第二十章 基因治疗
? 一、基因治疗的 概念 及 遵循原则
? 二,基因治疗的程序
? 三,基因治疗的策略
? 四,基因治疗的临床应用
? 五,基因治疗的问题与前景
? 六、裂解型（ HSV-Ⅰ ）载体用于脑肿瘤
的基因治疗 (如图 )
基因治疗的概念
? 基因治疗就是将有功能的基因转移到病人的细胞中以
纠正或置换致病基因的一种治疗方法，是指有功能的
目的基因导入靶细胞后与宿主细胞内的基因发生整合，
成为宿主细胞遗传物质的一部分，目的基因的表达产
物起到对疾病的治疗作用。若目的基因不与宿主细胞
基因组发生整合，但可通过暂时表达产物发挥治疗作
用的方法叫基因疗法（ gene therapeutics），此法实际
上就如同临床上使用的药物治疗一样，这与传统意义
上的基因治疗是有区别的。基因治疗常采取四大措施，
包括,(1)基因置换 (gene reptacement) (2)基因修正 (gene
correction) (3)基因修饰 (gene augmentation) (4)基因失活
(gene inactivation)
基因置换
? 基因置换 (gene reptacement)：是指将致病
基因整个地被有功能的正常基因所置换，
使致病基因永久地得到更正。但操作难
度大，有伦理学问题。
基因修正
? 基因修正 (gene correction)是指将致病基
因的突变碱基序列得以纠正，而正常序
列部分予以保留，使突变的致病基因恢
复正常功能。即使致病基因的突变序列
纠正为正常序列（用碱基点突变技术）。
基因修饰
? 基因修饰 (gene augmentation)则是指将目
的基因导入缺陷细胞或其它细胞，目的
基因的表达产物可修饰和改变缺陷细胞
的功能或使原有的功能得到加强。
基因失活
? 基因失活 (gene inactivation)就是应用反义
技术 (antisense technology)特异封闭某些
基因的表达，以达到抑制或阻止某些有
害基因的表达。 SiRNA的基因干扰可造
成靶基因（异常基因）的失活（或沉
默）。
基因治疗遵循的原则
基因治疗应遵循的基本原则为,
? 1．治疗的疾病应是指目前治疗方法难以阻止疾病发展
的严重疾病。
? 2．遗传性疾病应是属于染色体“隐性”遗传的疾病，
即指来自双亲的二条染色体上同一基因位点都发生改
变的疾病，只要通过导入同一正常基因即可纠正缺陷。
? 3．能治疗疾病的正常基因已经被克隆，并能表达有功
能的产物。
? 4．基因治疗用的基因在体内表达无需精确调控，表达
产物过多不会产生危害。
? 5．注入体内带有外源基因的治疗细胞，应能自然消减
去除。
二、基因治疗的程序
? (一 )目的基因的准备
? (二 )受体细胞 (靶细胞 )的选择和培养 。
? (三 )载体的选择
? (四 )目的基因导入靶细胞的基因转移方法
目的基因导入靶细胞的基因转
移方法
? 1,基因转移的物理法
? 2,基因转移的化学法
? 3,基因转移的融合法
? 4,基因转移的颗粒轰击技术
? 5,基因转移的病毒载体法
1．基因转移的物理法
? (1)显微注射法
– ①真正的显微注射法：直接在显微镜下向胞
内注入基因
– ②穿刺法：先在胞膜、胞核上穿孔后导入基
因
? (2)电脉冲介导法：在高压电脉冲下，使
胞膜瞬间形成孔洞，基因在强电场下导
入，电场强度和持续时间随种类而异。
2．基因转移的化学法
? (1)DNA—磷酸钙共沉淀法
? (2)DEAE—葡聚糖法
? (3)染色体介导法
? (4)聚阳离子 —DMSO转染技术
3．基因转移的融合法
? (1)细胞融合法
? (2)脂质体介导法
? (3)原生质体融合法
? (4)微细胞核介导法
4．基因转移的颗粒轰击技术
? 目的基因 DNA质量较轻，在电场中不易获得较
高的运动速度，但用重金属钨或金等进行表面
包被以后，形成了具一定大小的颗粒，在电场
突然充电时包被 DNA的金属颗粒可获得较大的
能量，并沿电场方向作快速运动，可穿入到器
官，组织或培养的细胞中，使外源目的基因
DNA也随之穿入，即在电场作用下，基因 DNA
的金属颗粒发生高速运动，使 DNA导入细胞中。
它与颗粒大小、电场的电压有关。
三、基因治疗的策略
? (一 )缺陷基因的基因置换疗法
? (二 )基因修饰疗法
? (三 )基因失活疗法
(一 )缺陷基因的基因置换疗法
? 缺陷基因的基因置换疗法就是以正常的基因置
换缺陷基因，而将细胞中原缺陷基因去除后，
改用正常而有功能的基因进行替换，使缺陷或
突变的基因在原位得到更正，此法可使单基因
遗传病达到治愈的最佳疗效，但目前尚不能用
于临床，治疗人的遗传病，只能进行动物的实
验研究。若不需完整基因置换，而是使致病基
因的单个碱基发生突变，以正常的碱基纠正致
病基因中的某个突变碱基，也可使单基因遗传
病得以永久治疗，此法又称基因修正疗法，但
目前尚无基因修正的有力措施。
(二 )基因修饰疗法
? 基因修饰疗法又称基因添加疗法，就是
将正常的基因导入病灶原发的细胞或其
它细胞 (如免疫细胞 )，其表达产物可以补
偿或纠正异常基因的功能，但异常的致
病基因本身并未得到改变，仍保留在细
胞中，此法导入的基因并非原位导入，
因此，表达水平和调控难以取得理想的
结果，最理想的应是基因置换和基因修
正策略。
(三 )基因失活疗法
? 基因失活疗法是将遗传病或肿瘤等患者
体内过分表达异常产物的异常基因或在
癌细胞中与恶性增加有关的活化癌基因，
使其得到抑制或封闭，甚至失活的基因
疗法，以达到异常基因的表达受到抑制
或封闭，甚至完全停止，反义 DNA/RNA
及小 RNA干涉技术的抗肿瘤基因治疗是
基因失活的理想方法。
四、基因治疗的临床应用
? （一）遗传性疾病的基因治疗 （表 20-2）
? （二） 肿瘤的基因治疗
? （三） 抗病毒的基因治疗
返回
（二）肿瘤的基因治疗
? 1,目的基因的选择和治疗策略
? 2,基因治疗方法
? 3,细胞因子的基因治疗
? 4,提高机体抗肿瘤免疫力的基因治疗
1．目的基因的选择和治疗策略
? 肿瘤的基因治疗就是以正常的或野生型的基因
去取代不正常基因或阻止异常基因的表达，以
达到抑制或阻止、甚至逆转肿瘤细胞恶性表现
之目的，因此目的基因的选择是很重要的，常
选用的目的基因有：①增强机体细胞免疫功能，
促进杀肿瘤和抑制肿瘤细胞生长的免疫调节和
抗肿瘤作用的细胞因子基因如 IL-2,IFN和集
落刺激因子（ CSF）及 MHC的 HLA-B7,HLA-
DR基因。②抑癌基因，如 P53,WT-1和 Rb三种
基因，③原癌基因的反义 DNA及 RNA和 S
iRNA基因治疗的策略。
2．基因治疗方法
? （ 1） 抑癌基因转移的基因治疗
? （ 2） 反义寡核苷酸的原癌基因失活疗法
? （ 3） 药物自杀基因在肿瘤基因治疗中的应用
? （ 4）癌抗原基因转移的肿瘤基因治疗如打破
原先的肿瘤免疫的耐受，建立肿瘤特异免疫
? （ 5） 多重耐药性基因转移的肿瘤基因 治疗
（ 1）抑癌基因转移的基因治疗
? 抑癌基因或肿瘤抑制基因（ Tumor Suppressor
gene）或血管形成抑制因子基因是肿瘤基因治
疗中很重要的基因，这种基因导入肿瘤或其他
细胞后其表达产物可抑制肿瘤及肿瘤细胞的恶
性增生、血管形成等，甚至可以使恶性肿瘤细
胞发生逆转，成为正常细胞，目前研究和应用
较多的抑癌基因包括 P53,WT-1,Rb,Ango和
Endo等基因，这些基因若发生突变、缺失或缺
陷，故失去抑制细胞恶性增生和血管形成的功
能常会致癌，若导入上述基因进行基因修饰就
可抑制癌细胞的恶性增生。
（ 2） 反义寡核苷酸的 原癌基
因 失活疗法
? 为了抑制肿瘤细胞中癌基因的过高表达，可根
据已知癌基因的核苷酸序列合成反义寡核苷酸，
来抑制 癌基因的表达（因反义寡核苷酸能与癌
基因核酸中的正链的特定顺序互补与结合形成
双链体）。反义寡核苷酸有以下几种：（ 1）
反义 RNA（ 2） 具核酶（ ribogyme）活性的反
义 RNA（ 3） 脱氧寡聚核苷酸（ oligodeo
xyribonucleotides,ODN） （ 4） 肽核酸（ peitide
nucleic acids,PNAS）
原癌基因
? 原癌基因（ Proto-oncogene）是在亿万年漫长生
物进化过程中高度保留的基因，说明原癌基因
在细胞内是具有重要功能的。能调控细胞生长、
增殖和分化。正常情况下表达受到严格的控制。
一旦调节失控，其基因产物为生长因子，生长
因子受体，胞内外传递信号等癌蛋白就会造成
分泌过剩，常导致细胞恶性增生和致癌，细胞
恶性转化与原癌基因的活化密切相关。原癌基
因活化程度对肿瘤的发生和发展具有重要的作
用，原癌基因活化包括基因点突变，融合基因
形成或异常激活后而引起表达量异常等。
反义 RNA技术
? 反义 RNA又是一种与 mRNA互补的 RNA分子，
它是双链 DNA中无意义链转录的 RNA，因此肿
瘤癌基因活化表达的 mRNA的起始翻译部位就
会被相应的反义 RNA互补结合形成 RNA/RNA
双链体，进而就阻止了核糖体与 mRNA结合，
或阻止核糖体沿 mRNA上移，以抑制 mRNA的
翻译，起到了抑制癌基因过高表达癌蛋白的效
果。反义 RNA技术与补充基因转移疗法的常规
技术相反，它走的是抑制基因（癌基因）表达
的路线，是一种干涉性基因治疗，以阻止或抑
制原癌基因的过度表达及抑制癌基因突变体
mRNA的成熟，属基因失活疗法。
具核酶活性的反义 RNA
? 在反义 RNA研究的基础上，现又设计出具核酶
（ ribogyme）活性的反义 RNA，它既能与
mRNA互补结合阻止 mRNA的翻译，同时反义
RNA上带有锤头状结构基因能对靶序列
（ mRNA）进行特异性切割，建立了核酶基因
治疗新技术，这种核酶反义 RNA可反复使用以
降解 mRNA，其抑癌效应明显高于反义 RNA，
这一技术为癌的基因治疗提供了新技术、新思
路，有较好的应用前景。 近来又发现 SiRNA也
能使其 mRNA降解，可使肿瘤基因沉默。
反基因技术
? 反基因技术（ autigene）,即根据癌基因序列制备出脱氧
寡聚核苷酸（ oligodeo xyribonucleotides,ODN）这种与
癌基因互补的 ODN能以 DNA双螺旋分子专一性序列为
靶物，与癌基因序列形成三螺旋 DNA，这样就阻止了
癌基因的转录，因此就可在癌基因转录水平上阻止癌
基因的活化，有人把三链 DNA称为“能够攻击病毒和
癌细胞而不损害健康组织的新型基因药物。反基因技
术的关键在 ODN的设计与合成，其作用机理是通过
ODN在 DNA结合蛋白的识别位点处，与靶基因（癌基
因）形成三螺旋，可专性地发挥干扰 DNA与蛋白的结
合，激活因子的转录起始或转录延长等，进而阻止了
癌基因的转录和高表达，达到“反基因”的目的 。
肽核酸
? 目前可通过计算机分析 DNA结构，提出用多肽
骨架结构取代 ODN中的糖 -磷酸骨架，并成功
地合成了该分子，这种以肽为骨架的多酰基寡
聚物称为肽核酸（ peitide nucleic acids,PNAS），
它保留了 ODN与 DNA的高度亲和力，因此能与
靶基因形成三螺旋结构，尽管此项技术目前只
是处于实验研究阶段，还有一些技术性问题尚
待解决，但终究会获得解决，应用潜力极大。
（ 3）药物自杀基因在肿瘤基因
治疗中的应用
? ① 药物自杀基因的作用机理
? ② 药物自杀基因的种类
? ③药物自杀基因作用的底物 -GCV/ACV
? ④ 药物自杀基因靶向转移的特异性，如
连接肿瘤相关抗原基因,α-FP针对肝癌
? ⑤药物自杀基因的临床应用前景
? ⑥
① 药物自杀基因的作用机理
? HSV- tk基因编码的蛋白质含 376个氨基酸,TK为胸苷
激酶是催化脱氧胸苷变成脱氧胸苷酸的酶，在细胞中
TK的作用底物范围较窄，而 HSV中的 TK可催化一些核
苷酸类似物（ NAs）的磷酸化，如 GCV,ACV等，对
作用底物范围较宽，上述这些 NAs不能在细胞 TK作用
下磷酸化，因此对未转染 HSV-tk的细胞不起作用，但
在导入和表达 HSV-tk的细胞中,NAs可以被磷酸化，
其磷酸化过程为 NAs→NAsMP→NAsDP→NAsTP 。
NAsTP对细胞有强烈毒性。可抑制细胞 DNA聚合酶活
性或作为三磷酸脱氧胸苷（ dTTP）的竞争性抑制物掺
入到细胞合成的 DNA内，使细胞 DNA合成受抑或被阻
断，进而导致细胞死亡（即凋亡）。
② 药物自杀基因的种类
? 除 HSV-tk基因为公认的药物自杀基因外，
还有水痘带状疱疹病毒的 tk基因（ VIV-
tk）,大肠杆菌的 DeoDa基因，细胞色素 P-
450基因，黄嘌呤一鸟嘌呤核糖转移酶
（ XGPPT）等。均可将 NAs变为细胞的
毒性产物，抑制细胞 DNA合成。
⑦ 多重耐药性基因转移的肿瘤
基因治疗
? 肿瘤化疗中面临的最大问题是肿瘤细胞的耐药
性以及造血细胞对化疗药物的敏感性，多重耐
药基因（ MDR）可诱导产生耐药表型，转移造
血干细胞可以提高细胞对化疗药物耐受，近而
又可提高化疗剂量，相对提高了肿瘤对药物的
敏感性。此外，也可以将耐药基因的反义 RNA
转入肿瘤细胞中，以抑制肿瘤细胞对耐药基因
的表达，降低了耐药性，从而有助于提高肿瘤
细胞对化疗药物的敏感性。
3．细胞因子的基因治疗
? 将细胞因子基因导入细胞，使其在局部持续分
泌一定量的细胞因子。细胞因子可直接杀伤瘤
细胞（如 TNFα），免疫调节因子（如 IL-2）可
通过调节免疫网络刺激机体免疫系统，增强免
疫应答，发挥抗肿瘤作用。目前采用的细胞因
子基因有干扰素、白细胞介素，肿瘤坏死因子，
集落刺激因子等相关基因，导入免疫细胞，肿
瘤和非肿瘤细胞中来实施人体的基因治疗。
4．提高机体抗肿瘤免疫力的基
因治疗
? 细胞因子的基因治疗，是提高机体抗肿瘤免疫
力的较好的基因治疗方案，但肿瘤细胞有的不
表达肿瘤特异性抗原，因而不能被免疫 T细胞
识别，有的虽能表达特异性抗原，但缺少 MHC
抗原表达，又使 T细胞难以进行限制性识别，
因而 T细胞不能被激活，使肿瘤细胞避免了机
体的免疫监视，有人把病毒基因或抗原基因转
移到肿瘤细胞中以增强肿瘤细胞的异质性，这
种转基因的肿瘤细胞等于是引起肿瘤免疫应答
的“瘤苗”,有利于 T细胞产生共刺激信号，
行使对肿瘤细胞的免疫应答，增强机体抗肿瘤
免疫力。
（三）抗病毒的基因治疗
? 病毒病的基因治疗主要集中在治疗艾滋
病方面，抗病毒的基因治疗策略与抗肿
瘤基因治疗大致相同，主要是采用基因
修饰和基因失活的治疗策略，具体方案
为：①阻止病毒复制策略、②使感染 HIV
细胞死亡的方法,③降解策略。
五、基因治疗的问题与前景
? 前景广阔，但问题也不少。如 1.论理学
问题 2.安全性问题 3.技术性问题 4.商品化
问题 5.疗效问题
目的基因的准备
? 其表达产物已证明有活性，功能确切，
在启动子下游可表达，有标记基因筛选，
监控重组体。
受体细胞 (靶细胞 )的选择和培
养
? 易取材，易培养，基因易导入，对载体
敏感，可培养传代，寿命相对较长。能
达足够量，如疾病细胞，造血细胞、基
质细胞、上皮、成纤维、内皮细胞等均
可。
载体的选择
1,质粒载体（穿梭载体）既具有动物（人）
细胞表达元件，又具有细菌质粒相关元
件。
2,病毒载体,1.重组病毒载体：基因重组
病毒可直接感染细胞导入基因 2.重组质
粒型病毒载体：在细菌中扩增质粒，体
外包装形成假病毒，感染靶细胞，将基
因导入。
DNA—磷酸钙共沉淀法
? 基因加氯化钙再加入 Hepes形成 DNA-磷
酸钙沉淀颗粒，被细胞吞入。
DEAE—葡聚糖法
? 基因加 DEAE-dextron，形成复合物，被
细胞吞入或先用 DEAE处理细胞再加
DNA，而后被吞入。
染色体介导法
? 收集分裂中期染色体，用磷酸钙共沉淀
法导入。
聚阳离子 —DMSO转染技术
? 先用 DMSO处理细胞（改变通透性），
再加入聚阳离子处理的 DNA（增加细胞
表面吸附能力）。
细胞融合法
? PEG/仙台病毒使供 /受细胞融合。
脂质体介导法
? 脂质体包被基因 DNA后，加入 PEG预处
理的受体细胞，使细胞融合。
原生质体融合法
? 将目的基因质粒重组菌制成感受态，在
溶菌酶作用下，释放原生质体，再加入
原先用 PEG处理的受体细胞，发生原生
质体与受体细胞融合。
微细胞核介导法
? 供体细胞先用秋水仙素处理，再用细胞
松弛素处理（脱核），制成微核细胞，
再加 PEG处理的受体细胞，再进行细胞
融合。
5.基因转移的病毒载体法
? 不同组织细胞和目的基因选用不同的病
毒载体
? 不同的病毒载体选用不同扩增方式、敏
感细胞或包装细胞
? 不同的病毒载体有不同的扩增、包装、
感染、整合 /游离的表达方式，如 表 20-1
特定组织细胞
可考虑的主要基因转移方法和途径
游离淋巴细胞 (ex vivo)
逆转录病毒载体，基因枪，电穿孔
肺组织
腺病毒载体，气溶胶
骨骼肌内组织
裸 DNA直接注射，基因枪
脑组织
单纯疮疹病毒载体
动脉管壁组织
逆转录病毒转染内皮细胞 (ex VIVO)
通过脂质体或气囊导管回输
肝组织
逆转录病毒，直接注射 (腹膜内注射，感染宫
内动物 )或部分肝切除后门静脉内 (或肝实质
内 )注射,ASOR—PL—
DNA复合物 ASGP受体结合，基因枪。
乳腺组织
逆转录病毒载体（乳头管注射）
皮肤组织
基因枪，电穿孔
? 一、基因治疗的 概念 及 遵循原则
? 二,基因治疗的程序
? 三,基因治疗的策略
? 四,基因治疗的临床应用
? 五,基因治疗的问题与前景
? 六、裂解型（ HSV-Ⅰ ）载体用于脑肿瘤
的基因治疗 (如图 )
基因治疗的概念
? 基因治疗就是将有功能的基因转移到病人的细胞中以
纠正或置换致病基因的一种治疗方法，是指有功能的
目的基因导入靶细胞后与宿主细胞内的基因发生整合，
成为宿主细胞遗传物质的一部分，目的基因的表达产
物起到对疾病的治疗作用。若目的基因不与宿主细胞
基因组发生整合，但可通过暂时表达产物发挥治疗作
用的方法叫基因疗法（ gene therapeutics），此法实际
上就如同临床上使用的药物治疗一样，这与传统意义
上的基因治疗是有区别的。基因治疗常采取四大措施，
包括,(1)基因置换 (gene reptacement) (2)基因修正 (gene
correction) (3)基因修饰 (gene augmentation) (4)基因失活
(gene inactivation)
基因置换
? 基因置换 (gene reptacement)：是指将致病
基因整个地被有功能的正常基因所置换，
使致病基因永久地得到更正。但操作难
度大，有伦理学问题。
基因修正
? 基因修正 (gene correction)是指将致病基
因的突变碱基序列得以纠正，而正常序
列部分予以保留，使突变的致病基因恢
复正常功能。即使致病基因的突变序列
纠正为正常序列（用碱基点突变技术）。
基因修饰
? 基因修饰 (gene augmentation)则是指将目
的基因导入缺陷细胞或其它细胞，目的
基因的表达产物可修饰和改变缺陷细胞
的功能或使原有的功能得到加强。
基因失活
? 基因失活 (gene inactivation)就是应用反义
技术 (antisense technology)特异封闭某些
基因的表达，以达到抑制或阻止某些有
害基因的表达。 SiRNA的基因干扰可造
成靶基因（异常基因）的失活（或沉
默）。
基因治疗遵循的原则
基因治疗应遵循的基本原则为,
? 1．治疗的疾病应是指目前治疗方法难以阻止疾病发展
的严重疾病。
? 2．遗传性疾病应是属于染色体“隐性”遗传的疾病，
即指来自双亲的二条染色体上同一基因位点都发生改
变的疾病，只要通过导入同一正常基因即可纠正缺陷。
? 3．能治疗疾病的正常基因已经被克隆，并能表达有功
能的产物。
? 4．基因治疗用的基因在体内表达无需精确调控，表达
产物过多不会产生危害。
? 5．注入体内带有外源基因的治疗细胞，应能自然消减
去除。
二、基因治疗的程序
? (一 )目的基因的准备
? (二 )受体细胞 (靶细胞 )的选择和培养 。
? (三 )载体的选择
? (四 )目的基因导入靶细胞的基因转移方法
目的基因导入靶细胞的基因转
移方法
? 1,基因转移的物理法
? 2,基因转移的化学法
? 3,基因转移的融合法
? 4,基因转移的颗粒轰击技术
? 5,基因转移的病毒载体法
1．基因转移的物理法
? (1)显微注射法
– ①真正的显微注射法：直接在显微镜下向胞
内注入基因
– ②穿刺法：先在胞膜、胞核上穿孔后导入基
因
? (2)电脉冲介导法：在高压电脉冲下，使
胞膜瞬间形成孔洞，基因在强电场下导
入，电场强度和持续时间随种类而异。
2．基因转移的化学法
? (1)DNA—磷酸钙共沉淀法
? (2)DEAE—葡聚糖法
? (3)染色体介导法
? (4)聚阳离子 —DMSO转染技术
3．基因转移的融合法
? (1)细胞融合法
? (2)脂质体介导法
? (3)原生质体融合法
? (4)微细胞核介导法
4．基因转移的颗粒轰击技术
? 目的基因 DNA质量较轻，在电场中不易获得较
高的运动速度，但用重金属钨或金等进行表面
包被以后，形成了具一定大小的颗粒，在电场
突然充电时包被 DNA的金属颗粒可获得较大的
能量，并沿电场方向作快速运动，可穿入到器
官，组织或培养的细胞中，使外源目的基因
DNA也随之穿入，即在电场作用下，基因 DNA
的金属颗粒发生高速运动，使 DNA导入细胞中。
它与颗粒大小、电场的电压有关。
三、基因治疗的策略
? (一 )缺陷基因的基因置换疗法
? (二 )基因修饰疗法
? (三 )基因失活疗法
(一 )缺陷基因的基因置换疗法
? 缺陷基因的基因置换疗法就是以正常的基因置
换缺陷基因，而将细胞中原缺陷基因去除后，
改用正常而有功能的基因进行替换，使缺陷或
突变的基因在原位得到更正，此法可使单基因
遗传病达到治愈的最佳疗效，但目前尚不能用
于临床，治疗人的遗传病，只能进行动物的实
验研究。若不需完整基因置换，而是使致病基
因的单个碱基发生突变，以正常的碱基纠正致
病基因中的某个突变碱基，也可使单基因遗传
病得以永久治疗，此法又称基因修正疗法，但
目前尚无基因修正的有力措施。
(二 )基因修饰疗法
? 基因修饰疗法又称基因添加疗法，就是
将正常的基因导入病灶原发的细胞或其
它细胞 (如免疫细胞 )，其表达产物可以补
偿或纠正异常基因的功能，但异常的致
病基因本身并未得到改变，仍保留在细
胞中，此法导入的基因并非原位导入，
因此，表达水平和调控难以取得理想的
结果，最理想的应是基因置换和基因修
正策略。
(三 )基因失活疗法
? 基因失活疗法是将遗传病或肿瘤等患者
体内过分表达异常产物的异常基因或在
癌细胞中与恶性增加有关的活化癌基因，
使其得到抑制或封闭，甚至失活的基因
疗法，以达到异常基因的表达受到抑制
或封闭，甚至完全停止，反义 DNA/RNA
及小 RNA干涉技术的抗肿瘤基因治疗是
基因失活的理想方法。
四、基因治疗的临床应用
? （一）遗传性疾病的基因治疗 （表 20-2）
? （二） 肿瘤的基因治疗
? （三） 抗病毒的基因治疗
返回
（二）肿瘤的基因治疗
? 1,目的基因的选择和治疗策略
? 2,基因治疗方法
? 3,细胞因子的基因治疗
? 4,提高机体抗肿瘤免疫力的基因治疗
1．目的基因的选择和治疗策略
? 肿瘤的基因治疗就是以正常的或野生型的基因
去取代不正常基因或阻止异常基因的表达，以
达到抑制或阻止、甚至逆转肿瘤细胞恶性表现
之目的，因此目的基因的选择是很重要的，常
选用的目的基因有：①增强机体细胞免疫功能，
促进杀肿瘤和抑制肿瘤细胞生长的免疫调节和
抗肿瘤作用的细胞因子基因如 IL-2,IFN和集
落刺激因子（ CSF）及 MHC的 HLA-B7,HLA-
DR基因。②抑癌基因，如 P53,WT-1和 Rb三种
基因，③原癌基因的反义 DNA及 RNA和 S
iRNA基因治疗的策略。
2．基因治疗方法
? （ 1） 抑癌基因转移的基因治疗
? （ 2） 反义寡核苷酸的原癌基因失活疗法
? （ 3） 药物自杀基因在肿瘤基因治疗中的应用
? （ 4）癌抗原基因转移的肿瘤基因治疗如打破
原先的肿瘤免疫的耐受，建立肿瘤特异免疫
? （ 5） 多重耐药性基因转移的肿瘤基因 治疗
（ 1）抑癌基因转移的基因治疗
? 抑癌基因或肿瘤抑制基因（ Tumor Suppressor
gene）或血管形成抑制因子基因是肿瘤基因治
疗中很重要的基因，这种基因导入肿瘤或其他
细胞后其表达产物可抑制肿瘤及肿瘤细胞的恶
性增生、血管形成等，甚至可以使恶性肿瘤细
胞发生逆转，成为正常细胞，目前研究和应用
较多的抑癌基因包括 P53,WT-1,Rb,Ango和
Endo等基因，这些基因若发生突变、缺失或缺
陷，故失去抑制细胞恶性增生和血管形成的功
能常会致癌，若导入上述基因进行基因修饰就
可抑制癌细胞的恶性增生。
（ 2） 反义寡核苷酸的 原癌基
因 失活疗法
? 为了抑制肿瘤细胞中癌基因的过高表达，可根
据已知癌基因的核苷酸序列合成反义寡核苷酸，
来抑制 癌基因的表达（因反义寡核苷酸能与癌
基因核酸中的正链的特定顺序互补与结合形成
双链体）。反义寡核苷酸有以下几种：（ 1）
反义 RNA（ 2） 具核酶（ ribogyme）活性的反
义 RNA（ 3） 脱氧寡聚核苷酸（ oligodeo
xyribonucleotides,ODN） （ 4） 肽核酸（ peitide
nucleic acids,PNAS）
原癌基因
? 原癌基因（ Proto-oncogene）是在亿万年漫长生
物进化过程中高度保留的基因，说明原癌基因
在细胞内是具有重要功能的。能调控细胞生长、
增殖和分化。正常情况下表达受到严格的控制。
一旦调节失控，其基因产物为生长因子，生长
因子受体，胞内外传递信号等癌蛋白就会造成
分泌过剩，常导致细胞恶性增生和致癌，细胞
恶性转化与原癌基因的活化密切相关。原癌基
因活化程度对肿瘤的发生和发展具有重要的作
用，原癌基因活化包括基因点突变，融合基因
形成或异常激活后而引起表达量异常等。
反义 RNA技术
? 反义 RNA又是一种与 mRNA互补的 RNA分子，
它是双链 DNA中无意义链转录的 RNA，因此肿
瘤癌基因活化表达的 mRNA的起始翻译部位就
会被相应的反义 RNA互补结合形成 RNA/RNA
双链体，进而就阻止了核糖体与 mRNA结合，
或阻止核糖体沿 mRNA上移，以抑制 mRNA的
翻译，起到了抑制癌基因过高表达癌蛋白的效
果。反义 RNA技术与补充基因转移疗法的常规
技术相反，它走的是抑制基因（癌基因）表达
的路线，是一种干涉性基因治疗，以阻止或抑
制原癌基因的过度表达及抑制癌基因突变体
mRNA的成熟，属基因失活疗法。
具核酶活性的反义 RNA
? 在反义 RNA研究的基础上，现又设计出具核酶
（ ribogyme）活性的反义 RNA，它既能与
mRNA互补结合阻止 mRNA的翻译，同时反义
RNA上带有锤头状结构基因能对靶序列
（ mRNA）进行特异性切割，建立了核酶基因
治疗新技术，这种核酶反义 RNA可反复使用以
降解 mRNA，其抑癌效应明显高于反义 RNA，
这一技术为癌的基因治疗提供了新技术、新思
路，有较好的应用前景。 近来又发现 SiRNA也
能使其 mRNA降解，可使肿瘤基因沉默。
反基因技术
? 反基因技术（ autigene）,即根据癌基因序列制备出脱氧
寡聚核苷酸（ oligodeo xyribonucleotides,ODN）这种与
癌基因互补的 ODN能以 DNA双螺旋分子专一性序列为
靶物，与癌基因序列形成三螺旋 DNA，这样就阻止了
癌基因的转录，因此就可在癌基因转录水平上阻止癌
基因的活化，有人把三链 DNA称为“能够攻击病毒和
癌细胞而不损害健康组织的新型基因药物。反基因技
术的关键在 ODN的设计与合成，其作用机理是通过
ODN在 DNA结合蛋白的识别位点处，与靶基因（癌基
因）形成三螺旋，可专性地发挥干扰 DNA与蛋白的结
合，激活因子的转录起始或转录延长等，进而阻止了
癌基因的转录和高表达，达到“反基因”的目的 。
肽核酸
? 目前可通过计算机分析 DNA结构，提出用多肽
骨架结构取代 ODN中的糖 -磷酸骨架，并成功
地合成了该分子，这种以肽为骨架的多酰基寡
聚物称为肽核酸（ peitide nucleic acids,PNAS），
它保留了 ODN与 DNA的高度亲和力，因此能与
靶基因形成三螺旋结构，尽管此项技术目前只
是处于实验研究阶段，还有一些技术性问题尚
待解决，但终究会获得解决，应用潜力极大。
（ 3）药物自杀基因在肿瘤基因
治疗中的应用
? ① 药物自杀基因的作用机理
? ② 药物自杀基因的种类
? ③药物自杀基因作用的底物 -GCV/ACV
? ④ 药物自杀基因靶向转移的特异性，如
连接肿瘤相关抗原基因,α-FP针对肝癌
? ⑤药物自杀基因的临床应用前景
? ⑥
① 药物自杀基因的作用机理
? HSV- tk基因编码的蛋白质含 376个氨基酸,TK为胸苷
激酶是催化脱氧胸苷变成脱氧胸苷酸的酶，在细胞中
TK的作用底物范围较窄，而 HSV中的 TK可催化一些核
苷酸类似物（ NAs）的磷酸化，如 GCV,ACV等，对
作用底物范围较宽，上述这些 NAs不能在细胞 TK作用
下磷酸化，因此对未转染 HSV-tk的细胞不起作用，但
在导入和表达 HSV-tk的细胞中,NAs可以被磷酸化，
其磷酸化过程为 NAs→NAsMP→NAsDP→NAsTP 。
NAsTP对细胞有强烈毒性。可抑制细胞 DNA聚合酶活
性或作为三磷酸脱氧胸苷（ dTTP）的竞争性抑制物掺
入到细胞合成的 DNA内，使细胞 DNA合成受抑或被阻
断，进而导致细胞死亡（即凋亡）。
② 药物自杀基因的种类
? 除 HSV-tk基因为公认的药物自杀基因外，
还有水痘带状疱疹病毒的 tk基因（ VIV-
tk）,大肠杆菌的 DeoDa基因，细胞色素 P-
450基因，黄嘌呤一鸟嘌呤核糖转移酶
（ XGPPT）等。均可将 NAs变为细胞的
毒性产物，抑制细胞 DNA合成。
⑦ 多重耐药性基因转移的肿瘤
基因治疗
? 肿瘤化疗中面临的最大问题是肿瘤细胞的耐药
性以及造血细胞对化疗药物的敏感性，多重耐
药基因（ MDR）可诱导产生耐药表型，转移造
血干细胞可以提高细胞对化疗药物耐受，近而
又可提高化疗剂量，相对提高了肿瘤对药物的
敏感性。此外，也可以将耐药基因的反义 RNA
转入肿瘤细胞中，以抑制肿瘤细胞对耐药基因
的表达，降低了耐药性，从而有助于提高肿瘤
细胞对化疗药物的敏感性。
3．细胞因子的基因治疗
? 将细胞因子基因导入细胞，使其在局部持续分
泌一定量的细胞因子。细胞因子可直接杀伤瘤
细胞（如 TNFα），免疫调节因子（如 IL-2）可
通过调节免疫网络刺激机体免疫系统，增强免
疫应答，发挥抗肿瘤作用。目前采用的细胞因
子基因有干扰素、白细胞介素，肿瘤坏死因子，
集落刺激因子等相关基因，导入免疫细胞，肿
瘤和非肿瘤细胞中来实施人体的基因治疗。
4．提高机体抗肿瘤免疫力的基
因治疗
? 细胞因子的基因治疗，是提高机体抗肿瘤免疫
力的较好的基因治疗方案，但肿瘤细胞有的不
表达肿瘤特异性抗原，因而不能被免疫 T细胞
识别，有的虽能表达特异性抗原，但缺少 MHC
抗原表达，又使 T细胞难以进行限制性识别，
因而 T细胞不能被激活，使肿瘤细胞避免了机
体的免疫监视，有人把病毒基因或抗原基因转
移到肿瘤细胞中以增强肿瘤细胞的异质性，这
种转基因的肿瘤细胞等于是引起肿瘤免疫应答
的“瘤苗”,有利于 T细胞产生共刺激信号，
行使对肿瘤细胞的免疫应答，增强机体抗肿瘤
免疫力。
（三）抗病毒的基因治疗
? 病毒病的基因治疗主要集中在治疗艾滋
病方面，抗病毒的基因治疗策略与抗肿
瘤基因治疗大致相同，主要是采用基因
修饰和基因失活的治疗策略，具体方案
为：①阻止病毒复制策略、②使感染 HIV
细胞死亡的方法,③降解策略。
五、基因治疗的问题与前景
? 前景广阔，但问题也不少。如 1.论理学
问题 2.安全性问题 3.技术性问题 4.商品化
问题 5.疗效问题
目的基因的准备
? 其表达产物已证明有活性，功能确切，
在启动子下游可表达，有标记基因筛选，
监控重组体。
受体细胞 (靶细胞 )的选择和培
养
? 易取材，易培养，基因易导入，对载体
敏感，可培养传代，寿命相对较长。能
达足够量，如疾病细胞，造血细胞、基
质细胞、上皮、成纤维、内皮细胞等均
可。
载体的选择
1,质粒载体（穿梭载体）既具有动物（人）
细胞表达元件，又具有细菌质粒相关元
件。
2,病毒载体,1.重组病毒载体：基因重组
病毒可直接感染细胞导入基因 2.重组质
粒型病毒载体：在细菌中扩增质粒，体
外包装形成假病毒，感染靶细胞，将基
因导入。
DNA—磷酸钙共沉淀法
? 基因加氯化钙再加入 Hepes形成 DNA-磷
酸钙沉淀颗粒，被细胞吞入。
DEAE—葡聚糖法
? 基因加 DEAE-dextron，形成复合物，被
细胞吞入或先用 DEAE处理细胞再加
DNA，而后被吞入。
染色体介导法
? 收集分裂中期染色体，用磷酸钙共沉淀
法导入。
聚阳离子 —DMSO转染技术
? 先用 DMSO处理细胞（改变通透性），
再加入聚阳离子处理的 DNA（增加细胞
表面吸附能力）。
细胞融合法
? PEG/仙台病毒使供 /受细胞融合。
脂质体介导法
? 脂质体包被基因 DNA后，加入 PEG预处
理的受体细胞，使细胞融合。
原生质体融合法
? 将目的基因质粒重组菌制成感受态，在
溶菌酶作用下，释放原生质体，再加入
原先用 PEG处理的受体细胞，发生原生
质体与受体细胞融合。
微细胞核介导法
? 供体细胞先用秋水仙素处理，再用细胞
松弛素处理（脱核），制成微核细胞，
再加 PEG处理的受体细胞，再进行细胞
融合。
5.基因转移的病毒载体法
? 不同组织细胞和目的基因选用不同的病
毒载体
? 不同的病毒载体选用不同扩增方式、敏
感细胞或包装细胞
? 不同的病毒载体有不同的扩增、包装、
感染、整合 /游离的表达方式，如 表 20-1
特定组织细胞
可考虑的主要基因转移方法和途径
游离淋巴细胞 (ex vivo)
逆转录病毒载体，基因枪，电穿孔
肺组织
腺病毒载体，气溶胶
骨骼肌内组织
裸 DNA直接注射，基因枪
脑组织
单纯疮疹病毒载体
动脉管壁组织
逆转录病毒转染内皮细胞 (ex VIVO)
通过脂质体或气囊导管回输
肝组织
逆转录病毒，直接注射 (腹膜内注射，感染宫
内动物 )或部分肝切除后门静脉内 (或肝实质
内 )注射,ASOR—PL—
DNA复合物 ASGP受体结合，基因枪。
乳腺组织
逆转录病毒载体（乳头管注射）
皮肤组织
基因枪，电穿孔
