第八章 聚合酶链反应
1985年 PE-cetus公司的人类遗传研究室 Mullis等人发
明了具有划时代意义的聚合酶链式反应 (polymerase chain
reaction,PCR)。 此技术能够特异地扩增任何所希望的目
的基因或 DNA片段 。 在基础和临床医学, 法医, 考古等
方面有重要的应用价值, 并对分子生物学技术的发展给予
巨大的推动 。
?第一节 PCR原理与特点
?第二节 PCR类型
?第三节 PCR技术在医学上的应用
一, PCR的基本原理
在试管中给 DNA的体外合成提供一种合适条件 —— 模板 DNA，
寡核苷酸引物, DNA聚合酶, 合适的缓冲液系统和 DNA变性, 复
性及延伸的温度与时间等, 使目的 DNA得以迅速扩增 (图 8-1)。
㈠ DNA模板变性
双链 DNA是通过 94℃ 左右的高温使其发生变性, 形成
单链 DNA。
㈡ 模板与引物退火
将合成的两个寡核苷酸引物分别与待扩增 DNA两端的
序列互补 。 通过控制退火条件, 引物就能准确地与扩增区
域的两端配对 。
㈢ 引物延伸
在 4种 dNTP底物及 Mg2+存在条件下, DNA聚合酶在最
适作用温度可将单核苷酸从引物 3′端掺入, 沿模板延伸合
成新股 DNA,每一循环的产物可作为下一循环的模板 。
以上所述的变性, 退火, 延伸, 三步曲, 被确定为
PCR的一轮循环, 整个 PCR过程一般需进行三十轮的循
环 。
按 2n的指数方式递增, PCR扩增量应达到 230个拷贝,
,平台效应, 出现的迟早主要取决于起始模板的拷贝数,
所用的 DNA聚合酶的性能及底物 dNTP的浓度等多种因素 。
二, PCR技术的特点
㈠ 高度的敏感性
PCR产物的生成是以指数方式增加的, 即使按 75%的
扩增效率计算, 单拷贝基因经 25次循环后, 其基因拷贝数
也在 100万以上, 即可将极微量 (pg级 )DNA扩增到紫外光
下可见的水平 (?g级 )。
㈡ 高度的特异性
PCR扩增的特异性在很大程度上依赖于引物与模板的
互补程度, 即引物与模板结合的正确性 。
㈢ 操作简便, 快速
㈣ 适用样品广泛
含微量 (pg,ng)目的 DNA或 RNA的样品即可用作反应
的起始材料。
三, 常规的 PCR操作
㈠ 反应体系
标准 PCR反应体积为 50~100?l,其中含有,1?PCR
反应缓冲液, 四种 dNTP (dATP,dCTP,dGTP,
dTTP),二种上, 下游引物, DNA模板, Taq DNA聚合
酶 。
㈡ 反应步骤
四, PCR反应条件的优化
㈠ 模板核酸
PCR可以用 DNA或 RNA模板材料 。 但用 RNA模板的
扩增需首先逆转录成 cDNA后才能进行正常 PCR循环 。
㈡ 引物
引物是指与待扩增靶 DNA两端序列互补的寡核苷酸,
两段引物分别与相应的一条 DNA链 3’端及 5’端互补 。
引物设计一般遵循下列原则,
(1) 引物的序列应选定基因组 DNA的高度保守区, 以减少
引物与基因组的非特异结合, 提高反应的特异性 。
(2) 引物的长度以 15~40bp为宜 。
(3) 引物的碱基尽可能随机分布, 避免出现数个嘌呤或嘧
啶的连续排列, G+C碱基的含量在 40%~75%之间 。
(4) 引物内部应避免形成二级结构, 特别是引物的末端应
无回文结构 。
(5) 二个引物之间不应有互补序列, 以免形成, 引物二聚
体,, 浪费引物 。
(6) 引物 5′末端碱基无严格限制, 在与模板结合的引物长
度足够的条件下, 其 5′端碱基互补程度无严格限制 。
(7) 引物 3′端的头 1~2个碱基会影响 Taq DNA聚合酶的延
伸效率, 从而影响 PCR反应的扩增效率及特异性, 因此选
择合适的 3′端碱基很重要 。 最好选 T,C,G,不选 A
(8) 引物的 3′端应为保守氨基酸序列，即采用简并密码少
的氨基酸如 Met,Trp，且要避免三联体密码第 3个碱基的
摆动位置位于引物的 3′末端。
㈢ 耐热 DNA聚合酶
Taq DNA酶有良好的热稳定性, Taq DNA聚合酶在
70~75℃ 时具有最高的生物学活性 。
㈣ 脱氧核苷三磷酸
脱氧核苷三磷酸 (dNTP)是 dATP, dCTP, dGTP 和
dTTP的总称, 是靶 DNA序列扩增的原料 。 dNTP浓度取
决于扩增片段的长度, MgCl2浓度, 引物浓度等反应条件 。
㈤ 缓冲液
目前最为常用的缓冲液体系为 10~50mmol/L Tris-HCl
(pH 8.3~8.8,20℃ )。
㈥ Mg2+
Mg2+浓度过低会使 Taq酶活性丧失, PCR产量下降；
Mg2+浓度过高则影响 PCR反应的特异性 。
㈦ 添加剂
PCR反应中加入一定浓度的添加剂如 DMSO (二甲基
亚砜 )等可提高 PCR扩增效率及特异性
㈧ PCR循环数
30次是比较合理的循环次数, 循环次数太少, 产物的量
不多；循环次数过多, 则非特异性产物增加 。
㈨ PCR易发生的问题及解决方法
⒈ 没有得到所希望的 PCR产物 (假阴性 )
⒉ 所有样品均为阳性 (假阳性 )
⒊ PCR产物呈片状
⒋出 现非特异扩增
第二节 PCR类型
一, 不对称 PCR(asymmetric PCR)
不对称 PCR的目的是扩增产生特异长度的单链 DNA。
PCR反应中采用二种不同浓度的引物, PCR结果产生大
量单链 DNA。 因 PCR反应中使用的二种引物浓度不同一
步法, 因此称不对称 PCR,此法产生的单链 DNA可用作
杂交探针或 DNA测序的模板 。
进行不对称 PCR有二种方法,(1) 一步法 ;(2) 两步法,
第一次 PCR用等浓度的引物, 以期获得较多的目的 DNA
片段, 取第一次扩增产物 (含双链 PCR片段 )用单引物进行
第二次 PCR扩增产生单链 DNA。
二, 逆转录 PCR (reverse transcription PCR,RT-PCR)
RT-PCR先在逆转录酶的作用下以 mRNA为模板合成
cDNA,再以 cDNA为模板加入 dNTP和两种特异引物及
Taq酶进行 PCR反应, 这样低丰度的 mRNA被扩增放大易
于检测 。
RT-PCR中的关键步骤是 RNA的逆转录, 要求 RNA模
板必须是完整的, 且不含 DNA,蛋白质等杂质 。
三, 锚定 PCR(anchored PCR,A-PCR)
该法的基本原理是在基因未知序列端添加同聚物尾,
人为赋予未知基因末端序列信息, 再用人工合成的与多聚
尾互补的引物作为锚定引物, 在与基因配对互补结合后进
行 PCR扩增 （ 图 8-2） 。
四, 反向 PCR (inverse PCR,IPCR)
IPCR是扩增未知序列的一种简捷方法 。 其基础是：用限
制性内切酶消化 DNA,然后环化切割的产物, 再用切割
后已知序列上两端相反方向的引物序列进行 PCR (图 8-3)，
也可将环化 DNA线性化后再进行 PCR。
五, 随机引物 PCR (arbitrary primer PCR,AP-PCR)
RAPD建立在 PCR基础之上，它是利用一系列不同的
随机排列的寡核苷酸链 (通常为十聚体 )为引物，对所研究
基因组 DNA进行 PCR扩增，扩增产物通过聚丙烯酰胺或
琼脂糖凝胶电泳分离，经 EB染色来检测扩增 DNA片段多
态性。可用于进行基因组指纹图谱的构建，并利用指纹图
谱进行品种鉴定和对物种进行亲缘关系和系统进化的研究。
六, 差异显示 RT-PCR(differential display RT-PCR,DDRT-
PCR)
DDRT-PCR技术最大的优点是省去了 cDNA克隆和随后繁杂的克
隆筛选工作 。 但此方法也存在需要合成的引物多, 费用大, 操作技
术要求高, 虚假特异区带出现较多等缺点, 仍有待进一步完善 。 如
图 8-4。
七, 单链构象多态性 PCR (single strand construction
polymor-phism PCR,SSCP-PCR)
其原理是单链 DNA分子因单一核苷酸不同, 其二级结
构有所差异, PCR产物常表现在非变性凝胶电泳中电泳迁
移率不同 。 通过比较 DNA的电泳类型, 即可测出突变 。
其优点是所需样品 DNA量极少, 灵敏度高, 可检测出点
突变, 以及插入, 缺失突变, 能一次筛选多个样品 。
八, 俘获 PCR
一种生物素标记的同已知序列互补的引物首先通过线
性扩增延伸 。 而后, 生物素标记的延伸产物, 可被已包被
链霉抗生素蛋白的固体支持物选择性地俘获 。 经几次洗涤,
可去除所有未生物素化的 DNA分子, 经过这一步纯化,
再进行指数扩增可大大降低非特异性扩增背景 。
九, 多重 PCR (multiplex PCR)
多重 PCR是在同一反应中采用多对引物同时扩增几个不同的
DNA片段；如果被测基因某一区段缺失, 则相应的电泳图谱上此区
段 PCR扩增产物长度减少或消失, 从而发现基因异常 (图 8-5)。 多重
PCR具有灵敏, 快速特点, 特别适用检测单拷贝基因缺失, 重排,
插入等异常改变, 其结果与 Southern杂交结果同样可靠, 且多重
PCR尚可检测小片段缺失 。
十, 着色互补 PCR (color complementation PCR)
该法的原理是用不同的荧光染料标记不同引物的 5′端,
如 JoE,TAMRA及 CouM等染料分别呈红, 绿, 蓝荧光 。
进行复合 PCR,合成的目的 DNA片段分别带有引物 5′端染
料的颜色以此来判定扩增产物的结果, 若某一 DNA区带
缺失, 则无对应染料标记的产物, 据此可判定基因异常或
发现感染的病毒等 。
十一, 巢居 PCR (nested PCR,N-PCR)
N-PCR是设计两对引物, 一对引物对应的序列在模
板的外侧, 称外引物 (outer-primer),另一对引物互补序
列在同一模板的外引物的内侧, 称内引物 (inter-primer)，
即外引物扩增产物较长, 含有内引物扩增的靶序列, 这样
经过二次 PCR放大可将单拷贝的目的 DNA片段检出 。
十二, 半巢居 PCR (heminested PCR,Hn PCR)
Hn PCR是巢居 PCR与不对称 PCR的结合, Hn PCR是
先用等量的外引物扩增, 再用一个内引物扩增, 产生大量
单链内引物的产物, Hn PCR比巢居 PCR节省一个引物,
又比不对称 PCR的特异性及敏感性好 。
十三, 二温式 PCR
标准 PCR的一轮循环是由变性, 退火, 延伸三步组成
的, 在不影响 PCR反应特异性和敏感性前提下, 可将退火,
延伸温度合并为一个温度, 采用二温式 PCR,即 94℃ 变性,
65?~68?退火延伸, 这样既保证引物与模板结合特异性,
又可使引物顺利延伸, 与标准 PCR相比, 二温式 PCR操
作更简便, 快速, 特别适于临床检验 。
十四, 增敏 PCR (booster PCR,BPCR)
其基本方法是将标准 PCR 30轮循环分两次进行, 第一
次引物浓度仅为数十 pmol/L,延长退火时间, 进行 20轮
循环后, 靶序列浓度大大提高, 再将引物浓度增至
0.1?mol/L,同时缩短退火时间, 再进行 20轮循环 。 用
BPCR检测 E coli BMI 195耐红霉素基因 (ere A),可检出粪
便标本中 1~10个菌 。
十五, 重组 PCR
㈠ 重组体的构建 （ 图 8-6所示 ）
它的原理在于巧妙地设计和利用寡核苷酸引物，共
进行二级 PCR反应。在初级的两个 PCR反应中，每对引
物中的一个引物 3′端与待重组基因互补,5′端与另一个待
重组基因互补，即在引物的 5′端加入一段序列作为接头。
分别进行 PCR，所得二种 PCR产物有部分重叠序列，混
合二种初级 PCR产物进行次级 PCR，经过变性和复性，
二种 PCR产物通过互补序列发生粘连，出现二种异双倍体
产物。其中一种产物的 3′末端单链可用 Taq DNA聚合酶延
伸，产生包含两个重叠产物全长的片段，作为 PCR反应的
模板。由此进行 PCR扩增可产生一个包含两种基因的重组
基因片段，该片段保持了密码子框架的正确性。
㈡ 突变体的构建
原理同重组体的构建相似。在靠近引物 5′端人为造成引物与模板
之间的碱基突变，插入或缺失。两个初级 PCR产物均有 PCR引物导
入的同样的突变序列，因此有部分重叠序列，将二个初级 PCR产物
混合进行次级 PCR，即可获得突变体片段如图 8-7所示。
十六, 表达 PCR (expression PCR)
表达 PCR则是一种更加简便的体外转录翻译的方法 。 表达 PCR
是重组 PCR的一种, 将启动子序列 (5′TAA TAC GAC TCA CTA TA
3′)和目的基因重组, 产生重组 DNA,PCR扩增含有启动子序列的
目的 DNA片段, 可直接进行体外转录产生功能性的蛋白质 。
十七, 竞争 PCR(competitive PCR)
该法的总策略是采用相同的引物, 同时扩增靶 DNA和已知浓度
的竞争模板, 竞争模板与靶 DNA大致相同, 但其内切酶位点或部分
序列不同, 用限制性内切酶消化 PCR产物或用不同的探针进行杂交
即可区分竞争模板与靶 DNA的 PCR产物, 因竞争模板的起始浓度是
已知的, 通过测定竞争模板与靶 DNA二者 PCR产物便可对靶 DNA
进行定量 。
十八, 原位 PCR (In-situ PCR)
在单个细胞中进行 PCR扩增，然后用特异探针进行原位杂交即
可检出含该特异序列的细胞。直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片
在单个细胞中进行 PCR扩增的方法称原位 PCR。
第三节 PCR技术在医学上的应用
一, PCR技术在法医学上的应用
PCR技术在法医学中的应用是检测人类白细胞抗原 -
DQ?位点的分型, 另外, Y染色体特异 DNA (DYZ1、
DYZ3) SRY基因的 PCR分析使性别鉴定成为常规 。
在 Y染色体上只要缺失 SRY,个体就发育成为女性 。
用针对 SRY基因和 X,Y同源序列的两对引物进行 PCR
扩增, 只有男性出现 299bp的扩增片段 。 用这种方法鉴别
胎儿, 运动员, 犯罪人员等的性别, 准确率极高 。
二, 遗传病相关基因的检测 如图 8-8所示 。
如果碱基突变的位置与某种限制性内切酶的识别位点相关, 突变
会产生新的或消除原有的内切酶位点, 那么用特定的限制性内切酶
消化 PCR产物, 通过电泳酶切图谱就能直接判断碱基发生突变与否 。
若某一遗传病与这一酶切位点的存在或消失有连锁关系, PCR-
RFLP即可用于该遗传病的诊断 。
㈠ 苯丙酮尿症
㈡ ??地中海贫血
㈢ 镰刀状红细胞贫血
㈣ 杜氏营养不良症
㈤ 血友病
三, 致病病毒的检测
㈠ 人类免疫缺陷病毒
人类免疫缺陷病毒 HIV-1是一种 RNA的逆转录病毒, 根
据其保守序列设计引物, 先用逆转录酶以 RNA为模板产
生 cDNA,再进行 PCR扩增 。 该法比分子杂交, 血清学等
诊断方法敏感性高, 且操作简便, 是诊断 HIV的最佳方法 。
PCR可用来追踪 HIV的自然感染史。可在其他血清学
和病毒学标志出现前检测病毒序列，从而判定无症状而且
血清阴性患者潜在的 HIV的传播性。
㈡ 肝炎病毒
1.乙型肝炎病毒 (hepatitis B virus,HBV)
直接检测临床标本中 HBV DNA序列的存在, 对确定患
者血液标本的感染性 。
2.丙型肝炎病毒 (hepatitis C virus,HCV)与戊型肝炎病毒
(hepatitis E virus,HEV)
HCV是单股正链 RNA病毒, 可采用逆转录 PCR结合巢
式 PCR法对急性丙型肝炎作出快速诊断 。
㈢ 单纯疱疹病毒
PCR可检测出 1 pg的 HSV-DNA，在 HSV感染诊断的应
用研究上发展很快，分型检测 HSV已成为发展趋势。
㈣ 人乳头瘤病毒
为了进行 HPV流行病学研究或宫颈癌高危人群筛选,
国内外已报道用共用引物 (general primer)一次可扩增多型
别 HPV。 若将共用引物 PCR与型特异性多重 PCR结合起
来, 就可以确定型别, 快速筛检相关肿瘤的高危人群 。 这
将大大节约时间, 经费, 对探讨 HPV致癌机制及宫颈癌
分子流行病学研究有理论和实际意义 。
四, 肿瘤的诊断和研究
㈠ 肿瘤的检测
人类一些血液系统的恶性肿瘤与特定的染色体易位
或基因重排有关, 这种易位, 重排扰乱了基因的正常
调控, 可导致原癌基因从相对静止状态变成激活状态 。
应用 PCR技术能发现微量存在有染色体易位的癌细胞,
如 PCR能发现白血病或淋巴瘤治疗缓解后 104~105正常
细胞中 1~5个肿瘤残留细胞 。 PCR为肿瘤的诊断, 预后
判断, 微量残留细胞监测提供了快捷, 正确的方法 。
㈡ 癌基因, 抑癌基因的检测
基因的缺失, 点突变是原癌基因激活, 抑癌基因失活的
方式之一 。 以往较大的基因缺失在显微镜下分析, 微小的
缺失多用印迹杂交技术, 目前用 PCR技术甚为简便 。
㈢ 肿瘤相关病毒基因的研究
近年来用 PCR技术对 HBsAg阴性的 PHC患者进行 HBV
DNA检测, 进一步证实了两者之间有密切关系 。
五, 感染性疾病病原体的诊断和研究
由于 PCR技术对样品要求不高，而检查的结果特异性
强、准确率高，因此，检测一些感染性疾病病原体，常规
方法无法进行时,PCR可轻而易举地解决问题。
