。
2、噬菌粒载体：
噬菌粒（ phagemid or phasmid）是由单链噬菌体
M13或 f1与质粒载体重组而成的新型载体。它具有
质粒的复制起点、选择性标记、多克隆位点等，方
便 DNA的操作，可在细胞内稳定存在；又具有单
链噬菌体的复制起点，在辅助噬菌体的存在下，可
进行噬菌体的繁殖，产生单链的子代噬菌体。
四,YAC载体与 YAC文库：
YAC（ yeast artificial chromosome，酵母人工染
色体）质粒载体是在人类基因组计划（ HGP）实施
的背景下发展起来的一类克隆特大片段的载体。这
类载体含有酵母菌的复制起点 ARS（ automatic
replication sequence,ARS），着丝粒 CEN
（ centromere），端粒 TEL（ telomere），以及选择
性标记和克隆位点；同时还含有大肠杆菌的复制起
始点，可以在大肠杆菌中以环状质粒的形式存在。
DNA体外重组后以原生质体转化的方式导入酵母
细胞。
这类载体克隆能力可达 1~2Mb。主要用于基因
组文库的构建。
原核生物主要载体用途小结,
载体
用途
质粒 λ cosmid M13 YAC
大片段 DNA克隆 — + + — +
基因文库构建 — + + — +
cDNA文库构建 + + — — —
序列分析 + — — + —
单链探针 — — — + —
工程菌 + — — — —
五、真核生物载体：
由于真核生物与原核生物在ＤＮＡ复制和转录
系统上存在着差异, 所以要求用不同的基因载体 。
真核生物基因工程载体的要求与原核生物基因
工程载体大体相似, 所不同的是：
?它除了含有真核基因的转录和复制的必要结构外,
还必须含有细菌的转录和复制的必要结构, 以便能
在细菌中大量繁殖 。
?含有细菌及哺乳动物细胞中的双重选择性标记,
这就是所谓的 穿梭质粒, 可在哺乳动物和原核生物
之间穿梭 。
植物基因工程载体：
用于植物基因工程的载体有 Ti质粒载体及病毒
载体两类。
Ti质粒是存在于根癌农杆菌的一种质粒。根癌
农杆菌感染植物时，会在植株的根 ——茎结合部产
生未分化的细胞团，即冠瘿瘤。有意思的是在形成
冠瘿瘤的同时，一部分 Ti质粒（ T DNA）可以重组
到植物染色体中去，这一特性使 Ti质粒有希望成为
有效的植物基因工程载体，事实上,Ti质粒是迄今
研究得最多的植物基因工程载体。
由于 Ti质粒的宿主范围较窄，仅感染某些双子叶植
物，因此人们又发展了另一类植物基因工程载体 —
— 病毒载体。常用的植物病毒载体有以下几类：
?ssRNA病毒：例如烟草脆裂病毒（ TRV），必须
先将单链 RNA反转录成双链的 cDNA，才可作为载
体。
?ssDNA病毒：例如双子痤病毒, 这类病毒可感染
单子叶植物, 所以是很有前途的一类载体 。
?dsDNA病毒：这是研究得最多的植物病毒载体,
例如花椰菜花叶病毒。
哺乳动物基因工程载体：
目前使用的哺乳动物基因载体大多由哺乳动物
病毒经改造而成 。 用得比较多的病毒有猴空泡病毒
（ SV40）, 单纯疱疹病毒 （ HSV）, Rous肉瘤病
毒, EB病毒等 。
在哺乳动物细胞内表达的载体必须考虑以下几
个表达元件：
?启动子与增强子
?终止信号与加尾信号
?剪接识别信号
?复制与选择元件
选择系统,
?HAT选择系统 —— 胸苷激酶、黄嘌呤鸟嘌呤磷酸
核糖转移酶（ XGPRT）、二氢叶酸还原酶（ DHFR）
系统：
嘌呤合成：
谷氨酰胺 +PRPP IMP AMP
GMP
FH4 FH2
H
XGPRT
天冬氨酸 UMP
CMP
TMP
FH4 FH2
T
TK
7,8二氢叶酸 +NADPH+H+ 5,6,7,8四氢叶酸 +NADP+
DHFR
氨甲喋呤抑制
选择原理：
? tk基因及 xgprt基因的筛选：受体细胞必须是相应的
tk-或 xgprt-dhfr-，将细胞培养在含 HAT（ H：黄嘌呤，
A：氨甲喋呤,T：胸苷）的培养基中。在 A存在下，
核苷酸的从头合成途径被阻断，不能合成 AMP、
TMP及 GMP。这三中核苷酸的合成只能有补偿途径
合成，必须具有 tk或 xgprt基因的存在细胞才可生长。
?dhfr基因的筛选：受体细胞必须是 dhfr-,将细胞培
养在含 HT的培养基中。
?新霉素抗性选择系统：
新霉素是原核生物的抗生素，对真核生物没有
抑制作用，但新霉素的类似物 G418对真核细胞及
原核细胞均具有抑制作用。新霉素抗性基因（ neo）
能在真核细胞中表达并能使 G418失活（ neo基因编
码一个磷酸转移酶），细胞可以生长。
?氯霉素乙酰转移霉检测系统：
氯霉素乙酰转移霉（ CAT）可使氯霉素乙酰化
而失去活性。当 cat基因在真核细胞内表达后，制
备细胞提取物，然后加入乙酰辅酶 A及 14C标记的
氯霉素，如果细胞中存在 cat，可使氯霉素乙酰化，
通过薄层层析将乙酰化及未乙酰化的氯霉素分开，
再用放射自显影检测。
带有小鼠乳腺病
毒 MMTV的 LTR
启动子（ PLTR），
gpt（ xgprt），加
尾信号等
带有 SV40早期
启动子（ PE），
加尾信号。原核
生物的启动子 T7
及 Ptac等。
第四节 重组 DNA导入受体细胞
一, 原核生物的转化 （ transfomation ） 与转染
（ transfection）
?E.coli的钙转化：细菌细胞在一定的生理状态 （ 感
受态 ）, 或经 CaCl2处理, 或制备成原生质体的情
况下, 都可吸收外源ＤＮＡ, 利用这一特性可将重
组ＤＮＡ导入受体细胞中, 用质粒作载体的遗传工
程一般使用这种方法 。
由于 E.coli不会自发地产生感受态, 因此 E.coli
的转化一般采用钙转化法 。 该方法是将 E.coli用冷
CaCl2(0℃ ) 致敏, 而后在高温 （ 42 ℃ ） 下热休克,
这样可使外原 DNA进入受体细胞 。
?E.coli的电穿孔转化：在高压电场下使细胞产生瞬
间的穿孔，这个穿孔足够大并可维持足够的时间，
使外原 DNA进入受体细胞。电穿孔法的转化效率
比钙转化法高 2~3个数量级。这种方法也可用于真
核生物的转染。
?原核生物的转染：转染是指转化感染
（ Transfection来自于 transfomation与 infection），
所以凡是以噬菌体（如 M13）或病毒为载体，以转
化的方法将 DNA导入细胞的方法均称为转染。因
此转染就方法来说与转化是一样的。
二、体外包装与转导（ transduction）：
以 λ噬菌体作为载体，常利用转导的方法将重组
DNA导入受体细胞。噬菌体载体在体外与目的 DNA
片段重组后，与噬菌体的头部蛋白及尾部蛋白混合
保温，让 DNA在体外进行包装，产生有感染能力的
噬菌体颗粒。利用这种噬菌体感染受体细胞从而将
重组 DNA导入受体细胞内。
包装蛋白的制备可采用单菌株法或双菌株法。单
菌株法是利用 cos突变的溶源菌。双菌株法则利用两
株不同的突变菌株，如 BHB2688是编码头部蛋白的 E
基因突变,BHB2690是编码头部蛋白的 D基因突变，
两个菌株经诱导后都能合成包装蛋白，但不能进行
包装，当两者的蛋白质混合后便具有包装能力。
三、真核生物的转染：
?磷酸钙转染技术：主要用于动物细胞的转染。将
DNA溶液加入到 CaCl2中，然后在强烈震荡下加入
由 Na2HPO4和 NaH2PO4组成的磷酸缓冲液，使溶
液产生磷酸钙沉淀并将 DNA包裹在沉淀中。将这
些沉淀加入到细胞中，利用细胞的胞饮作用将
DNA导入到细胞中。磷酸钙一方面可以增加细胞
的通透性，一方面可以避免 DNA被细胞内的核酸
酶水解。
?电穿孔法：原理与原核生物的电穿孔法一样，主
要用于植物细胞的转染。
?基因抢转染法：主要用于植物细胞的转染。利用
被电场或机械加速的金属微粒能够进入细胞内的基
本原理，先将 DNA溶液与钨、金等金属微粒一起
保温，使 DNA吸附在金属微粒表面，随高速的金
属微粒直接进入细胞内。
?激光微束穿孔法：主要用于叶绿体或线粒体的基
因工程操作。利用直径很小、能量很高的激光束在
细胞表面引起可逆性的穿孔，使 DNA进入细胞。
?显微注射法：主要用于动物细胞或植物的原生质
体，利用毛细管直接将 DNA注入细胞内。
?脂质体（ liposome）介导法：主要用于动物细胞或
植物的原生质体。将 DNA包裹在人工制备的磷脂
双分子层的膜状结构内，通过脂质体与细胞膜的融
合而将 DNA导入细胞内。
?多聚物介导法：用于动物细胞或植物的原生质体。
利用多聚物如 PEG、二乙胺乙基葡聚糖（ DEAE葡
聚糖）、多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸等与二价阳离子、
DNA混合形成沉淀颗粒，通过细胞的胞饮作用而
进入细胞内。
第五节 克隆子的筛选与鉴定
一、克隆子的筛选：利用载体的选择性标记进行筛
选。
二、克隆子的鉴定：
?遗传检测法：该方法要求克隆基因能够表达，并
利用相应的基因突变型作为受体细胞，当受体细胞
由突变型变为野生型时或赋予受体细胞特定的表型
时，我们基本可以确定所克隆的基因是否是目的基
因。
优点,简便、快速，结果较可靠。
缺点,基因必须表达并具有合适的受体细胞。
?凝胶电泳检测法：该方法利用凝胶电泳的方法检
测重组 DNA分子或克隆片段的大小（分子量）。
优点,简便、快速。
缺点,只能提供克隆片段大小的信息。
?免疫化学检测法：利用免疫学的原理，检测克隆
基因的表达产物。
放射性标记抗体检测法,该方法类似于原位杂交法。
优点,方法简便，一次可检测大量的克隆子。
缺点,克隆基因必须表达并具有相应的抗体。
放射性标
记抗体检
测法的原
理
滤膜
培养皿及菌落
抗体溶液
放射性标
记抗体检
测法的操
作程序
ELISA检测技术, ELISA（ enzyme linked immuno-
sorbent assay）是一种固相免疫检测技术。比较常
用的方法有用于检测抗原的双抗体夹心法和用于检
测抗体的间接法两种。因此，基因工程中用于检测
克隆基因表达产物的方法主要是双抗体夹心法。
优点：能进行定量检测，因此该方法更多地用于基
因表达产物的定量分析。
缺点：较繁琐。基因必须表达。
?分子杂交技术检测法：包括菌落或噬菌斑的原位
杂交技术。
优点,方法简便、快速。
缺点,必须具有相应的探针。
?杂交抑制翻译法：该方法用于 cDNA文库中目的基
因的筛选。其原理是利用 cDNA与 mRNA杂交后导
致 mRNA的不能翻译，从而筛选阳性克隆子。
优点,不需要克隆基因的表达，不需要探针或抗体。
缺点,较烦琐。
?DNA序列分析：该方法通常是用在目的基因筛选
后最终的鉴定。
各克隆子提取相应
的 cDNA
从 cDNA文库响应的
细胞提出 mRNA
混合杂交
无细胞翻译体系（麦胚或网织红细胞提取物）体外翻译
35S-甲硫氨酸标记
聚丙烯酰胺凝胶电泳
放射自显影
分析比较，找出目的蛋白不合成的克隆子即为目的基因
第六节 文库的构建
一,cDNA文库（ library）的构建
cDNA文库是指得到足够多的分别克隆的 cDNA
片段, 汇集这些克隆应包含某种细胞中各种 mRNA
的相应顺序, 每种顺序至少有一份拷贝, 这种克隆
片段的汇集体称为某种细胞的 cDNA文库 。
为了得到特定基因的 cDNA片段, 就需要先分
离出有功能的特定 mRNA。 所以首先必须考虑从什
么细胞, 用什么方法将ｍＲＮＡ提取出来 。 这是由
于不同细胞可限定合成不同的蛋白质, 这样在一些
组织细胞中除了含有普通蛋白质的 mRNA外, 还会
有数量较多的特定 mRNA。
mRNA的分离有许多种方法, 例如化学的方法,
物理的方法 （ 如差速梯度离心法 ） 等 。 有的还可以
利用真核生物的 mRNA具有的 poly A尾巴进行亲和
层析法分离 mRNA。 有的则采用几种方法联合使用,
其总的目标就是获得纯度高, 得率高的有活性的
mRNA。
在取得专性的 mRNA后, 接下来就是将 mRNA
通过反转录酶合成杂种 DNA链 （ DNA-RNA分子 ）,
在碱 （ KOH） 作用下水解 RNA链, 然后经 DNA聚
合酶作用再合成第二条 DNA链, 即形成双链 cDNA
分子, 将双链 cDNA插入载体后形成重组体, 并导
入细菌中, 随细菌的繁殖而扩增和克隆, 形成
cDNA文库
二、基因组文库的构建
基因文库 （ gene library）,用重组 DNA技术
将某种生物细胞的总 DNA或染色体 DNA的所有片
段随机地连接在载体上, 然后转移到适当的宿主细
胞中通过细胞增殖而构成各个片段的克隆 。 当制备
的克隆数目多到可以把某种生物的全部基因都包含
在内的情况下, 这一组克隆的总体就称为某种生物
的基因文库 。 同一定义也适用于线粒体或叶绿体Ｄ
ＮＡ的基因文库 。 由于制备ＤＮＡ片段的切点是随
机的, 所以每一克隆内所含的ＤＮＡ片段即可能是
一个或几个基因, 也可能是一个基因的一部分或除
完整基因外还包含着两侧的邻近ＤＮＡ顺序 。
基因文库的构建就是利用所谓的, 鸟抢法,, 使基因
组的 DNA片段随机地插入适当的载体中, 引入细胞进行大
量繁殖而构建的 。
用于构建基因文库的片段的产生大致有两种方法, 一
是用限制性内切酶完全消化基因组 DNA,这个方法有两个
特点 。 第一是假如所需的基因含有所用限制酶的识别位点,
那么这一基因将被克隆在两个或数个片段中, 给研究带来
一定的困难 。 第二, 一般常用的限制酶大多识别六个 bp序
列, 切割 DNA所产生的片段的平均大小相对比较小 （ 约
4kb即 46＝ 4096bp）, 因此整个基因文库要含有非常大量
的重组体, 这样应用分子杂交法进行筛选就十分费事费时 。
虽然可以用限制酶进行部分消化, 产生约 20kb的片段, 但
这种方法必须掌握好酶解的条件 。
用于制备基因文库的随机片段的另一种方法是
采用机械随机切割 。 这种方法可以制备大片段的
DNA（ 用噬菌体 λ作载体约 20kb,以 cosmid作载体
约 45kb ）, 从而克服上述的两处缺点 。 但是这种
方法的不是之处是：所制备的片段的末端顺序是随
机的, 还必须经过末端修复, 人工制造接头等手续
才能与载体ＤＮＡ进行连接 。
λ或 cosmid
载体, 因为它们的容量比较大, 可克隆大片段的
DNA。 虽然 cosmid载体比 λ载体的容量大, 但由于
文库的保存 （ cosmid载体在 E.coli中, λ载体在噬菌
体中 ） λ比 cosmid容易, 因此 λ载体用的更多些 。
基因组文库的克隆数：由于基因文库的 DNA片段
是随机克隆的，因此要保证任何一个基因在文库内
都能找到，基因组文库的克隆数量必须达到一定的
数量。 1975年 Clarke & Carbon提出一个计算公式：
ln(1-P)N=
ln(1-L/M)
P：任一基因在文库中出现的概率
L：克隆片段的平均大小
M：基因组的大小
例：人的基因组大小为 3x109bp，克隆片段的平均大小为
19kb,P=0.99。 N=7.3x105，即该文库的克隆子数必须达
到 73万。
三、差异文库（ differential library）的构建
差异文库又称差示文库、扣除文库（ subtracted
library）。用于克隆不同组织细胞或同一组织细胞
处于不同功能状态下基因表达差异的 cDNA文库。
这种方法特别适用于克隆在特定细胞中表达的基因、
在细胞周期特定阶段表达的基因、受生长因子调节
的基因、在特定发育阶段表达或参与发育调节的基
因等。它的 优点 在于不需要任何有关目的基因的核
苷酸序列信息，只要求有两种差异表达的细胞群体。
正常组织的 mRNA 异常组织的 mRNA
杂交
mRNA-cDNA +某些单链 cDNA
羟基磷灰石分离单链 cDNA
合成互补链成为 ds-DNA
克隆
cDNA
反转录
第七章 基因工程的应用
一、基础理论研究：
?基因的结构与功能。
?基因的人工定点突变。
?人类基因组计划
二、医学领域中的应用：
?疾病的诊断：包括遗传性疾病与传染性疾病。使
用的技术主要有 PCR技术,RFLP技术,LCR技术、
用于 ELISA技术的基因工程抗原、产前诊断等。
RFLP,restriction
fragment length poly-
morphism,限制性片
段长度多态性。
LCR,ligase chain
reaction，连接酶
链式反应。
?疾病的预防：基因工程 疫苗。
?疾病的治疗：基因工程药物、基因治疗。
基因治疗：指利用遗传学的原理治疗人类的疾病。
目前人类基因治疗主要集中在遗传性疾病、肿瘤及
某些传染性疾病。至 1997年初，全世界共记录了
2103例基因治疗病例（美国 1700例）。其中 68%是
治疗肿瘤的,19%是治疗遗传病的,12%治疗传染
性疾病等。
第一例基因治疗的疾病是 1990年 9月每个 FDA批准
的用 ada（腺苷脱氨酶）基因治疗 SCID（严重型联
合型免疫缺陷症。第一例接受治疗的是一位 4岁的
女孩，第二例是一位 9岁的女孩。
已投入使用（含临床试验）的基因工程疫苗
基因工程方法生产蛋白质药物的优势是非常明显的
我国在遗传病的基因治疗方面也开展地比较早。
1991年 7月，我国开始进行 HEMB（血友病 B，凝
血因子 IX突变）的基因治疗。从一批志愿接受基
因治疗的 HEMB患者中选择了两兄弟（伴性遗传）
进行治疗。效果明显,1994年通过卫生部的评审。
三、其它领域的应用
农作物,
主要在抗病虫害、抗逆性、提高品质等
方面的转基因作物。至 1998年 4月，世界各国
批准进行的大田实验已达 4387项。
畜牧业：
培养出了包括猪、牛、羊、马、鸡、鱼等多种
动物的转基因动物，涉及的基因有生长激素基因、
抗冻基因、抗病毒基因等。
生产贵重药物 —— 乳腺生物反应器，如：红细
胞生成素（肿瘤化疗的辅助药物）、乳铁蛋白（促
进铁的吸收）,1-抗胰蛋白酶（治疗囊性纤维化及
肺气肿）、凝血因子 VIII及 IX（治疗血友病）人血
清白蛋白（治疗烧伤）、等。预测到 2005年，年产
值可达 350亿美圆。
