第七章 核酸分子杂交
核酸分子杂交是指具有一定同源序列的两条核酸
单链在一定条件下按碱基互补配对原则退火形成异
质双链的过程,即来源不同的两条单链核酸分子通过
碱基互补可形成异源双螺旋, 称为核酸分子杂交
(hybridization)。 具有灵敏度高, 特异性强等优点,
主要用于特异 DNA或 RNA的定性, 定量检测 。
?第一节 核酸分子杂交的基本原理
?第二节 核酸探针
?第三节 核酸分子杂交技术
第一节 核酸分子杂交的基本原理
DNA和 DNA链, RNA与 DNA链或两条 RNA链之间,
只要具有一定的互补序列均可在适当的条件下发生杂
交 。 常用已知的 DNA或 RNA的片段作为探针, 包括
特异的 DNA序列, 或转录的 RNA序列或 cDNA序列,
或人工合成的寡核苷酸片段 。
根据支持物的不同，分为固相杂交和液相杂交。
固相杂交又包括膜上印迹杂交和细胞原位杂交两种。
膜上印迹杂交即将核酸从细胞中分离纯化后，在体外
与探针杂交，细胞原位杂交是在细胞内进行的杂交。
第二节 核酸探针
核酸探针是指带有放射性同位素, 生物素或其他
活性物质标记的某种特定的 DNA或 RNA片段 。
一, 核酸探针的类型
㈠ 基因组 DNA探针
用克隆化的基因片段作探针应尽可能选用基因的编
码序列 (外显子 )。
㈡ cDNA探针
与 mRNA互补的 DNA链称 cDNA,特异性高，是
一种较理想的核酸探针。
㈢ RNA探针
RNA探针有下述优点,
① 杂交体的稳定性高, 杂交反应条件严格, 特异性更
高 。
② RNA单链不存在双链 DNA探针的互补双链的复性,
杂交效率较高 。
③ RNA无高度重复序列, 非特异杂交少 。
④ 杂交后用 RNase消化未杂交的 RNA探针, 可降低杂
交本底 。
㈣ 寡核苷酸探针
寡核苷酸探针是由实验者设计, 经核苷酸合成仪人工
合成的 。
1.探针制备方便, 可以根据需要设计合成各种寡核苷
酸片段, 从基因组 DNA文库或 cDNA文库中筛选特定
的克隆 。
2.非常适用于检测已知序列基因中的点突变或定点诱
变技术产生的点突变 。
3.用新的酶促方法标记可以得到高比活度标记探针 。
二, 标记物
标记物与探针的结合不影响杂交的特异性和稳定性 。
㈠ 放射性同位素
放射性同位素探针标记物, 有高度特异性, 缺点是易
造成放射性污染, 半衰期较短, 不能长期存放 。 常用
的有 32P,3H,35S,有时也用 14C,125I或 131I。
㈡ 非放射性标记物
(1) 半抗原
(2) 配体
(3) 荧光素
(4) 化学发光技术
三, 探针放射性同位素标记法
㈠ 放射性同位素的选择
32P,35S或 3H均可用于标记 DNA或 RNA。 32P最常用
于核酸的标记 。 35S适用于原位杂交和 DNA序列测定 。
3H放射比活度低, 故常用于原位杂交 。
㈢ 放射自显影检测杂交信号
利用放射线在 X线片的成影作用来检测杂交信号, 称
为放射自显影 。 这种方法的操作步骤如下,
(1) 将滤膜用保鲜膜包好, 置于暗盒中 。
(2) 在暗室中, 将磷钨酸钙增感屏前屏置滤膜上, 光
面向上, 压 1~2张 X线片, 而后再压上增感屏后屏,
光面向 X线片, 盖上暗盒, 置于 70℃, 曝光适当的时
间 。
(3) 根据放射线的强度曝光一定的时间后, 在暗室里
取出 X线片, 显影定影 。 如曝光不足, 可再压片重新
曝光 。
第三节 核酸分子杂交技术
在液体中进行杂交反应称为液相杂交；在固相支持
物上进行杂交则称为固相杂交 。
固相杂交包括膜上印迹杂交和细胞原位杂交两类 。
固相杂交是印迹技术及杂交信号检测技术等相结合,
从而获得清晰的杂交图谱, 有利于定性或定量分析待
测核酸样品中的特定片段 (靶序列 ),在核酸的结构和
功能研究以及基因工程研究中, 其应用比液相杂交更
为广泛, 其技术发展也更为迅速 。
一, 膜上印迹杂交
膜上印迹杂交是指将待测核酸序列结合到一定的
支持物上，然后与存在于液相中的核酸探针进行杂交
的过程，是目前最常用的一种核酸分子杂交方法。
㈠ 滤膜杂交的基本过程 如图 7-8所示 。
(1) 核酸的制备
(2) 电泳
(3) 印迹
(4) 预杂交
(5) 杂交
(6) 洗膜
(7) 检测
㈡ 固相支持物的选择
一种良好的固相支持物应具备以下几个特点,
(1) 具有较强的结合核酸分子的能力, 一
(2) 与核酸分子结合后应不影响其与探针分子的
杂交反应 。
(3) 与核酸分子的结合稳定牢固,
(4) 非特异性吸附少 。
(5) 具有良好的机械性能 。
下面介绍几种常用的固相支持物,
(1) 硝酸纤维素膜：特别适用于蛋白质 (如抗体和酶等 )
的非放射性标记探针的杂交体系 。
(2) 尼龙膜 (nylon membrane)：尼龙膜结合单链及双链
DNA和 RNA的能力较硝酸纤维素膜更强, 耐碱处理适
合于一步法的菌落原位印迹法 。
尼龙膜的缺点是不宜使用非同位素探针, 即使用各种
蛋白 (如 BSA,牛奶等 )进行预杂交, 产生的杂交信号
本底较高, 与非特异吸附有关 。
PVDF膜：比尼龙膜结合力更强，且在预杂交中很容
易被封闭，使用同位素和非同位素探针都可产生较浅
的本底，而且结实耐用，可以多次杂交。
㈢ 印迹方法
⒈ 虹吸印迹法 (图 7-9)
利用毛细管的虹吸作用由转移缓冲液带动核酸分
子转移至滤膜上 。
⒉ 真空转移法 (图 7-10)
其原理是利用真空泵将转移缓冲液从上层容器中
通过凝胶抽到下层真空室中，同时带动核酸分子转
移到凝胶下面的滤膜上。该法的最大优点是快速，
转膜的同时进行 DNA的变性和中和，整个过程只需
1h左右。
⒊ 电转法如图 7-11所示。
㈣ 印迹类型
Southern印迹杂交法 (Southern blot hybridization)(图
7-12)。
2,Northern印迹杂交 (Northern blot hybridization),
Northern杂交是将 RNA样品变性和通过琼脂糖
凝胶电泳进行分离，再转移到硝酸纤维素膜等固相
载体上，用标记的 DNA或 RNA特异探针对固定在膜
上的 RNA进行杂交。其基本原理与 Southern杂交相
同，只不过变性方法不能采用碱变性法，因为碱导
致 RNA水解，一般采用聚乙二醛和二甲基亚砜、甲
醛、甲基氢氧化汞等变性方法。
3.斑点杂交 (dot hybridization)：直接将变性 DNA样
品点于硝酸纤维素膜上，固定好后先预杂交，再与
标记探针杂交，然后通过高严谨性冲洗 (低盐高温 )，
降低本底和提高特异性。预杂交和杂交可在密封袋
中进行，密封袋比较方便，反应体积小，可以使用
高浓度探针，封口前去除气泡，使杂交液与膜充分
接触，反应体积以膜不贴壁、能浮动为宜。探针与
同源样品杂交后，阳性结果产生斑点，故称斑点杂
交。
4.反向斑点杂交 (reverse dot hybridization)：直接将不
同的探针点印并固定在膜上, 再将待测的 DNA样品与
之杂交, 这样一次杂交反应就可以判断待测 DNA是否
含有这些探针的同源序列 。
5.菌落或噬菌斑杂交 (图 7-13)。
二, 核酸原位杂交
用标记的已知核酸序列为探针, 使其与细胞或组
织切片中核酸进行杂交检测的方法称为核酸原位杂
交 (nucleic acid hybridization in situ)
一般的原位杂交有两种类型：与胞内 DNA的杂交和
与 RNA的杂交 。
三, 液相杂交技术
液相杂交是指待测的核酸和标记的探针同时溶于
杂交液中进行反应, 然后分离杂交双链和未参加反
应的标记探针, 再进行检测 。
核酸分子杂交是指具有一定同源序列的两条核酸
单链在一定条件下按碱基互补配对原则退火形成异
质双链的过程,即来源不同的两条单链核酸分子通过
碱基互补可形成异源双螺旋, 称为核酸分子杂交
(hybridization)。 具有灵敏度高, 特异性强等优点,
主要用于特异 DNA或 RNA的定性, 定量检测 。
?第一节 核酸分子杂交的基本原理
?第二节 核酸探针
?第三节 核酸分子杂交技术
第一节 核酸分子杂交的基本原理
DNA和 DNA链, RNA与 DNA链或两条 RNA链之间,
只要具有一定的互补序列均可在适当的条件下发生杂
交 。 常用已知的 DNA或 RNA的片段作为探针, 包括
特异的 DNA序列, 或转录的 RNA序列或 cDNA序列,
或人工合成的寡核苷酸片段 。
根据支持物的不同，分为固相杂交和液相杂交。
固相杂交又包括膜上印迹杂交和细胞原位杂交两种。
膜上印迹杂交即将核酸从细胞中分离纯化后，在体外
与探针杂交，细胞原位杂交是在细胞内进行的杂交。
第二节 核酸探针
核酸探针是指带有放射性同位素, 生物素或其他
活性物质标记的某种特定的 DNA或 RNA片段 。
一, 核酸探针的类型
㈠ 基因组 DNA探针
用克隆化的基因片段作探针应尽可能选用基因的编
码序列 (外显子 )。
㈡ cDNA探针
与 mRNA互补的 DNA链称 cDNA,特异性高，是
一种较理想的核酸探针。
㈢ RNA探针
RNA探针有下述优点,
① 杂交体的稳定性高, 杂交反应条件严格, 特异性更
高 。
② RNA单链不存在双链 DNA探针的互补双链的复性,
杂交效率较高 。
③ RNA无高度重复序列, 非特异杂交少 。
④ 杂交后用 RNase消化未杂交的 RNA探针, 可降低杂
交本底 。
㈣ 寡核苷酸探针
寡核苷酸探针是由实验者设计, 经核苷酸合成仪人工
合成的 。
1.探针制备方便, 可以根据需要设计合成各种寡核苷
酸片段, 从基因组 DNA文库或 cDNA文库中筛选特定
的克隆 。
2.非常适用于检测已知序列基因中的点突变或定点诱
变技术产生的点突变 。
3.用新的酶促方法标记可以得到高比活度标记探针 。
二, 标记物
标记物与探针的结合不影响杂交的特异性和稳定性 。
㈠ 放射性同位素
放射性同位素探针标记物, 有高度特异性, 缺点是易
造成放射性污染, 半衰期较短, 不能长期存放 。 常用
的有 32P,3H,35S,有时也用 14C,125I或 131I。
㈡ 非放射性标记物
(1) 半抗原
(2) 配体
(3) 荧光素
(4) 化学发光技术
三, 探针放射性同位素标记法
㈠ 放射性同位素的选择
32P,35S或 3H均可用于标记 DNA或 RNA。 32P最常用
于核酸的标记 。 35S适用于原位杂交和 DNA序列测定 。
3H放射比活度低, 故常用于原位杂交 。
㈢ 放射自显影检测杂交信号
利用放射线在 X线片的成影作用来检测杂交信号, 称
为放射自显影 。 这种方法的操作步骤如下,
(1) 将滤膜用保鲜膜包好, 置于暗盒中 。
(2) 在暗室中, 将磷钨酸钙增感屏前屏置滤膜上, 光
面向上, 压 1~2张 X线片, 而后再压上增感屏后屏,
光面向 X线片, 盖上暗盒, 置于 70℃, 曝光适当的时
间 。
(3) 根据放射线的强度曝光一定的时间后, 在暗室里
取出 X线片, 显影定影 。 如曝光不足, 可再压片重新
曝光 。
第三节 核酸分子杂交技术
在液体中进行杂交反应称为液相杂交；在固相支持
物上进行杂交则称为固相杂交 。
固相杂交包括膜上印迹杂交和细胞原位杂交两类 。
固相杂交是印迹技术及杂交信号检测技术等相结合,
从而获得清晰的杂交图谱, 有利于定性或定量分析待
测核酸样品中的特定片段 (靶序列 ),在核酸的结构和
功能研究以及基因工程研究中, 其应用比液相杂交更
为广泛, 其技术发展也更为迅速 。
一, 膜上印迹杂交
膜上印迹杂交是指将待测核酸序列结合到一定的
支持物上，然后与存在于液相中的核酸探针进行杂交
的过程，是目前最常用的一种核酸分子杂交方法。
㈠ 滤膜杂交的基本过程 如图 7-8所示 。
(1) 核酸的制备
(2) 电泳
(3) 印迹
(4) 预杂交
(5) 杂交
(6) 洗膜
(7) 检测
㈡ 固相支持物的选择
一种良好的固相支持物应具备以下几个特点,
(1) 具有较强的结合核酸分子的能力, 一
(2) 与核酸分子结合后应不影响其与探针分子的
杂交反应 。
(3) 与核酸分子的结合稳定牢固,
(4) 非特异性吸附少 。
(5) 具有良好的机械性能 。
下面介绍几种常用的固相支持物,
(1) 硝酸纤维素膜：特别适用于蛋白质 (如抗体和酶等 )
的非放射性标记探针的杂交体系 。
(2) 尼龙膜 (nylon membrane)：尼龙膜结合单链及双链
DNA和 RNA的能力较硝酸纤维素膜更强, 耐碱处理适
合于一步法的菌落原位印迹法 。
尼龙膜的缺点是不宜使用非同位素探针, 即使用各种
蛋白 (如 BSA,牛奶等 )进行预杂交, 产生的杂交信号
本底较高, 与非特异吸附有关 。
PVDF膜：比尼龙膜结合力更强，且在预杂交中很容
易被封闭，使用同位素和非同位素探针都可产生较浅
的本底，而且结实耐用，可以多次杂交。
㈢ 印迹方法
⒈ 虹吸印迹法 (图 7-9)
利用毛细管的虹吸作用由转移缓冲液带动核酸分
子转移至滤膜上 。
⒉ 真空转移法 (图 7-10)
其原理是利用真空泵将转移缓冲液从上层容器中
通过凝胶抽到下层真空室中，同时带动核酸分子转
移到凝胶下面的滤膜上。该法的最大优点是快速，
转膜的同时进行 DNA的变性和中和，整个过程只需
1h左右。
⒊ 电转法如图 7-11所示。
㈣ 印迹类型
Southern印迹杂交法 (Southern blot hybridization)(图
7-12)。
2,Northern印迹杂交 (Northern blot hybridization),
Northern杂交是将 RNA样品变性和通过琼脂糖
凝胶电泳进行分离，再转移到硝酸纤维素膜等固相
载体上，用标记的 DNA或 RNA特异探针对固定在膜
上的 RNA进行杂交。其基本原理与 Southern杂交相
同，只不过变性方法不能采用碱变性法，因为碱导
致 RNA水解，一般采用聚乙二醛和二甲基亚砜、甲
醛、甲基氢氧化汞等变性方法。
3.斑点杂交 (dot hybridization)：直接将变性 DNA样
品点于硝酸纤维素膜上，固定好后先预杂交，再与
标记探针杂交，然后通过高严谨性冲洗 (低盐高温 )，
降低本底和提高特异性。预杂交和杂交可在密封袋
中进行，密封袋比较方便，反应体积小，可以使用
高浓度探针，封口前去除气泡，使杂交液与膜充分
接触，反应体积以膜不贴壁、能浮动为宜。探针与
同源样品杂交后，阳性结果产生斑点，故称斑点杂
交。
4.反向斑点杂交 (reverse dot hybridization)：直接将不
同的探针点印并固定在膜上, 再将待测的 DNA样品与
之杂交, 这样一次杂交反应就可以判断待测 DNA是否
含有这些探针的同源序列 。
5.菌落或噬菌斑杂交 (图 7-13)。
二, 核酸原位杂交
用标记的已知核酸序列为探针, 使其与细胞或组
织切片中核酸进行杂交检测的方法称为核酸原位杂
交 (nucleic acid hybridization in situ)
一般的原位杂交有两种类型：与胞内 DNA的杂交和
与 RNA的杂交 。
三, 液相杂交技术
液相杂交是指待测的核酸和标记的探针同时溶于
杂交液中进行反应, 然后分离杂交双链和未参加反
应的标记探针, 再进行检测 。
