第 3节 核酸的理化性质
一 物理性质
DNA为白色纤维状固体 ; RNA为白色粉末状固体?
1、形态
2、溶解性
微溶于水，不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般的有
机溶剂； DNA在溶液中粘度大,RNA粘度小。
核酸既含有 酸性的磷酸基团, 又含有弱碱性的
碱基, 故可发生两性解离 。 其解离状态随溶液的 pH
值而改变 。
核酸的理化性质
3,两性解离
由于磷酸基团的酸性很强，所以 pI较低,整个分
子相当于多元酸。
利用核酸的两性解离可以通过调节核酸溶液的等
电点来沉淀核酸，也可通过电泳分离纯化核酸。
嘌呤和嘧啶具有共轭双键, 能强烈吸收紫外光 。
在 260nm处有最大吸收峰 。 对于纯的 DNA或 RNA,可
以通过测得 A260来测定核酸的含量 。
纯的 DNA,A260/ A280 =1.8
纯的 RNA,A260/ A280 =2.0
二 紫外吸收性质
A260/ A280值 可以反映核酸的纯度。
核酸的理化性质
核酸变性后, 在 260nm处的吸收值上升, 这叫
增色效应 (hyperchromic effect)。 增色效应常
可用来衡量 DNA变性的程度 。
三 核酸的变性
核酸在某些物理或化学因素的作用下，其 空间
结构 发生改变，从而引起理化性质的改变及生物活
性的降低或丧失叫 变性 。 引起变性的因素有：加热
、酸碱、尿素、甲醛等。
1.增色效应
核酸的理化性质
DNA分子变性 ( DNA denaturation )
● D.S,DNA S.S,DNA
( 加温,极端 pH,尿素,酰胺 )
变性过程的表现
☆ S.S,DNA粘度降低
☆ S.S,DNA 沉降速度加快
☆ S.S,DNA分子的 A 260 nm UV 值上升
( Hyperchromicity )
热变性中光吸收达到最大吸收 （ 完全变性 ） 一
半 （ 双螺旋结构失去一半 ） 时的温度称为 DNA的熔
点或熔解温度 （ Tm） 。
2,熔解温度
核酸的理化性质
三 核酸的变性
热变性曲线 (熔解曲线 )
图 5-26 Tm的示意图
在 DNA发生热变性
的过程中,A260随
温度的变化曲线。
核酸的理化性质
1.185
1.0
1.37
OD
℃
Concentration 50 ?g/mL
D.S DNA A260 = 1
S.S DNA A260 = 1.37
dNTPs A260 = 1.60
Tm = OD增加值的中点温度 (一般为 85-95℃ )
Tm值与 DNA的 均一性, G-C含量, 介质离子强
度, pH等因素有关 。
核酸的理化性质
三 核酸的变性
Marmur-Doty Formula
Evaluation GC% of DNA
1x SSC
GC% = 30?70%
( 0.15 M Nacl + 0.015 M Sodium Limonate )
Tm1 ＜ Tm2
℃1.0
1.185
1.37
OD
what is meaning?
Tm = 69.3 + 0.41 × GC%
l 增色效应的跳跃现象 ( Jump of Hyperchromicity )
高分子量的 DNA分子在热变性过程中,富含 AT区
域首先发生 变性,然后逐步扩展,表现增色效应的
跳跃现象,使变形过程加快,
rich AT rich AT
● 影响 Tm值的因素
☆ 在 A,T,C,G 随机分布的情况下
☆ GC%含量相同的情况下
GC%愈高 → Tm值愈大
GC%愈低 → Tm 值愈小
AT形成变性核心，变性加快,Tm 值小
碱基排列对 Tm值具有明显影响 （除变性核心外）
5? CG 3?
GC n
5? GC 3?
CG n
5? TA 3?
AT n
5? AT 3?
TA n
碱基堆积面 和 碱基积压程度的差异
例：常温下，活体内 D.S DNA分子中富含 AT的变性
核心区（ promoter,terminator region ）
常表现氢键的断裂与形成的, DNA呼吸现象,
37.6 ℃ 57 ℃
Tm
＞＞
＜＜
碱基排列对 Tm值具有明显影响
☆ 大片段 D.S DNA分子之间比较
片段长短对 Tm值的影响较小,但与组成和排列相
关
☆ 小于 100bp 的 D.S DNA分子比较
片段愈短,变性愈快,Tm值愈小
☆ 变性液中含有尿素，酰胺等
尿素，酰胺与碱基间形成氢键
改变碱基对间的氢键
Tm 值 可降至 40℃ 左右
☆ 盐浓度的影响
单链 DNA主链的磷酸基团
负电荷的静电斥力
两条单链 DNA的分离
Na+在磷酸基团周围形成的电子云
对静电斥力产生屏蔽作用 减弱静电斥力
Tm ↑
当 Na+浓度低 屏蔽作用小 斥力加强 Tm ↓
Tm
OD
A260
静电斥力
0.01M 0.1M 1.0M
Na+
当 Na+浓度高
屏蔽作用大 斥力减弱
熵值 (△ S)上升碱基溶解性降低
疏水作用力增加
pH ~ 12 酮基 → 烯醇基
pH ~ 2-3 NH2 → NH 3+ (质子化 )
改变氢键的形成与结合力
☆极端 pH条件的影响
一切减弱氢键,碱基堆积力的因素
均将使 Tm 值降低
四 核酸的复性
1.复性 (renaturation)
DNA水溶液加热变性时, 双螺旋两条链分开；如
果缓慢冷即, 两条链可以完全重新结合成各原来一
样的双股螺旋过程 。
复性是变性的逆转。但需要一定的条件，要在
一定的盐浓度下缓慢降温。
核酸的理化性质
DNA 分子的复性 (anneal or renaturation)
D.S DNA S.S DNA
Denaturation ▲
▼ Renaturation
复性过程依赖于单链分子间的随机碰撞
( Depends on the collision of complementary S.S,DNA )
2,减色效应 (hypochromic effect)
当变性的 DNA经复性以重新形成双螺旋结构时，
其溶液的 A260值则减小，这种现象称为减色效应。
核酸的理化性质
四 核酸的复性
影响 DNA复性过程的因素,
● 阳离子浓度
0.18 ~ 0.2M Na+ 可消除 polydNt 间的静电斥力
● 复性反应的温度 Tm - 25℃ (60-65℃ )
以消除 S.S,DNA 分子内的部分二级结构
● S.S,DNA 的初始浓度 C0
● DNA 分子中,dNt 的排列状况 (随机排列,重复排列 )
● S.S,DNA分子的长度
S.S,DNA愈长
S.S,DNA愈短
→ 分子扩散愈慢 → 复性愈慢
→ 分子扩散愈快 → 复性愈快
复性发生的过程讨论
遵循 second – order kinetics formula （ 二级反应动力学）
dCt / dt = -KCt2
● 两条部分同源的 S.S,DNA,在复性过程中形成的部分
双链区是不稳定的
● 单链 DNA的随机碰撞 过程（ randomly collision ）
反应初始 t = 0
单链 DNA浓度 = C0
反应达 t 时
单链 DNA浓度 = Ct
dCt / dt = -KCt2 积分
Ct / C0 = 1 / 1+KC0t
当 Ct / C0 = 1/2 时
Ct / C0 = 1/2 = 1 / 1+ KC0t(1/2)
K = 1 / Cot(1/2)
Cot(1/2) = 1/K (mol,Sec / L)
● 不同的 DNA Cot ? 是不同的,Cot ?不但与
K值有关，也与 DNA的复杂性有关；
● K值取决于阳离子浓度、温度、片断大小及
DNA分子复杂性；
● 如果将其它因子固定，则 K与复杂性 X的关
系为：
K=1/X,所以,Cot ? =1/K =X：
Cot(1/2) = 1/K (mol,Sec / L)
● 复杂性 (X)----DNA中没有重复碱基的排列顺
序的数值。
e.g,(A)n,X =1; (AT)n,X =2; (AGC)n,X =3;
(AGCT)n,X =4; (AGCTG)n,X =5;
● Cot ? 代表 DNA顺序的复杂程度。
Cot(1/2) = 1/K (mol,Sec / L)
3,分子杂交 (hybridization)
核酸的理化性质
四 核酸的复性
? 不同来源的单链 DNA与单链 DNA
RNA与 单链 DNA分子间
? 在长于 20 bp的同源区域内
? 以氢键连接方式互补配对
? 形成稳定的双链结构的过程
3,分子杂交 (hybridization)
核酸的理化性质
四 核酸的复性
DNA链在复性时, 其中的一条单链可以内异体
DNA单链, 按照碱基互补原则合成一段 DNA-DNA或
DNA-RNA双链的过程 。
3,分子杂交 (hybridization)
核酸的理化性质
四 核酸的复性
杂交检测
D.S,DNA
X-film
Column
absorb
D.S DNA
p32 or biotin
labeled
S.S,DNA ( as probe)×→ S.S,DNA
种类
＊ 液相分子杂交
Absorb D.S,DNA
＊固相分子杂交 （ 1975 E,M,Southern）
1975 E,M,Southern
1977,J.C,Alwine
1978,Hany Towbin
＊ 原位分子杂交 (In situ hybridization )
Southern blot
Northern blot
Western blot
S.S,DNA × S.S,DNA
S.S,RNA × S.S,DNA
Protein × antibody
Southern Blotting
Northern Blotting
Western Blotting
五 DNA 一 级 结 构 分 析
（ DNA sequencing ）
1972,Herbert Boyer
限制性核酸内切酶 II (RE-II)
1975,Sanger C.
“＋,—” 法
1977,Maxam Gilbert
化学定序法
1977,Sanger C.
ddNTP(酶 )法
1,历史
(1) Chemical sequencing
G系统； pH 8.0
硫酸二甲酯 → G → m 7G →C8~N9 断裂 → 脱 G
A+G系统； pH 2.0
哌啶甲酸 （ pidine） → 嘌呤环 N质子化 → 脱嘌呤
C系统； 1.5 mol/L NaCl
C + 肼（ hydrazine） → 脱 C
T + C系统；
肼 (hydrazine) → 打开嘧啶环 → 重新 5C环化 → 脱嘧啶
2,方法
Chemical sequencing
G系统 脱 G
A+G系统 脱嘌呤
C系统 脱 C
T + C系统 脱嘧啶
A
A
C
A
G
C
T
T
C
A
(2) 双脱氧法
H H
N
4ddNTP系统中
DNA链均终止
在 ddNTP(二脱
氧核苷酸 )
ddATP ddCTP ddTTP ddGTP
A C T G
C
T
G
A
C
T
T
C
G
A
C
A
A
六 DNA的甲基化（ Methylation）
(m5C in Eukaryote)
m5C
1,DNA中 m5C的特点
● 对 MspI,HpaII 位点的高频修饰
MspI HpaII
CmC GG
C CmGG +
HNH
H
4
1
5 3
6 2 O
H
N
N
CH3
修饰核糖右下角,Am
碱基左上角,m22,7G
举例,
a,DNA
m5dC — 5-甲基脱氧胞苷；
m6dA — N6-甲基脱氧腺苷；
n2dA — 2-氨基脱氧腺苷。
2,甲基化的方式
b,RNA
m1A — 1-甲基腺苷
m6A — N6-甲基腺苷
m26A — N6,N6-二甲基腺苷
m6Am—N6,2'-O-二甲基腺苷
3 Function of m5C
? 细胞分化，组织特化，阶段发育，组织培养过程的脱分
化与 m5C的相关性（ 5-氨胞苷去甲基化的作用）
? m5C---甲基化是生物自我保护的机制
? m5C 的不足 基因表达相关
m5C的丰富 基因关闭相关
m5C 的程度具有明显的组织，细胞的特异性 (时空性 )
(杂种优势理论的研究 ……)
? m5C-----使 Z-DNA在体内趋于稳定状态
● m5C 与基因突变的关系
C → m5C → T → gene mutation (癌变 )
HNH
5
O
C
G
CH3
5
HNH
O
O
CH3
5
O
氧化脱氨
m5C
G
T
A
本章结束
一 物理性质
DNA为白色纤维状固体 ; RNA为白色粉末状固体?
1、形态
2、溶解性
微溶于水，不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般的有
机溶剂； DNA在溶液中粘度大,RNA粘度小。
核酸既含有 酸性的磷酸基团, 又含有弱碱性的
碱基, 故可发生两性解离 。 其解离状态随溶液的 pH
值而改变 。
核酸的理化性质
3,两性解离
由于磷酸基团的酸性很强，所以 pI较低,整个分
子相当于多元酸。
利用核酸的两性解离可以通过调节核酸溶液的等
电点来沉淀核酸，也可通过电泳分离纯化核酸。
嘌呤和嘧啶具有共轭双键, 能强烈吸收紫外光 。
在 260nm处有最大吸收峰 。 对于纯的 DNA或 RNA,可
以通过测得 A260来测定核酸的含量 。
纯的 DNA,A260/ A280 =1.8
纯的 RNA,A260/ A280 =2.0
二 紫外吸收性质
A260/ A280值 可以反映核酸的纯度。
核酸的理化性质
核酸变性后, 在 260nm处的吸收值上升, 这叫
增色效应 (hyperchromic effect)。 增色效应常
可用来衡量 DNA变性的程度 。
三 核酸的变性
核酸在某些物理或化学因素的作用下，其 空间
结构 发生改变，从而引起理化性质的改变及生物活
性的降低或丧失叫 变性 。 引起变性的因素有：加热
、酸碱、尿素、甲醛等。
1.增色效应
核酸的理化性质
DNA分子变性 ( DNA denaturation )
● D.S,DNA S.S,DNA
( 加温,极端 pH,尿素,酰胺 )
变性过程的表现
☆ S.S,DNA粘度降低
☆ S.S,DNA 沉降速度加快
☆ S.S,DNA分子的 A 260 nm UV 值上升
( Hyperchromicity )
热变性中光吸收达到最大吸收 （ 完全变性 ） 一
半 （ 双螺旋结构失去一半 ） 时的温度称为 DNA的熔
点或熔解温度 （ Tm） 。
2,熔解温度
核酸的理化性质
三 核酸的变性
热变性曲线 (熔解曲线 )
图 5-26 Tm的示意图
在 DNA发生热变性
的过程中,A260随
温度的变化曲线。
核酸的理化性质
1.185
1.0
1.37
OD
℃
Concentration 50 ?g/mL
D.S DNA A260 = 1
S.S DNA A260 = 1.37
dNTPs A260 = 1.60
Tm = OD增加值的中点温度 (一般为 85-95℃ )
Tm值与 DNA的 均一性, G-C含量, 介质离子强
度, pH等因素有关 。
核酸的理化性质
三 核酸的变性
Marmur-Doty Formula
Evaluation GC% of DNA
1x SSC
GC% = 30?70%
( 0.15 M Nacl + 0.015 M Sodium Limonate )
Tm1 ＜ Tm2
℃1.0
1.185
1.37
OD
what is meaning?
Tm = 69.3 + 0.41 × GC%
l 增色效应的跳跃现象 ( Jump of Hyperchromicity )
高分子量的 DNA分子在热变性过程中,富含 AT区
域首先发生 变性,然后逐步扩展,表现增色效应的
跳跃现象,使变形过程加快,
rich AT rich AT
● 影响 Tm值的因素
☆ 在 A,T,C,G 随机分布的情况下
☆ GC%含量相同的情况下
GC%愈高 → Tm值愈大
GC%愈低 → Tm 值愈小
AT形成变性核心，变性加快,Tm 值小
碱基排列对 Tm值具有明显影响 （除变性核心外）
5? CG 3?
GC n
5? GC 3?
CG n
5? TA 3?
AT n
5? AT 3?
TA n
碱基堆积面 和 碱基积压程度的差异
例：常温下，活体内 D.S DNA分子中富含 AT的变性
核心区（ promoter,terminator region ）
常表现氢键的断裂与形成的, DNA呼吸现象,
37.6 ℃ 57 ℃
Tm
＞＞
＜＜
碱基排列对 Tm值具有明显影响
☆ 大片段 D.S DNA分子之间比较
片段长短对 Tm值的影响较小,但与组成和排列相
关
☆ 小于 100bp 的 D.S DNA分子比较
片段愈短,变性愈快,Tm值愈小
☆ 变性液中含有尿素，酰胺等
尿素，酰胺与碱基间形成氢键
改变碱基对间的氢键
Tm 值 可降至 40℃ 左右
☆ 盐浓度的影响
单链 DNA主链的磷酸基团
负电荷的静电斥力
两条单链 DNA的分离
Na+在磷酸基团周围形成的电子云
对静电斥力产生屏蔽作用 减弱静电斥力
Tm ↑
当 Na+浓度低 屏蔽作用小 斥力加强 Tm ↓
Tm
OD
A260
静电斥力
0.01M 0.1M 1.0M
Na+
当 Na+浓度高
屏蔽作用大 斥力减弱
熵值 (△ S)上升碱基溶解性降低
疏水作用力增加
pH ~ 12 酮基 → 烯醇基
pH ~ 2-3 NH2 → NH 3+ (质子化 )
改变氢键的形成与结合力
☆极端 pH条件的影响
一切减弱氢键,碱基堆积力的因素
均将使 Tm 值降低
四 核酸的复性
1.复性 (renaturation)
DNA水溶液加热变性时, 双螺旋两条链分开；如
果缓慢冷即, 两条链可以完全重新结合成各原来一
样的双股螺旋过程 。
复性是变性的逆转。但需要一定的条件，要在
一定的盐浓度下缓慢降温。
核酸的理化性质
DNA 分子的复性 (anneal or renaturation)
D.S DNA S.S DNA
Denaturation ▲
▼ Renaturation
复性过程依赖于单链分子间的随机碰撞
( Depends on the collision of complementary S.S,DNA )
2,减色效应 (hypochromic effect)
当变性的 DNA经复性以重新形成双螺旋结构时，
其溶液的 A260值则减小，这种现象称为减色效应。
核酸的理化性质
四 核酸的复性
影响 DNA复性过程的因素,
● 阳离子浓度
0.18 ~ 0.2M Na+ 可消除 polydNt 间的静电斥力
● 复性反应的温度 Tm - 25℃ (60-65℃ )
以消除 S.S,DNA 分子内的部分二级结构
● S.S,DNA 的初始浓度 C0
● DNA 分子中,dNt 的排列状况 (随机排列,重复排列 )
● S.S,DNA分子的长度
S.S,DNA愈长
S.S,DNA愈短
→ 分子扩散愈慢 → 复性愈慢
→ 分子扩散愈快 → 复性愈快
复性发生的过程讨论
遵循 second – order kinetics formula （ 二级反应动力学）
dCt / dt = -KCt2
● 两条部分同源的 S.S,DNA,在复性过程中形成的部分
双链区是不稳定的
● 单链 DNA的随机碰撞 过程（ randomly collision ）
反应初始 t = 0
单链 DNA浓度 = C0
反应达 t 时
单链 DNA浓度 = Ct
dCt / dt = -KCt2 积分
Ct / C0 = 1 / 1+KC0t
当 Ct / C0 = 1/2 时
Ct / C0 = 1/2 = 1 / 1+ KC0t(1/2)
K = 1 / Cot(1/2)
Cot(1/2) = 1/K (mol,Sec / L)
● 不同的 DNA Cot ? 是不同的,Cot ?不但与
K值有关，也与 DNA的复杂性有关；
● K值取决于阳离子浓度、温度、片断大小及
DNA分子复杂性；
● 如果将其它因子固定，则 K与复杂性 X的关
系为：
K=1/X,所以,Cot ? =1/K =X：
Cot(1/2) = 1/K (mol,Sec / L)
● 复杂性 (X)----DNA中没有重复碱基的排列顺
序的数值。
e.g,(A)n,X =1; (AT)n,X =2; (AGC)n,X =3;
(AGCT)n,X =4; (AGCTG)n,X =5;
● Cot ? 代表 DNA顺序的复杂程度。
Cot(1/2) = 1/K (mol,Sec / L)
3,分子杂交 (hybridization)
核酸的理化性质
四 核酸的复性
? 不同来源的单链 DNA与单链 DNA
RNA与 单链 DNA分子间
? 在长于 20 bp的同源区域内
? 以氢键连接方式互补配对
? 形成稳定的双链结构的过程
3,分子杂交 (hybridization)
核酸的理化性质
四 核酸的复性
DNA链在复性时, 其中的一条单链可以内异体
DNA单链, 按照碱基互补原则合成一段 DNA-DNA或
DNA-RNA双链的过程 。
3,分子杂交 (hybridization)
核酸的理化性质
四 核酸的复性
杂交检测
D.S,DNA
X-film
Column
absorb
D.S DNA
p32 or biotin
labeled
S.S,DNA ( as probe)×→ S.S,DNA
种类
＊ 液相分子杂交
Absorb D.S,DNA
＊固相分子杂交 （ 1975 E,M,Southern）
1975 E,M,Southern
1977,J.C,Alwine
1978,Hany Towbin
＊ 原位分子杂交 (In situ hybridization )
Southern blot
Northern blot
Western blot
S.S,DNA × S.S,DNA
S.S,RNA × S.S,DNA
Protein × antibody
Southern Blotting
Northern Blotting
Western Blotting
五 DNA 一 级 结 构 分 析
（ DNA sequencing ）
1972,Herbert Boyer
限制性核酸内切酶 II (RE-II)
1975,Sanger C.
“＋,—” 法
1977,Maxam Gilbert
化学定序法
1977,Sanger C.
ddNTP(酶 )法
1,历史
(1) Chemical sequencing
G系统； pH 8.0
硫酸二甲酯 → G → m 7G →C8~N9 断裂 → 脱 G
A+G系统； pH 2.0
哌啶甲酸 （ pidine） → 嘌呤环 N质子化 → 脱嘌呤
C系统； 1.5 mol/L NaCl
C + 肼（ hydrazine） → 脱 C
T + C系统；
肼 (hydrazine) → 打开嘧啶环 → 重新 5C环化 → 脱嘧啶
2,方法
Chemical sequencing
G系统 脱 G
A+G系统 脱嘌呤
C系统 脱 C
T + C系统 脱嘧啶
A
A
C
A
G
C
T
T
C
A
(2) 双脱氧法
H H
N
4ddNTP系统中
DNA链均终止
在 ddNTP(二脱
氧核苷酸 )
ddATP ddCTP ddTTP ddGTP
A C T G
C
T
G
A
C
T
T
C
G
A
C
A
A
六 DNA的甲基化（ Methylation）
(m5C in Eukaryote)
m5C
1,DNA中 m5C的特点
● 对 MspI,HpaII 位点的高频修饰
MspI HpaII
CmC GG
C CmGG +
HNH
H
4
1
5 3
6 2 O
H
N
N
CH3
修饰核糖右下角,Am
碱基左上角,m22,7G
举例,
a,DNA
m5dC — 5-甲基脱氧胞苷；
m6dA — N6-甲基脱氧腺苷；
n2dA — 2-氨基脱氧腺苷。
2,甲基化的方式
b,RNA
m1A — 1-甲基腺苷
m6A — N6-甲基腺苷
m26A — N6,N6-二甲基腺苷
m6Am—N6,2'-O-二甲基腺苷
3 Function of m5C
? 细胞分化，组织特化，阶段发育，组织培养过程的脱分
化与 m5C的相关性（ 5-氨胞苷去甲基化的作用）
? m5C---甲基化是生物自我保护的机制
? m5C 的不足 基因表达相关
m5C的丰富 基因关闭相关
m5C 的程度具有明显的组织，细胞的特异性 (时空性 )
(杂种优势理论的研究 ……)
? m5C-----使 Z-DNA在体内趋于稳定状态
● m5C 与基因突变的关系
C → m5C → T → gene mutation (癌变 )
HNH
5
O
C
G
CH3
5
HNH
O
O
CH3
5
O
氧化脱氨
m5C
G
T
A
本章结束
