第十六章 基因诊断技术及其应用
基因诊断是利用 DNA分子杂交等分子生物学技
术，直接探查人体基因组 DNA存在的缺陷或是基
因表达产物的异常，从而对人体状态和疾病作出诊
断。基因诊断也称 DNA诊断或 DNA探针技术或基
因探针技术，是 20世纪 70年代末迅速发展起来的一
项应用技术。
快速灵敏、准确可靠的现代分子生物学技术是
基因诊断的先决条件。
?第一节 基因诊断的策略
?第二节 基因诊断的常用技术方法
?第三节 基因诊断的应用
第一节 基因诊断的策略
一, 基因突变的检测
当致病基因已和分子机制均确知时, 直接检测和
分析突变是分子诊断最有力和最准确的方法 。
基因突变检测法可检测基因大片段缺失和插入,
小片段缺失和插入, 点突变 (只有一种类型的点突
变, 或像 N-ras突变那样, 突变类型很多但只有一
两种占优势, 或发生在限制酶识别位点上使酶切位
点消失, 或发生在隐蔽位点上使酶切位点增加, 异
常基因重排和异常基因融合等的检测 。 较大片段用
Southern印迹法或 PCR法 。 单个外显子突变采用双
引物 PCR法, 多个外显子突变采用 multiplexPCR进
行电泳条带分析, 单个突变点采用 PCR-SSCP法 。
测 mRNA用 RT-PCR法 。
二, 基因连锁分析
由于同一染色体上相邻近的基因一起被遗传而相
互存在连锁关系, 在只知致病基因在染色体上的大
概位置而不知确切位置的情况下, 只要鉴定与致病
基因相连锁的有关基因的存在与否, 就可以判断受
检者是否带有致病基因 。 常采用限制性片段长度多
态性 （ RFLP） 遗传标志进行多态性分析 。
三, 感染性疾病外源基因的检测
这类检测一般根据已知病原生物基因组外源
DNA或 RNA顺序，采用 PCR或 RT-PCR的方法就
可以进行快速、简便而准确的诊断。因此，这类
疾病的基因诊断应用性极强，在严格掌握质控的
前提下，可在临床广泛运用。
四, 基因异常表达的检测
用 mRNA作标本，采用 RT-PCR法进行半定量和
定量分析判断基因表达异常。
第二节 基因诊断的常用技术方法
一, 核酸分子杂交技术
㈠ 限制性内切酶酶谱分析法 (图 16-1)
此方法是利用限制性内切酶和特异性 DNA探针
来检测是否存在基因变异 。 当待测 DNA序列中发
生突变时会导致某些限制性内切酶位点的改变,
其特异的限制性酶切片段的状态 (片段的大小或多
少 )在电泳迁移率上也会随之改变, 借此可作出分
析诊断 。
㈡ DNA 限 制 性 片 段 长 度 多 态 性 (restriction
fragnent length polymor- phism,RFLP)分析
在人类基因组中, 平均约 200对碱基可发生一对
变异 (称为中性突变 ),中性突变导致个体间核苷酸
序列的差异, 称为 DNA多态性 。 不少 DNA多态性
发生在限制性内切酶识别位点上, 酶解该 DNA片
段就会产生长度不同的片段, 称为限制性片段长
度多态性 。
㈢ 等位基因特异寡核苷酸探针 (allele specific
oligonucleotide,ASO)杂交法
根据已知基因突变位点的核苷酸序列, 人工合
成两种寡核苷酸探针, 一种是相应于突变基因碱
基序列的寡核苷酸 (M),一种是相应于正常基因碱
基序列的寡核苷酸 (N),用它们分别与受检者 DNA
进行分子杂交 。
二, 聚合酶链反应 (PCR) (图 16-2)
根据待测基因两端的 DNA顺序设计出一对引物,
经 PCR反应将目的基因片段扩增出来, 即可进一
步分析判断致病基因的存在与否, 并了解其变异
的形式 。
三、基因测序
分离出患者的有关基因，测定出其碱基排列
顺序，找出其变异所在，这是最为确切的基因诊
断方法。
第四节 基因诊断的应用
一, 基因诊断在恶性肿瘤中的应用
㈠ 恶性肿瘤的特异性基因诊断
在慢粒白血病中, 具有 t(9;22)染色体的易位及
所产生的 bcr-abl融合基因, 因此可用检测特殊融
合基因的方法进行某些白血病的诊断 。 在淋系白
血病中存在大的 Ig或 TCR基因的 V-(D)-J组合可作
为 B,T白血病的克隆标志 。 应用 Southern杂交或
PCR方法可检测这些标志 。
㈡ 恶性肿瘤相关基因分析
因此, 通过对肿瘤相关基因的分析如癌基因,
抑癌基因, 凋亡和抗凋亡基因缺失, 插入, 扩增
突变, 表达过量 。 同样可对临床起到鉴别诊断,
判断预后的作用, 如对儿童神经母细胞瘤, 神经
上皮瘤所进行的鉴别诊断 。
神经母细胞瘤 神经上皮瘤
N-myc-mRNA表达
高
极低
C-myc-mRNA表达
无
高
㈢ 恶性肿瘤的分子病理学诊断
原位杂交在肿瘤病理诊断中的应用至少包括如
下几个方面,
1,肿瘤病毒的检出：肝穿刺查乙肝病毒
2.肿瘤细胞遗传学改变的检测,FISH查标记染色 体
3,细胞内基因结构和量的改变的检测,
4,基因表达产物的检测 RT-PCR原位杂交
5.肿瘤分化程度的确定,RT-PCR定量分析查转录拷贝数
6,实体瘤中抗药性肿瘤细胞的定位检测 多重耐药
基因 （ MDR1） 基因扩增与表达的检测
二, 基因诊断在感染性疾病中的应用 (表 16-2)
利用分子生物学技术, 特别是 PCR检验病毒感染,
在临床诊断中具有特别重要的意义 。 PCR检验直接
灵敏地探测病毒基因组或病毒基因转录产物, 无需
血清学检查, 可进行早期诊断 。
三, 基因诊断在遗传性出血性疾病中的应用
血友病检测突变可用用 RFLP,PCR-SSCP/DGGE，
对片段缺失和插入可用 Southern DNA印迹转移杂交法检
测 。 两基因的突变热点都在 CpG二核苷酸处 。 对血友病患
儿可通过症状和家谱分析很快做出诊断 。
四, 产前基因诊断
基因诊断具有直接和灵敏的特点取绒毛, 羊水, 脐血,
对于早期诊断遗传病和感染性疾病以及识别分子病理和监
测病情发展具有十分重要的临床意义 。 近年来采用植入前
诊断 (PGD)结合体外受精技术 (IVF)和胚胎单细胞穿刺技
术, 对单个胚胎细胞进行 FISH或筑巢式 PCR检测 。 目前,
基因诊断主要运用于胎儿早期检测遗传病和研究监测某些
致病基因携带者以期达到病前预测的目的 。
