重组 DNA导入宿主细
胞与转化子的筛选?
? 第一节 重组 DNA向宿主细胞的导入
? 第二节 转化子的筛选与鉴定
? 第三节 目的基因序列测定
第一节 重组 DNA向宿主细
胞的导入
一、转化
二、通过接合作用传递质粒 DNA
三、通过转染 /转导作用传递遗传物质
一、转化, 以质粒作为克隆载体将目的基因导
入宿主细胞
1928年,美国的 Oswald,Avery 首次开展了肺炎球菌的 转
化试验
感受态细菌是指细菌处于容易接受外源 DNA的
状态。有的细菌在生长周期任何时候自动产生如枯草、
嗜血杆菌。有的在对数生长期发生，如 E.coli。产生机
制不明。一是原生质体假说，另一是酶受体假说。
转化作用就是一种基因型细胞 （ 感受态细菌 ） 从
周围介质中吸收来自另一种基因型细胞的 DNA,进而
使原来细胞的遗传基因和遗传性发生相应变化的现象 。
常见转化方法有 ㈠ 原生质体转化法； ㈡ 化学转化法； ㈢电
穿孔法 。
㈠ 原生质体转化法,除去细胞壁后加外源 DNA，经
吸收恢复再生培养，如枯草杆菌 。
㈡ 化学转化法, 1970年 Mandel和 Higa首先用 CaCl2
经短暂的热休克后，可使外源 DNA转入 E.coli。
1.原理：将对数生长期的细菌在 0℃ 下,用预冷的
CaCl2溶液低渗处理,以使菌体的细胞壁和细胞膜
通透性增加,菌体膨胀成球形。 DNA易于进入细
菌的细胞内 。
用冷 CaCl2低渗处理 E.coli使菌体成球形，
外源 DNA可形成抗 DNase的羟基 -钙磷酸复合物而
被吸附，经短暂 42℃ 热休克，易于进入胞内而不
被降解，转化效率达 105-106，它与菌株（ hsdR-),
2.方法,
（ 1）感受态细菌的制备 （ 2）转化
（ 1） 感受态细菌的制备
接种一环 DH5?于 2ml LB中 37℃, 振荡过夜
以约 1%的接种量接入 20ml LB中
振荡培养约 90’至 OD600≈0.2 离心 （ 5K,5’）
收集菌体 加入预冷 CaCl2（ 10 ml 100mM）
冰浴 20’ 离心 收集菌体 加入
100ul100mM预冷 CaCl2 混匀
转化项目
CaCl2
受体菌
DNA
液体 LB
皿
a阳性对照
——
10ul
PBR322DNAlng
100ul
b阴性对照 ①
10ul
——
2ul连接液
100ul
c阴性对照 ②
——
10ul
——
100ul
d连接液转化组
——
60ul
6ul连接液
600ul
（ 2） 转化,0℃, 在 1.5ml离心管中按下表加入
CaCl2,受体菌及 DNA进行转化实验
冰浴 30’ 42℃ 2’（ 热休克 ） 冰浴, 2’
加 37℃ 预热 LB培养 45’ 表中 a,b,c各取 100ul/皿
涂布 （ 连接液转化组 d梯度涂布 I 50ul?2皿；
II.500ul浓缩后 ?2皿 ） 37℃ 倒置培养过夜
检查细菌生长情况
㈢ 电穿孔法
原理：利用高压脉冲电场,在宿主细胞表面
形成暂时性的微孔,质粒 DNA可乘隙而入,
在脉冲过后,微孔复原 。
它比 CaCl2法操作更简单，转化效率高
（一般可达 109～ 1010个转化子／ μg
DNA）,不仅无需制备感受态细胞,而且
适用于任何菌株。
二、通过接合作用传递质粒 DNA
F质粒（ F因子）又称性质粒,除了含有自我复
制基因外,还带有一套接合转移的基因,凡携有 F质
粒的细菌称 F+菌株。不带有 F质粒的细菌称 F－ 菌株。
F+菌株（供体菌）一旦与 F－ 菌株（受体菌）发生接
触,F+菌株可通过性菌毛将 F质粒转给 F－ 菌株，使 F
－ 菌株转变成 F+菌株。质粒由 F+向 F－ 菌的转移过程
叫接合作用传递质粒,又称质粒的接合传递。凡带有
在染色体上整合 F质粒的细菌又称高频重组株系
（ Hfr株系）。 Hfr株系不稳定,F质粒可发生接合传
递质粒 DNA,F+菌株可失去 F质粒,F－ 菌也可获得 F质
粒,其转移难以人为控制,又不稳定,通常不用作克
隆载体。
接合 ---- F+× F－
F+ F- F+ F-
F+ F+ F+ F+
Donor
Recipient
三、通过转染 /转导作用传递遗传物质
㈠ 转染
病毒（含噬菌体） DNA及其重组子 DNA导入宿主细
胞（或细菌）的过程称转染。
㈡ 转导
以噬菌体为媒介，将外源 DNA导入细菌的过程称转
导。
原理,1.重组外源基因的噬菌体 DNA,体外包装成噬菌
体，感染宿主菌，同时导入外源基因。
2.噬菌体的主动感染将含有外源 DNA片段的重
组噬菌体 DNA导入宿主菌体内
第二节 转化子的筛选与鉴定
一、利用遗传标志的表型特征筛选
二、根据重组子的结构特征筛选
一、利用遗传标志的表型特征筛选
㈠ 由载体提供的性状进行筛选
– 1,抗菌素抗性标记筛选
– 2,抗性基因的插入失活筛选
– 3,β-半乳糖苷酶（ LacZ）基因失活筛选 法及其 α -
互补的原理
㈡ 根据插入基因的遗传性状进行筛选
亮氨酸（ Leu)缺陷菌在无 Leu培养基中不生长,当含
Leu外源基因在此缺陷菌中表达时可生长，以此来筛选
阳性克隆。
Ampicillin 抗性? yes yes
Tetracycline 抗性? No yes
B X B
B
B
X
Ampr
ori
Ampr
Tcr
ori
Ampr Tcr
ori
pBR322 B
back
transfer of colonies
+ampicillin + ampicillin
+ tetracycline
这些克隆是有重组质粒的细菌
编码 b-半乳糖苷酶
IPTG
X-gal (酶的底物 ) lac promoter?
蓝色菌落
IPTG可诱导 lacZ形成 α肽链,该产物能与有缺陷的宿主
细胞所编码的 N-末端发生基因内互补，形成有活性的
β-半乳糖苷酶,分解底物 X-gal使菌落呈现 蓝色 。
当外源基因 DNA片段插入多克隆位点后,使其编码的 α
肽链失去活性,使其不能形成 α-互补,因此带有外源基
因重组子的细菌形成 白色 菌落。
非重组质粒, 不含有插入的 DNA蓝色菌落
重组质粒, 含有插入的 DNA,白色菌落
back
非重组质粒
重组质粒
α -互补的原理
所谓基因内互补作用, 在 LacZ体系中,是指二个彼此互补的突
变基因 （ 突变体 1缺失 LacZ近操作基因区段 LacI；突变体 2
带有完整的近操纵基因而无 β-半乳糖苷酶活性 ）, 它们编
码产生的无活性的多肽产物, 但由于二个突变体之间通过 α
肽互补作用可呈现有功能的 β-半乳糖苷酶活性,进而可分解
底物 X-gal（ 5-溴 -4-氯 -3-吲哚 -β-D-半乳糖苷 ） 而产生半乳糖
和深蓝色的底物 5-溴 -4-氯 -青定蓝,使菌落呈现出蓝色反应 。
然而, 当外源基因 DNA片段插入载体中 LacZ α肽区段的多
克隆位点后,就会阻断 α序列的读码结构,使其编码的 α肽失
去活性,使重组子所在的细菌不能完成 α-互补,因此带有外
源基因重组子的细菌形成白色菌落 。 根据这种 β-半乳糖苷
酶的显色反应, 可以检测和筛选出携有外源基因重组子克
隆 。 此法又称蓝白筛选法 。 如图 5-1
二, 根据重组子的结构特征筛选
– 1,重组子大小鉴别筛选
菌落 ——提取质粒 ——单酶切 ——电泳
原质粒
– 2,酶切鉴定
菌落 ——提取质粒 ——双酶切 ——电泳
原质粒
– 3,PCR筛选法
能与插入基因片断两端互补的特异引物,以
少量抽提的重组子 DNA为模板,进行 PCR分析
– 4,原位杂交 图 5-3,5-4
该法是从基因组文库中筛选目的基因的首选方法 。
– 5,斑点杂交
1)重组体 DNA或 RNA抽提出来,点膜, 然后杂交 。
2)经提取纯化后,杂质少,所以能得到更为确切的结
果,既可用于定性,也可通过内参照进行相对定量 。
– 6,Southern blot杂交法
原位杂交与斑点杂交都只能鉴定整个重组子中是
否会有与探针互补的同源片段,而 Southern blot杂
交能将同源片断定位于基因
鉴别法比较,
同尾酶 BamHI和 BglII
? AGATCT? ? GGATCC?
? TCTAGA? ? CCTAGG?
BglⅡ BamHI
? A GATCC?
? TCTAG T4连接酶 G?
AGATCC?
TCTAGG?
肺炎双球菌转化实验
第三节 目的基因序列测定
一、目的基因序列测定的意义
美国联邦国家人类基因组研究项
目负责人弗朗西斯 · 柯林斯博士在华盛顿
隆重宣布，人类基因组序列图绘制成功，
人类基因组计划的所有目标全部实现。由
美、英、日、法、德和中国科学家经过 13
年努力共同绘制完成了人类基因组序列图，
在人类揭示生命奥秘、认识自我的漫漫长
路上又迈出了重要的一步。
二、目的基因测序方法
? ㈠ 酶法 —— 双脱氧链的末端终止法
? ㈡ 化学 （ 裂解 ） 法
酶法 —— 双脱氧链的末端终止法
1,Sanger双脱氧末端终止法：因掺入 dd-NTP的链
不能再延长而形成不同长度的末端为 A,G、
C,T的片段。 图 5-5
2,Sanger双脱氧 -M13体系测序法：采用 M13噬菌
体组装基因后，再由引物合成不同长度末端
为 A,G,C,T的片段 图 5-6
3,Sanger双脱氧 -PUC体系测序法：类似 M13体系，
只是由 PUC体系替代 M13噬菌体，再由引物
合成不同长度末端为 A,G,C,T的片段。
图 5-7
① 双脱氧－ M13体系 DNA序列分析法
M13含单链 DNA，在细菌内形成双链环状 DNA
（ RF）。成熟的噬菌体含单链 DNA分泌到培
养液中。
双链 DNA（ RF）：克隆载体，按提取质粒方法
从细菌中制备
单链 DNA：测序模板，从培养基的上清中提取
目前常用的 M13mp18
图 5-6
? ㈡ 化学 （ 裂解 ） 法 (如图 )
在无 NaCl下, 用联氨 （ 肼 ） 可打开 C,T碱
基, 在 C,T碱基发生断裂, 形成 T+C组 。 加
入 NaCl,肼切割 C形成 C组 。 在中性条件下,
硫酸二甲酯可在 G处断开形成 G组 。 加入甲
酸可在 A,G处断开, 形成 G+A组, 最后电
泳经感光读片, 自动分析得到测序结果 。 如,
图 5-9 5-10
全自动 DNA测序仪
末端终止法，采用 4种荧光染料标记 ddNTP，
在同一泳道测序，为人类基因组测序做
出重大贡献。
,
四类核酸分子杂交法的技术路线比较
菌落原位杂交
菌落或噬菌斑转
印到膜上 抽提 DNA/RNA 提取 DNA 提取 RNA
裂解细菌或噬菌斑 变性核酸样品 琼脂糖凝胶电泳
变性 DNA 将核酸点加到膜上 将凝胶上核酸条带转移 到膜上，同时变性
将核酸固定在膜上 → 预杂交（消除非特异吸附位点）
→ 加入核素标记探针进行杂交 → 漂洗膜（洗去非特异
结合探针） → 放射自显影或显色反应示踪
斑点杂交 Southern印迹 Northern印迹
胞与转化子的筛选?
? 第一节 重组 DNA向宿主细胞的导入
? 第二节 转化子的筛选与鉴定
? 第三节 目的基因序列测定
第一节 重组 DNA向宿主细
胞的导入
一、转化
二、通过接合作用传递质粒 DNA
三、通过转染 /转导作用传递遗传物质
一、转化, 以质粒作为克隆载体将目的基因导
入宿主细胞
1928年,美国的 Oswald,Avery 首次开展了肺炎球菌的 转
化试验
感受态细菌是指细菌处于容易接受外源 DNA的
状态。有的细菌在生长周期任何时候自动产生如枯草、
嗜血杆菌。有的在对数生长期发生，如 E.coli。产生机
制不明。一是原生质体假说，另一是酶受体假说。
转化作用就是一种基因型细胞 （ 感受态细菌 ） 从
周围介质中吸收来自另一种基因型细胞的 DNA,进而
使原来细胞的遗传基因和遗传性发生相应变化的现象 。
常见转化方法有 ㈠ 原生质体转化法； ㈡ 化学转化法； ㈢电
穿孔法 。
㈠ 原生质体转化法,除去细胞壁后加外源 DNA，经
吸收恢复再生培养，如枯草杆菌 。
㈡ 化学转化法, 1970年 Mandel和 Higa首先用 CaCl2
经短暂的热休克后，可使外源 DNA转入 E.coli。
1.原理：将对数生长期的细菌在 0℃ 下,用预冷的
CaCl2溶液低渗处理,以使菌体的细胞壁和细胞膜
通透性增加,菌体膨胀成球形。 DNA易于进入细
菌的细胞内 。
用冷 CaCl2低渗处理 E.coli使菌体成球形，
外源 DNA可形成抗 DNase的羟基 -钙磷酸复合物而
被吸附，经短暂 42℃ 热休克，易于进入胞内而不
被降解，转化效率达 105-106，它与菌株（ hsdR-),
2.方法,
（ 1）感受态细菌的制备 （ 2）转化
（ 1） 感受态细菌的制备
接种一环 DH5?于 2ml LB中 37℃, 振荡过夜
以约 1%的接种量接入 20ml LB中
振荡培养约 90’至 OD600≈0.2 离心 （ 5K,5’）
收集菌体 加入预冷 CaCl2（ 10 ml 100mM）
冰浴 20’ 离心 收集菌体 加入
100ul100mM预冷 CaCl2 混匀
转化项目
CaCl2
受体菌
DNA
液体 LB
皿
a阳性对照
——
10ul
PBR322DNAlng
100ul
b阴性对照 ①
10ul
——
2ul连接液
100ul
c阴性对照 ②
——
10ul
——
100ul
d连接液转化组
——
60ul
6ul连接液
600ul
（ 2） 转化,0℃, 在 1.5ml离心管中按下表加入
CaCl2,受体菌及 DNA进行转化实验
冰浴 30’ 42℃ 2’（ 热休克 ） 冰浴, 2’
加 37℃ 预热 LB培养 45’ 表中 a,b,c各取 100ul/皿
涂布 （ 连接液转化组 d梯度涂布 I 50ul?2皿；
II.500ul浓缩后 ?2皿 ） 37℃ 倒置培养过夜
检查细菌生长情况
㈢ 电穿孔法
原理：利用高压脉冲电场,在宿主细胞表面
形成暂时性的微孔,质粒 DNA可乘隙而入,
在脉冲过后,微孔复原 。
它比 CaCl2法操作更简单，转化效率高
（一般可达 109～ 1010个转化子／ μg
DNA）,不仅无需制备感受态细胞,而且
适用于任何菌株。
二、通过接合作用传递质粒 DNA
F质粒（ F因子）又称性质粒,除了含有自我复
制基因外,还带有一套接合转移的基因,凡携有 F质
粒的细菌称 F+菌株。不带有 F质粒的细菌称 F－ 菌株。
F+菌株（供体菌）一旦与 F－ 菌株（受体菌）发生接
触,F+菌株可通过性菌毛将 F质粒转给 F－ 菌株，使 F
－ 菌株转变成 F+菌株。质粒由 F+向 F－ 菌的转移过程
叫接合作用传递质粒,又称质粒的接合传递。凡带有
在染色体上整合 F质粒的细菌又称高频重组株系
（ Hfr株系）。 Hfr株系不稳定,F质粒可发生接合传
递质粒 DNA,F+菌株可失去 F质粒,F－ 菌也可获得 F质
粒,其转移难以人为控制,又不稳定,通常不用作克
隆载体。
接合 ---- F+× F－
F+ F- F+ F-
F+ F+ F+ F+
Donor
Recipient
三、通过转染 /转导作用传递遗传物质
㈠ 转染
病毒（含噬菌体） DNA及其重组子 DNA导入宿主细
胞（或细菌）的过程称转染。
㈡ 转导
以噬菌体为媒介，将外源 DNA导入细菌的过程称转
导。
原理,1.重组外源基因的噬菌体 DNA,体外包装成噬菌
体，感染宿主菌，同时导入外源基因。
2.噬菌体的主动感染将含有外源 DNA片段的重
组噬菌体 DNA导入宿主菌体内
第二节 转化子的筛选与鉴定
一、利用遗传标志的表型特征筛选
二、根据重组子的结构特征筛选
一、利用遗传标志的表型特征筛选
㈠ 由载体提供的性状进行筛选
– 1,抗菌素抗性标记筛选
– 2,抗性基因的插入失活筛选
– 3,β-半乳糖苷酶（ LacZ）基因失活筛选 法及其 α -
互补的原理
㈡ 根据插入基因的遗传性状进行筛选
亮氨酸（ Leu)缺陷菌在无 Leu培养基中不生长,当含
Leu外源基因在此缺陷菌中表达时可生长，以此来筛选
阳性克隆。
Ampicillin 抗性? yes yes
Tetracycline 抗性? No yes
B X B
B
B
X
Ampr
ori
Ampr
Tcr
ori
Ampr Tcr
ori
pBR322 B
back
transfer of colonies
+ampicillin + ampicillin
+ tetracycline
这些克隆是有重组质粒的细菌
编码 b-半乳糖苷酶
IPTG
X-gal (酶的底物 ) lac promoter?
蓝色菌落
IPTG可诱导 lacZ形成 α肽链,该产物能与有缺陷的宿主
细胞所编码的 N-末端发生基因内互补，形成有活性的
β-半乳糖苷酶,分解底物 X-gal使菌落呈现 蓝色 。
当外源基因 DNA片段插入多克隆位点后,使其编码的 α
肽链失去活性,使其不能形成 α-互补,因此带有外源基
因重组子的细菌形成 白色 菌落。
非重组质粒, 不含有插入的 DNA蓝色菌落
重组质粒, 含有插入的 DNA,白色菌落
back
非重组质粒
重组质粒
α -互补的原理
所谓基因内互补作用, 在 LacZ体系中,是指二个彼此互补的突
变基因 （ 突变体 1缺失 LacZ近操作基因区段 LacI；突变体 2
带有完整的近操纵基因而无 β-半乳糖苷酶活性 ）, 它们编
码产生的无活性的多肽产物, 但由于二个突变体之间通过 α
肽互补作用可呈现有功能的 β-半乳糖苷酶活性,进而可分解
底物 X-gal（ 5-溴 -4-氯 -3-吲哚 -β-D-半乳糖苷 ） 而产生半乳糖
和深蓝色的底物 5-溴 -4-氯 -青定蓝,使菌落呈现出蓝色反应 。
然而, 当外源基因 DNA片段插入载体中 LacZ α肽区段的多
克隆位点后,就会阻断 α序列的读码结构,使其编码的 α肽失
去活性,使重组子所在的细菌不能完成 α-互补,因此带有外
源基因重组子的细菌形成白色菌落 。 根据这种 β-半乳糖苷
酶的显色反应, 可以检测和筛选出携有外源基因重组子克
隆 。 此法又称蓝白筛选法 。 如图 5-1
二, 根据重组子的结构特征筛选
– 1,重组子大小鉴别筛选
菌落 ——提取质粒 ——单酶切 ——电泳
原质粒
– 2,酶切鉴定
菌落 ——提取质粒 ——双酶切 ——电泳
原质粒
– 3,PCR筛选法
能与插入基因片断两端互补的特异引物,以
少量抽提的重组子 DNA为模板,进行 PCR分析
– 4,原位杂交 图 5-3,5-4
该法是从基因组文库中筛选目的基因的首选方法 。
– 5,斑点杂交
1)重组体 DNA或 RNA抽提出来,点膜, 然后杂交 。
2)经提取纯化后,杂质少,所以能得到更为确切的结
果,既可用于定性,也可通过内参照进行相对定量 。
– 6,Southern blot杂交法
原位杂交与斑点杂交都只能鉴定整个重组子中是
否会有与探针互补的同源片段,而 Southern blot杂
交能将同源片断定位于基因
鉴别法比较,
同尾酶 BamHI和 BglII
? AGATCT? ? GGATCC?
? TCTAGA? ? CCTAGG?
BglⅡ BamHI
? A GATCC?
? TCTAG T4连接酶 G?
AGATCC?
TCTAGG?
肺炎双球菌转化实验
第三节 目的基因序列测定
一、目的基因序列测定的意义
美国联邦国家人类基因组研究项
目负责人弗朗西斯 · 柯林斯博士在华盛顿
隆重宣布，人类基因组序列图绘制成功，
人类基因组计划的所有目标全部实现。由
美、英、日、法、德和中国科学家经过 13
年努力共同绘制完成了人类基因组序列图，
在人类揭示生命奥秘、认识自我的漫漫长
路上又迈出了重要的一步。
二、目的基因测序方法
? ㈠ 酶法 —— 双脱氧链的末端终止法
? ㈡ 化学 （ 裂解 ） 法
酶法 —— 双脱氧链的末端终止法
1,Sanger双脱氧末端终止法：因掺入 dd-NTP的链
不能再延长而形成不同长度的末端为 A,G、
C,T的片段。 图 5-5
2,Sanger双脱氧 -M13体系测序法：采用 M13噬菌
体组装基因后，再由引物合成不同长度末端
为 A,G,C,T的片段 图 5-6
3,Sanger双脱氧 -PUC体系测序法：类似 M13体系，
只是由 PUC体系替代 M13噬菌体，再由引物
合成不同长度末端为 A,G,C,T的片段。
图 5-7
① 双脱氧－ M13体系 DNA序列分析法
M13含单链 DNA，在细菌内形成双链环状 DNA
（ RF）。成熟的噬菌体含单链 DNA分泌到培
养液中。
双链 DNA（ RF）：克隆载体，按提取质粒方法
从细菌中制备
单链 DNA：测序模板，从培养基的上清中提取
目前常用的 M13mp18
图 5-6
? ㈡ 化学 （ 裂解 ） 法 (如图 )
在无 NaCl下, 用联氨 （ 肼 ） 可打开 C,T碱
基, 在 C,T碱基发生断裂, 形成 T+C组 。 加
入 NaCl,肼切割 C形成 C组 。 在中性条件下,
硫酸二甲酯可在 G处断开形成 G组 。 加入甲
酸可在 A,G处断开, 形成 G+A组, 最后电
泳经感光读片, 自动分析得到测序结果 。 如,
图 5-9 5-10
全自动 DNA测序仪
末端终止法，采用 4种荧光染料标记 ddNTP，
在同一泳道测序，为人类基因组测序做
出重大贡献。
,
四类核酸分子杂交法的技术路线比较
菌落原位杂交
菌落或噬菌斑转
印到膜上 抽提 DNA/RNA 提取 DNA 提取 RNA
裂解细菌或噬菌斑 变性核酸样品 琼脂糖凝胶电泳
变性 DNA 将核酸点加到膜上 将凝胶上核酸条带转移 到膜上，同时变性
将核酸固定在膜上 → 预杂交（消除非特异吸附位点）
→ 加入核素标记探针进行杂交 → 漂洗膜（洗去非特异
结合探针） → 放射自显影或显色反应示踪
斑点杂交 Southern印迹 Northern印迹
