第十三章
细 胞 凋 亡 及 基 因 调 控
一、细胞凋亡概念
? 细胞凋亡（ Apoptosis）又称程序性细胞死亡
（ Programmed cell death简称 PCD），是由基因
编程控制的细胞主动参与的自杀过程，是细胞衰
老自然死亡的主要方式之一，是一种生理性调节
机制，在机体中承担着重要的调控作用。
? 细胞凋亡与细胞坏死的机制不同（ 如图 13-1）
细胞凋亡与细胞坏死的区别 (表 13-1)
二、细胞凋亡的特征
? 1、形态学变化：胞核染色质固缩，集聚核
周遍呈月斑块 ?浓缩、断裂；胞膜表面泡
状突起出芽；细胞体积缩小，园缩，内馅，
分割成大小不等膜包凋亡小体。凋亡小体
内有完整的细胞器和核物质 （用电镜可以
检测凋亡小体）（ 如图 13-2）。
? 2、细胞凋亡的生化过程,
细胞基因组 DNA的降解：（内源性核酸内切酶的激
活） ?切割成 180~20bp的整数倍核小体片段，电
泳可呈梯形条带（ DNA ladder） （ 如图 13-3） 。
内核断裂：经 DAPI即 4-6-二脒基二苯基吲哚荧光染
色，可见颗粒状的荧光碎片（核内）；在流式细
胞检测细胞周期时可测出亚 G1峰，称, G1”期的
AP峰（即凋亡峰） （ 如图 13-4） 。
三、细胞凋亡的常见因素
? 细胞凋亡是一种复杂的生理生化过程，可
受多种因素的影响，均受基因调控，同时
也受环境中的各种理化因子和药物调节。
? 1、诱导细胞凋亡的诱导因子（ 表 13-2）
? 2、细胞因子去处后的细胞凋亡（ 表 13-3）
? 已报道的诱导凋亡的物质（ 表 13-4）
? 抑制细胞凋亡的物质（ 表 13-5）
四,细胞凋亡的基因调控
? 蝌蚪变成青蛙尾巴消失；胸腺细胞选择性死亡所
导致的细胞凋亡都受某些基因的活化、表达和调
控。决定细胞死亡的基因称, 细胞死亡基因,,
反之，抑制细胞凋亡的基因称存活基因，其也受
许多基因的控制（ 表 13-6）
? 抗凋亡基因活化表达 ?肿瘤发生恶化
? 若抑制表达 ?肿瘤生长下降，药效好，预后佳
? 凋亡 /促凋亡基因受抑 /缺失 ?肿瘤耐药，预后不良；
凋亡 /促凋亡基因激活 ?肿瘤生长下降
? 1,Ced基因家族
? （ 1） Ced –3,ced-4?与细胞凋亡有关。与
钙离子结合蛋白和丝氨酸 /磷酸化有关。
? （ 2） ced –9?抑制细胞凋亡。通过 Ced –
3,ced-4发挥作用。
? （ 3）其他 Ced 1,6,7,8,10,2,5、
参与对凋亡细胞吞噬清除。
? 2,Bcl-2基因家族 ；
? （ 1） Bcl-2基因：抑制细胞凋亡 ?肿瘤
发生
? （ 2） Bcl-x基因,Bcl-xl同 Bcl-2抑制凋亡；
Bcl-xs相反，促进细胞凋亡 ?肿瘤生长下
降（ 3） Bax基因：加速细胞凋亡 ?肿瘤
生长下降
? Bcl-2\Bcl-x\Bax三者形成一个凋亡调控系
统。（ 如图 13-5）
bax
bax凋亡
bcl-2 bcl-XL
bcl-XS bad
? 3,ICE家族
? （ 1） ICE来源于单核细胞可作用于 IL-1 β前体，
使之成熟，过量表达会导致细胞凋亡。
? Caspase结构域和活化
? Caspase的 N端为半胱氨酸蛋白酶募集域
(CARD),并有 P环 (dATP)的结合点,后接 20KD
的 P20区域,内含 QACRG活性中心,最后为
10KD的 P10长羧基末端。
? 当 Caspase在 20～ 10KD（ P20 ～ P10）之间
断开，并形成四聚体后才具有酶的活性，而使
细胞凋亡。（ 如图 13-6）
Caspase激活途径
? A 死亡途径：当膜表面 Fas,TNF-a、
TRAIL受体与相应配体结合，使 Fas相关死
亡结构域（ FADD）活化，激活 Caspase-
8/10，进一步激活 Caspase6/7,继而激活
Caspase-3引起凋亡，同时受 ICE抑制物
（ CrmA)及凋亡抑制蛋白负调控。
? B 线粒体途径：当细胞应激因子促使细胞
色素凋亡交互因子（ CIFA）进入线粒体，
引起细胞色素 c分解释放至胞质中，通过 P
环激活 Caspase-9，继而激活 Caspase-3引
起凋亡，并同时受到 bcl-2/bax调控。（ 如
图 13-7）
? （ 2） Caspase-3又称 Cpp32/Yama/Apopain可作
用于多聚 ADP核糖多聚酶 PARP 使之降解为 89KD
和 24KD，破坏 PARP修复 DNA功能，引起凋亡。
? （ 如图 13-8）
? （ 3）颗粒酶有 A和 B两种颗粒酶 A是丝氨酸蛋白酶，
颗粒酶 B可催化 IL-1 β前体成熟，而导致凋亡。
? 4、其它基因和蛋白,P53,C-myc,Fas/Apo-1
（ 表 13-6）
五、细胞凋亡常用的检测技术
? （一）光镜的形态学观察,
普通光镜：细胞园缩，核浓缩、破碎
? 透射光镜：凋亡小体
? （二）细胞 DNA提取物的核酸电泳,
? 电泳后经过溴乙锭染色，在紫外光下呈梯
形条带。
? （三） MTT法：细胞凋亡，细胞琥珀酸脱
氢酶下降，经过 MTT呈兰紫色颗粒下降，
经过酸化异丙醇溶解后，于 490nm波长下
测 OD值，计算 IC50。
? 抑制率（ %） =（ 1-试验组平均 A值 /阴性对
照组平均 A值） × 100%。
? (四 )荧光法：断裂 DNA可被 DAPI着色后形成核断
裂颗粒荧光。（ 如图 13-9）
? (五 )流式细胞仪检测法测定 DNA细胞经乙醇固定
后，采用碘化丙锭荧光染料，通透细胞后用流式
细胞仪检测,1、测定 DNA总量变化 2、测定细胞
周期变化 ?S期消失 3、测定凋亡峰 ?于细胞 G1
期前出现亚 G1峰，即凋亡峰。根据凋亡峰占 总
DNA的比例测定凋亡百分率。
? （六） Bcl-2,Bax胞浆蛋白检测,
? 1、免疫组化法：细胞固定 ?滴片，用穿孔素
打孔。加 Bcl-2抗体，洗涤后加酶标二抗 ?显色
?镜检。（ 如图 13-10）
? 2、流式细胞仪检测法 Bcl-2/Bax：多聚甲醇固
定细胞 ?用 TB穿孔液打孔 ?加入 Bcl-2/Bax单
抗 ?洗涤后加入荧光标记二抗 ?洗涤后 ?FCM
检测含量。
? （七） Bcl-2/Bax基因表达检测：提取细胞
mRNA?加逆转录酶 ?加入引物,Taq酶
?PCR扩增 ?cDNA?定量检测 cDNA量。
? （八）其他方法,
? 1、磷脂酰丝氨酸（ ps ）测定
? 2、断裂 DNA位点的原位标记试验（ 如图
13-11）
六、细胞凋亡的医学意义
? 1、凋亡在发生学中的作用
? (1)研究在胚胎发育过程中，准时发生细胞凋亡，以利
控制组织、器官的分化、形成。
? (2)淋巴系统的阴性选择。 (negative selectior)。指在 T
淋巴细胞,B淋巴细胞分化成熟时，机体经过严格的选
择机制，使那些编排细胞表面受体基因发生错误的细
胞，以及有可能导致自身免疫性疾病的细胞 (具有自身
抗原的细胞 )发生凋亡，仅有 5%左右的淋巴细胞从中枢
免疫器官中被分化成熟。
? (3)神经元发育过程中也存在阴性选择机制，以清除那
些有害的（即发错误连接的）或无用的神经元，因此,
有 50%的神经元细胞在发育成熟前,以凋亡的方式被清
除。
? 2、凋亡与疾病
? (1)凋亡减少 (抑制 )所引起的疾病
? ①恶性肿瘤 发生②易患自身免疫性疾病 ③易患病毒
感染性疾病
? (2)凋亡增多引起的疾病
? ① AIDS② 神经元变性 ③骨髓发育不良综合征 障碍
④缺血性损伤⑤中毒性肝炎
细 胞 凋 亡 及 基 因 调 控
一、细胞凋亡概念
? 细胞凋亡（ Apoptosis）又称程序性细胞死亡
（ Programmed cell death简称 PCD），是由基因
编程控制的细胞主动参与的自杀过程，是细胞衰
老自然死亡的主要方式之一，是一种生理性调节
机制，在机体中承担着重要的调控作用。
? 细胞凋亡与细胞坏死的机制不同（ 如图 13-1）
细胞凋亡与细胞坏死的区别 (表 13-1)
二、细胞凋亡的特征
? 1、形态学变化：胞核染色质固缩，集聚核
周遍呈月斑块 ?浓缩、断裂；胞膜表面泡
状突起出芽；细胞体积缩小，园缩，内馅，
分割成大小不等膜包凋亡小体。凋亡小体
内有完整的细胞器和核物质 （用电镜可以
检测凋亡小体）（ 如图 13-2）。
? 2、细胞凋亡的生化过程,
细胞基因组 DNA的降解：（内源性核酸内切酶的激
活） ?切割成 180~20bp的整数倍核小体片段，电
泳可呈梯形条带（ DNA ladder） （ 如图 13-3） 。
内核断裂：经 DAPI即 4-6-二脒基二苯基吲哚荧光染
色，可见颗粒状的荧光碎片（核内）；在流式细
胞检测细胞周期时可测出亚 G1峰，称, G1”期的
AP峰（即凋亡峰） （ 如图 13-4） 。
三、细胞凋亡的常见因素
? 细胞凋亡是一种复杂的生理生化过程，可
受多种因素的影响，均受基因调控，同时
也受环境中的各种理化因子和药物调节。
? 1、诱导细胞凋亡的诱导因子（ 表 13-2）
? 2、细胞因子去处后的细胞凋亡（ 表 13-3）
? 已报道的诱导凋亡的物质（ 表 13-4）
? 抑制细胞凋亡的物质（ 表 13-5）
四,细胞凋亡的基因调控
? 蝌蚪变成青蛙尾巴消失；胸腺细胞选择性死亡所
导致的细胞凋亡都受某些基因的活化、表达和调
控。决定细胞死亡的基因称, 细胞死亡基因,,
反之，抑制细胞凋亡的基因称存活基因，其也受
许多基因的控制（ 表 13-6）
? 抗凋亡基因活化表达 ?肿瘤发生恶化
? 若抑制表达 ?肿瘤生长下降，药效好，预后佳
? 凋亡 /促凋亡基因受抑 /缺失 ?肿瘤耐药，预后不良；
凋亡 /促凋亡基因激活 ?肿瘤生长下降
? 1,Ced基因家族
? （ 1） Ced –3,ced-4?与细胞凋亡有关。与
钙离子结合蛋白和丝氨酸 /磷酸化有关。
? （ 2） ced –9?抑制细胞凋亡。通过 Ced –
3,ced-4发挥作用。
? （ 3）其他 Ced 1,6,7,8,10,2,5、
参与对凋亡细胞吞噬清除。
? 2,Bcl-2基因家族 ；
? （ 1） Bcl-2基因：抑制细胞凋亡 ?肿瘤
发生
? （ 2） Bcl-x基因,Bcl-xl同 Bcl-2抑制凋亡；
Bcl-xs相反，促进细胞凋亡 ?肿瘤生长下
降（ 3） Bax基因：加速细胞凋亡 ?肿瘤
生长下降
? Bcl-2\Bcl-x\Bax三者形成一个凋亡调控系
统。（ 如图 13-5）
bax
bax凋亡
bcl-2 bcl-XL
bcl-XS bad
? 3,ICE家族
? （ 1） ICE来源于单核细胞可作用于 IL-1 β前体，
使之成熟，过量表达会导致细胞凋亡。
? Caspase结构域和活化
? Caspase的 N端为半胱氨酸蛋白酶募集域
(CARD),并有 P环 (dATP)的结合点,后接 20KD
的 P20区域,内含 QACRG活性中心,最后为
10KD的 P10长羧基末端。
? 当 Caspase在 20～ 10KD（ P20 ～ P10）之间
断开，并形成四聚体后才具有酶的活性，而使
细胞凋亡。（ 如图 13-6）
Caspase激活途径
? A 死亡途径：当膜表面 Fas,TNF-a、
TRAIL受体与相应配体结合，使 Fas相关死
亡结构域（ FADD）活化，激活 Caspase-
8/10，进一步激活 Caspase6/7,继而激活
Caspase-3引起凋亡，同时受 ICE抑制物
（ CrmA)及凋亡抑制蛋白负调控。
? B 线粒体途径：当细胞应激因子促使细胞
色素凋亡交互因子（ CIFA）进入线粒体，
引起细胞色素 c分解释放至胞质中，通过 P
环激活 Caspase-9，继而激活 Caspase-3引
起凋亡，并同时受到 bcl-2/bax调控。（ 如
图 13-7）
? （ 2） Caspase-3又称 Cpp32/Yama/Apopain可作
用于多聚 ADP核糖多聚酶 PARP 使之降解为 89KD
和 24KD，破坏 PARP修复 DNA功能，引起凋亡。
? （ 如图 13-8）
? （ 3）颗粒酶有 A和 B两种颗粒酶 A是丝氨酸蛋白酶，
颗粒酶 B可催化 IL-1 β前体成熟，而导致凋亡。
? 4、其它基因和蛋白,P53,C-myc,Fas/Apo-1
（ 表 13-6）
五、细胞凋亡常用的检测技术
? （一）光镜的形态学观察,
普通光镜：细胞园缩，核浓缩、破碎
? 透射光镜：凋亡小体
? （二）细胞 DNA提取物的核酸电泳,
? 电泳后经过溴乙锭染色，在紫外光下呈梯
形条带。
? （三） MTT法：细胞凋亡，细胞琥珀酸脱
氢酶下降，经过 MTT呈兰紫色颗粒下降，
经过酸化异丙醇溶解后，于 490nm波长下
测 OD值，计算 IC50。
? 抑制率（ %） =（ 1-试验组平均 A值 /阴性对
照组平均 A值） × 100%。
? (四 )荧光法：断裂 DNA可被 DAPI着色后形成核断
裂颗粒荧光。（ 如图 13-9）
? (五 )流式细胞仪检测法测定 DNA细胞经乙醇固定
后，采用碘化丙锭荧光染料，通透细胞后用流式
细胞仪检测,1、测定 DNA总量变化 2、测定细胞
周期变化 ?S期消失 3、测定凋亡峰 ?于细胞 G1
期前出现亚 G1峰，即凋亡峰。根据凋亡峰占 总
DNA的比例测定凋亡百分率。
? （六） Bcl-2,Bax胞浆蛋白检测,
? 1、免疫组化法：细胞固定 ?滴片，用穿孔素
打孔。加 Bcl-2抗体，洗涤后加酶标二抗 ?显色
?镜检。（ 如图 13-10）
? 2、流式细胞仪检测法 Bcl-2/Bax：多聚甲醇固
定细胞 ?用 TB穿孔液打孔 ?加入 Bcl-2/Bax单
抗 ?洗涤后加入荧光标记二抗 ?洗涤后 ?FCM
检测含量。
? （七） Bcl-2/Bax基因表达检测：提取细胞
mRNA?加逆转录酶 ?加入引物,Taq酶
?PCR扩增 ?cDNA?定量检测 cDNA量。
? （八）其他方法,
? 1、磷脂酰丝氨酸（ ps ）测定
? 2、断裂 DNA位点的原位标记试验（ 如图
13-11）
六、细胞凋亡的医学意义
? 1、凋亡在发生学中的作用
? (1)研究在胚胎发育过程中，准时发生细胞凋亡，以利
控制组织、器官的分化、形成。
? (2)淋巴系统的阴性选择。 (negative selectior)。指在 T
淋巴细胞,B淋巴细胞分化成熟时，机体经过严格的选
择机制，使那些编排细胞表面受体基因发生错误的细
胞，以及有可能导致自身免疫性疾病的细胞 (具有自身
抗原的细胞 )发生凋亡，仅有 5%左右的淋巴细胞从中枢
免疫器官中被分化成熟。
? (3)神经元发育过程中也存在阴性选择机制，以清除那
些有害的（即发错误连接的）或无用的神经元，因此,
有 50%的神经元细胞在发育成熟前,以凋亡的方式被清
除。
? 2、凋亡与疾病
? (1)凋亡减少 (抑制 )所引起的疾病
? ①恶性肿瘤 发生②易患自身免疫性疾病 ③易患病毒
感染性疾病
? (2)凋亡增多引起的疾病
? ① AIDS② 神经元变性 ③骨髓发育不良综合征 障碍
④缺血性损伤⑤中毒性肝炎
