第七章 核酸分子杂交
核酸分子杂交是指具有一定同源序列的两条核酸
单链在一定条件下按碱基互补配对原则退火形成异
质双链的过程,即来源不同的两条单链核酸分子通过
碱基互补可形成异源双螺旋, 称为核酸分子杂交
(hybridization)。 具有灵敏度高, 特异性强等优点,
主要用于特异 DNA或 RNA的定性, 定量检测 。
?第一节 核酸分子杂交的基本原理
?第二节 核酸探针
?第三节 核酸分子杂交技术
第一节 核酸分子杂交的基本原理
DNA和 DNA链, RNA与 DNA链或两条 RNA链之间,
只要具有一定的互补序列均可在适当的条件下发生杂
交 。 常用已知的 DNA或 RNA的片段作为探针, 包括
特异的 DNA序列, 或转录的 RNA序列或 cDNA序列,
或人工合成的寡核苷酸片段 。
根据支持物的不同，分为固相杂交和液相杂交。
固相杂交又包括膜上印迹杂交和细胞原位杂交两种。
膜上印迹杂交即将核酸从细胞中分离纯化后，在体外
与探针杂交，细胞原位杂交是在细胞内进行的杂交。
一, 杂交的稳定性 （ 表 7-1）
Tm是核酸双链解链成单链过程中, 其克原子消光
系数 ? (P)值的增加达到最高值一半时的温度 。 不同
杂交双链其 Tm值不同, 影响因素有,
(1) 杂交链 GC含量愈高的杂交双链其 Tm值愈高 。
(2) 杂交链愈长其 Tm值愈高 。
(3) 杂交双链的碱基错配程度 。
(4) 溶液的离子强度越大, Tm值愈高 。
变性剂可影响碱基堆积力和氢键的形成，可降低
Tm值，常用甲酰胺、脲及二甲基亚砜等。用 50%的
甲酰胺大约可使杂交双链的 Tm值降低 30℃ 。
二, 杂交动力学
杂交过程的第一步是两条核酸单链随机碰撞形成局
部双链, 如果此局部双链周围的碱基不配对则会重新
解离, 继续碰撞, 一旦找到正确的互补区, 两侧的序
列迅速配对形成完整的双链分子, 后一步反应是一个
自发过程 。
影响因素主要有,
(1) 探针浓度, 长度和复杂性
探针浓度越高, 复性速度越快 。
探针越长, 扩散速度越慢, 复杂性越高, 配对难度越
大 。
(2) 离子强度
高离子强度溶液中, 其正离子可中和 DNA链磷酸
基团的负电荷, 消除其间的静电斥力, 有利于杂交分
子的形成 。
(3) 温度
通常杂交温度在低于 Tm 20~25℃ 温度下进行 。 不
含变性剂甲酰胺时, 大多数杂交反应在 68℃ 进行 。 当
含 50%甲酰胺时, 在 42℃ 进行 。
寡核苷酸探针一般在低于 Tm值 5℃ ~10℃ 下进行 。
(4) 杂交促进剂
用硫酸葡聚糖，其微粒的表面可以吸附 DNA探针
分子，使接触面积增大，有利于杂交反应。
(5) 杂交条件的严谨性
所谓严谨性 (stringency)，是指杂交反应体系，
避免非同源性或部分同源性的核酸序列形成杂交复
合物的严格程度。反应温度升高，离子强度降低，
会增加反应的严谨性，适用于匹配好的或序列完全
同源的核酸的杂交反应，或用于检测点突变；反之，
则适用于匹配差或序列不完全同源的核酸杂交反应。
第二节 核酸探针
核酸探针是指带有放射性同位素, 生物素或其他
活性物质标记的某种特定的 DNA或 RNA片段 。
一, 核酸探针的类型
㈠ 基因组 DNA探针
用克隆化的基因片段作探针应尽可能选用基因的编
码序列 (外显子 )。
㈡ cDNA探针
与 mRNA互补的 DNA链称 cDNA,特异性高，是
一种较理想的核酸探针。
㈢ RNA探针
RNA探针有下述优点,
① 杂交体的稳定性高, 杂交反应条件严格, 特异性更
高 。
② RNA单链不存在双链 DNA探针的互补双链的复性,
杂交效率较高 。
③ RNA无高度重复序列, 非特异杂交少 。
④ 杂交后用 RNase消化未杂交的 RNA探针, 可降低杂
交本底 。
㈣ 寡核苷酸探针
寡核苷酸探针是由实验者设计, 经核苷酸合成仪人工
合成的 。
1.探针制备方便, 可以根据需要设计合成各种寡核苷
酸片段, 从基因组 DNA文库或 cDNA文库中筛选特定
的克隆 。
2.非常适用于检测已知序列基因中的点突变或定点诱
变技术产生的点突变 。
3.用新的酶促方法标记可以得到高比活度标记探针 。
二, 标记物
标记物与探针的结合不影响杂交的特异性和稳定性 。
㈠ 放射性同位素
放射性同位素探针标记物, 有高度特异性, 缺点是易
造成放射性污染, 半衰期较短, 不能长期存放 。 常用
的有 32P,3H,35S,有时也用 14C,125I或 131I。
㈡ 非放射性标记物
(1) 半抗原
(2) 配体
(3) 荧光素
(4) 化学发光技术
三, 探针放射性同位素标记法
㈠ 放射性同位素的选择
32P,35S或 3H均可用于标记 DNA或 RNA。 32P最常用
于核酸的标记 。 35S适用于原位杂交和 DNA序列测定 。
3H放射比活度低, 故常用于原位杂交 。
㈡ 核酸探针的标记方法
⒈ 缺口平移法 (图 7-1)
大肠杆菌 DNA聚合酶 I具有 5′?3′DNA聚合酶活性，
以相对应的链为模板，从切口处 3′-OH端逐个加入新
的核苷酸，此酶还具有 5′?3′外切核酸酶活性，可从
切口的 5′端逐个切去核苷酸，造成切口平移。若反应
体系中存在一种或多种标记的核苷酸，如 [?-32P]
dNTP，则随着反应的进行，这些标记的核苷酸将置
换原有的核苷酸，制备出核素标记的 DNA探针。缺口
平移法适用于标记大于 1 kb的双链 DNA。
⒉ 随机引物法 (图 7-2)
随机引物法的基本原理是 DNA聚合酶可利用随机引
物, 沿单链模板进行 DNA的合成 。
⒊ 末端标记
只将 DNA 3′端或 5′端标记的方法称末端标记, 常用的
方法如下,
(1) DNA聚合酶 I Klenow片段末端标记法 (图 7-3)。 用
该酶将含有核素标记的 dNTP补平切口或粘性末端 。
(2) T4DNA聚合酶标记法 。 加入 dNTP后抑制外切
活性可将标记的 dNTP进行填充标记 。
(3) T4多核苷酸激酶标记法 。 用该酶可将 ?-32P从 [?-
32P] ATP转移至核酸的 5′-OH端
(4) 末端脱氧核苷酸转移酶标记法 。 将多种标记的
dNTP逐个转移到核酸缺口中的 3′-OH端, 形成长尾
标记 。
㈢ 放射自显影检测杂交信号
利用放射线在 X线片的成影作用来检测杂交信号, 称
为放射自显影 。 这种方法的操作步骤如下,
(1) 将滤膜用保鲜膜包好, 置于暗盒中 。
(2) 在暗室中, 将磷钨酸钙增感屏前屏置滤膜上, 光
面向上, 压 1~2张 X线片, 而后再压上增感屏后屏,
光面向 X线片, 盖上暗盒, 置于 70℃, 曝光适当的时
间 。
(3) 根据放射线的强度曝光一定的时间后, 在暗室里
取出 X线片, 显影定影 。 如曝光不足, 可再压片重新
曝光 。
㈠ 生物素标记
生物素能以共价结合方式连接到 UTP或 dUTP的嘧啶
环 C5位置上, 形成生物素化的核苷酸 (图 7-4)。
1,掺入标记法：生物素标记的 dNTP可代替相应的
单核苷酸, 在 DNA聚合酶的作用下, 通过随机引物
法或缺口平移法, 将生物素化核苷酸掺入到 DNA分
子中, 获得生物素标记的 DNA探针 。
2,光敏生物素标记法：先通过连接臂将一个光敏基
团连接于生物素, 成为光敏生物素 (photobiotin)，
如图 7-5。
㈡ 半抗原地高辛配基标记方法
将 Dig与 dUTP(或 dCTP,dCTP)相连生成 Dig-dUTP
复合物, 再通过切口平移法和随机引物法将其掺入
到 DNA上 (图 7-6)。
㈢ 非放射性核酸探针的检测
非放射性同位素标记的探针, 除酶直接标记探针外,
其它非放射性标记物并不能被直接检测, 需先将非放
射性标记物与检测系统偶联, 再显色 。
⒈ 偶联反应：大多数非放射性标记物是半抗原 (如地高
辛 ),因此可以通过抗原抗体反应系统与显色体系偶联：
Dig-DNA探针 +抗 Dig抗体 -碱性磷酸酶 (或辣根过氧化
物酶 )+底物 (BCIP和 NBT)；生物素可与抗生物素蛋白
(卵白素, avidin)或链亲合素 (streptavidin)结合, 再与
显色体系相偶联 。
⒉ 显色反应：通过连接在抗体或抗生物素蛋白上的显色物质
(如酶, 荧光素等 )进行杂交信号的检测 。 碱性磷酸酶可使其底
物 BCIP脱磷并聚合, 在此过程中释放出的氢可使 NBT (四氮唑
蓝 )还原而形成紫色的化合物 (图 7-7)。
第三节 核酸分子杂交技术
在液体中进行杂交反应称为液相杂交；在固相支持
物上进行杂交则称为固相杂交 。
固相杂交包括膜上印迹杂交和细胞原位杂交两类 。
固相杂交是印迹技术及杂交信号检测技术等相结合,
从而获得清晰的杂交图谱, 有利于定性或定量分析待
测核酸样品中的特定片段 (靶序列 ),在核酸的结构和
功能研究以及基因工程研究中, 其应用比液相杂交更
为广泛, 其技术发展也更为迅速 。
一, 膜上印迹杂交
膜上印迹杂交是指将待测核酸序列结合到一定的
支持物上，然后与存在于液相中的核酸探针进行杂交
的过程，是目前最常用的一种核酸分子杂交方法。
㈠ 滤膜杂交的基本过程 如图 7-8所示 。
(1) 核酸的制备
(2) 电泳
(3) 印迹
(4) 预杂交
(5) 杂交
(6) 洗膜
(7) 检测
㈡ 固相支持物的选择
一种良好的固相支持物应具备以下几个特点,
(1) 具有较强的结合核酸分子的能力, 一
(2) 与核酸分子结合后应不影响其与探针分子的
杂交反应 。
(3) 与核酸分子的结合稳定牢固,
(4) 非特异性吸附少 。
(5) 具有良好的机械性能 。
下面介绍几种常用的固相支持物,
(1) 硝酸纤维素膜：特别适用于蛋白质 (如抗体和酶等 )
的非放射性标记探针的杂交体系 。
(2) 尼龙膜 (nylon membrane)：尼龙膜结合单链及双链
DNA和 RNA的能力较硝酸纤维素膜更强, 耐碱处理适
合于一步法的菌落原位印迹法 。
尼龙膜的缺点是不宜使用非同位素探针, 即使用各种
蛋白 (如 BSA,牛奶等 )进行预杂交, 产生的杂交信号
本底较高, 与非特异吸附有关 。
PVDF膜：比尼龙膜结合力更强，且在预杂交中很容
易被封闭，使用同位素和非同位素探针都可产生较浅
的本底，而且结实耐用，可以多次杂交。
㈢ 印迹方法
⒈ 虹吸印迹法 (图 7-9)
利用毛细管的虹吸作用由转移缓冲液带动核酸分
子转移至滤膜上 。
⒉ 真空转移法 (图 7-10)
其原理是利用真空泵将转移缓冲液从上层容器中
通过凝胶抽到下层真空室中，同时带动核酸分子转
移到凝胶下面的滤膜上。该法的最大优点是快速，
转膜的同时进行 DNA的变性和中和，整个过程只需
1h左右。
⒊ 电转法如图 7-11所示。
㈣ 印迹类型
Southern印迹杂交法 (Southern blot hybridization)(图
7-12)。
2,Northern印迹杂交 (Northern blot hybridization),
Northern杂交是将 RNA样品变性和通过琼脂糖
凝胶电泳进行分离，再转移到硝酸纤维素膜等固相
载体上，用标记的 DNA或 RNA特异探针对固定在膜
上的 RNA进行杂交。其基本原理与 Southern杂交相
同，只不过变性方法不能采用碱变性法，因为碱导
致 RNA水解，一般采用聚乙二醛和二甲基亚砜、甲
醛、甲基氢氧化汞等变性方法。
3.斑点杂交 (dot hybridization)：直接将变性 DNA样
品点于硝酸纤维素膜上，固定好后先预杂交，再与
标记探针杂交，然后通过高严谨性冲洗 (低盐高温 )，
降低本底和提高特异性。预杂交和杂交可在密封袋
中进行，密封袋比较方便，反应体积小，可以使用
高浓度探针，封口前去除气泡，使杂交液与膜充分
接触，反应体积以膜不贴壁、能浮动为宜。探针与
同源样品杂交后，阳性结果产生斑点，故称斑点杂
交。
4.反向斑点杂交 (reverse dot hybridization)：直接将不
同的探针点印并固定在膜上, 再将待测的 DNA样品与
之杂交, 这样一次杂交反应就可以判断待测 DNA是否
含有这些探针的同源序列 。
5.菌落或噬菌斑杂交 (图 7-13)。
二, 核酸原位杂交
用标记的已知核酸序列为探针, 使其与细胞或组
织切片中核酸进行杂交检测的方法称为核酸原位杂
交 (nucleic acid hybridization in situ)
一般的原位杂交有两种类型：与胞内 DNA的杂交和
与 RNA的杂交 。
三, 液相杂交技术
液相杂交是指待测的核酸和标记的探针同时溶于
杂交液中进行反应, 然后分离杂交双链和未参加反
应的标记探针, 再进行检测 。
㈠ 核酸酶 Sl保护分析法 (nuclease Sl protection assay)
用标记的基因组 DNA作为探针, 在适宜条件下与
待测 RNA进行液相杂交, DNA外显子区可与 mRNA
形成 DNA:RNA杂交体, 而 DNA的其余部分 (内含子等 )
仍为单链, 核酸酶 S1可专一地降解未形成杂交体的
DNA单链, 而与 RNA杂交的 DNA区则受到保护不被
降解 。 通过聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分析消化产
物, 即可确定不被降解的 DNA片段大小, 用目的基因
不同区段的 DNA进行杂交, 可确定 mRNA的 3′,5′端
以及内含子的精确定位等, 通过杂交条带的光密度扫
描还可进行定量分析 (图 7-14,15)。
㈡ RNA酶保护分析法 (RNase protection assay)
其原理是体外转录合成一个高比放射活性的单链
RNA探针，此探针与待测 RNA互补，二者杂交后，
用 RNase A和 RNase T1消化，未形成双链的 RNA单
链被水解成单核苷酸，杂交形成的双链 RNA受到保
护，不被核酸酶水解，通过电泳进行 RNA:RNA杂交
体的检测。
四, 引物延伸分析法 (图 7-17)
引物延伸法可用于 RNA 5′端的定位及 mRNA的定
量, 还可检测 mRNA的前体和中间加工体 。 其原理
是待测 RNA与过量的 5′末端标记的单链 DNA引物 (合
成的寡核苷酸或限制性内切酶片段 )杂交, 随后用反
转录酶延伸此引物, 合成与 RNA互补的 cDNA,通过
变性聚丙烯酰胺凝胶电泳测定 cDNA长度, 该长度就
是引物末端与 RNA 5′端的距离, cDNA的量与 mRNA
样品中靶序列浓度成正比 。
核酸分子杂交是指具有一定同源序列的两条核酸
单链在一定条件下按碱基互补配对原则退火形成异
质双链的过程,即来源不同的两条单链核酸分子通过
碱基互补可形成异源双螺旋, 称为核酸分子杂交
(hybridization)。 具有灵敏度高, 特异性强等优点,
主要用于特异 DNA或 RNA的定性, 定量检测 。
?第一节 核酸分子杂交的基本原理
?第二节 核酸探针
?第三节 核酸分子杂交技术
第一节 核酸分子杂交的基本原理
DNA和 DNA链, RNA与 DNA链或两条 RNA链之间,
只要具有一定的互补序列均可在适当的条件下发生杂
交 。 常用已知的 DNA或 RNA的片段作为探针, 包括
特异的 DNA序列, 或转录的 RNA序列或 cDNA序列,
或人工合成的寡核苷酸片段 。
根据支持物的不同，分为固相杂交和液相杂交。
固相杂交又包括膜上印迹杂交和细胞原位杂交两种。
膜上印迹杂交即将核酸从细胞中分离纯化后，在体外
与探针杂交，细胞原位杂交是在细胞内进行的杂交。
一, 杂交的稳定性 （ 表 7-1）
Tm是核酸双链解链成单链过程中, 其克原子消光
系数 ? (P)值的增加达到最高值一半时的温度 。 不同
杂交双链其 Tm值不同, 影响因素有,
(1) 杂交链 GC含量愈高的杂交双链其 Tm值愈高 。
(2) 杂交链愈长其 Tm值愈高 。
(3) 杂交双链的碱基错配程度 。
(4) 溶液的离子强度越大, Tm值愈高 。
变性剂可影响碱基堆积力和氢键的形成，可降低
Tm值，常用甲酰胺、脲及二甲基亚砜等。用 50%的
甲酰胺大约可使杂交双链的 Tm值降低 30℃ 。
二, 杂交动力学
杂交过程的第一步是两条核酸单链随机碰撞形成局
部双链, 如果此局部双链周围的碱基不配对则会重新
解离, 继续碰撞, 一旦找到正确的互补区, 两侧的序
列迅速配对形成完整的双链分子, 后一步反应是一个
自发过程 。
影响因素主要有,
(1) 探针浓度, 长度和复杂性
探针浓度越高, 复性速度越快 。
探针越长, 扩散速度越慢, 复杂性越高, 配对难度越
大 。
(2) 离子强度
高离子强度溶液中, 其正离子可中和 DNA链磷酸
基团的负电荷, 消除其间的静电斥力, 有利于杂交分
子的形成 。
(3) 温度
通常杂交温度在低于 Tm 20~25℃ 温度下进行 。 不
含变性剂甲酰胺时, 大多数杂交反应在 68℃ 进行 。 当
含 50%甲酰胺时, 在 42℃ 进行 。
寡核苷酸探针一般在低于 Tm值 5℃ ~10℃ 下进行 。
(4) 杂交促进剂
用硫酸葡聚糖，其微粒的表面可以吸附 DNA探针
分子，使接触面积增大，有利于杂交反应。
(5) 杂交条件的严谨性
所谓严谨性 (stringency)，是指杂交反应体系，
避免非同源性或部分同源性的核酸序列形成杂交复
合物的严格程度。反应温度升高，离子强度降低，
会增加反应的严谨性，适用于匹配好的或序列完全
同源的核酸的杂交反应，或用于检测点突变；反之，
则适用于匹配差或序列不完全同源的核酸杂交反应。
第二节 核酸探针
核酸探针是指带有放射性同位素, 生物素或其他
活性物质标记的某种特定的 DNA或 RNA片段 。
一, 核酸探针的类型
㈠ 基因组 DNA探针
用克隆化的基因片段作探针应尽可能选用基因的编
码序列 (外显子 )。
㈡ cDNA探针
与 mRNA互补的 DNA链称 cDNA,特异性高，是
一种较理想的核酸探针。
㈢ RNA探针
RNA探针有下述优点,
① 杂交体的稳定性高, 杂交反应条件严格, 特异性更
高 。
② RNA单链不存在双链 DNA探针的互补双链的复性,
杂交效率较高 。
③ RNA无高度重复序列, 非特异杂交少 。
④ 杂交后用 RNase消化未杂交的 RNA探针, 可降低杂
交本底 。
㈣ 寡核苷酸探针
寡核苷酸探针是由实验者设计, 经核苷酸合成仪人工
合成的 。
1.探针制备方便, 可以根据需要设计合成各种寡核苷
酸片段, 从基因组 DNA文库或 cDNA文库中筛选特定
的克隆 。
2.非常适用于检测已知序列基因中的点突变或定点诱
变技术产生的点突变 。
3.用新的酶促方法标记可以得到高比活度标记探针 。
二, 标记物
标记物与探针的结合不影响杂交的特异性和稳定性 。
㈠ 放射性同位素
放射性同位素探针标记物, 有高度特异性, 缺点是易
造成放射性污染, 半衰期较短, 不能长期存放 。 常用
的有 32P,3H,35S,有时也用 14C,125I或 131I。
㈡ 非放射性标记物
(1) 半抗原
(2) 配体
(3) 荧光素
(4) 化学发光技术
三, 探针放射性同位素标记法
㈠ 放射性同位素的选择
32P,35S或 3H均可用于标记 DNA或 RNA。 32P最常用
于核酸的标记 。 35S适用于原位杂交和 DNA序列测定 。
3H放射比活度低, 故常用于原位杂交 。
㈡ 核酸探针的标记方法
⒈ 缺口平移法 (图 7-1)
大肠杆菌 DNA聚合酶 I具有 5′?3′DNA聚合酶活性，
以相对应的链为模板，从切口处 3′-OH端逐个加入新
的核苷酸，此酶还具有 5′?3′外切核酸酶活性，可从
切口的 5′端逐个切去核苷酸，造成切口平移。若反应
体系中存在一种或多种标记的核苷酸，如 [?-32P]
dNTP，则随着反应的进行，这些标记的核苷酸将置
换原有的核苷酸，制备出核素标记的 DNA探针。缺口
平移法适用于标记大于 1 kb的双链 DNA。
⒉ 随机引物法 (图 7-2)
随机引物法的基本原理是 DNA聚合酶可利用随机引
物, 沿单链模板进行 DNA的合成 。
⒊ 末端标记
只将 DNA 3′端或 5′端标记的方法称末端标记, 常用的
方法如下,
(1) DNA聚合酶 I Klenow片段末端标记法 (图 7-3)。 用
该酶将含有核素标记的 dNTP补平切口或粘性末端 。
(2) T4DNA聚合酶标记法 。 加入 dNTP后抑制外切
活性可将标记的 dNTP进行填充标记 。
(3) T4多核苷酸激酶标记法 。 用该酶可将 ?-32P从 [?-
32P] ATP转移至核酸的 5′-OH端
(4) 末端脱氧核苷酸转移酶标记法 。 将多种标记的
dNTP逐个转移到核酸缺口中的 3′-OH端, 形成长尾
标记 。
㈢ 放射自显影检测杂交信号
利用放射线在 X线片的成影作用来检测杂交信号, 称
为放射自显影 。 这种方法的操作步骤如下,
(1) 将滤膜用保鲜膜包好, 置于暗盒中 。
(2) 在暗室中, 将磷钨酸钙增感屏前屏置滤膜上, 光
面向上, 压 1~2张 X线片, 而后再压上增感屏后屏,
光面向 X线片, 盖上暗盒, 置于 70℃, 曝光适当的时
间 。
(3) 根据放射线的强度曝光一定的时间后, 在暗室里
取出 X线片, 显影定影 。 如曝光不足, 可再压片重新
曝光 。
㈠ 生物素标记
生物素能以共价结合方式连接到 UTP或 dUTP的嘧啶
环 C5位置上, 形成生物素化的核苷酸 (图 7-4)。
1,掺入标记法：生物素标记的 dNTP可代替相应的
单核苷酸, 在 DNA聚合酶的作用下, 通过随机引物
法或缺口平移法, 将生物素化核苷酸掺入到 DNA分
子中, 获得生物素标记的 DNA探针 。
2,光敏生物素标记法：先通过连接臂将一个光敏基
团连接于生物素, 成为光敏生物素 (photobiotin)，
如图 7-5。
㈡ 半抗原地高辛配基标记方法
将 Dig与 dUTP(或 dCTP,dCTP)相连生成 Dig-dUTP
复合物, 再通过切口平移法和随机引物法将其掺入
到 DNA上 (图 7-6)。
㈢ 非放射性核酸探针的检测
非放射性同位素标记的探针, 除酶直接标记探针外,
其它非放射性标记物并不能被直接检测, 需先将非放
射性标记物与检测系统偶联, 再显色 。
⒈ 偶联反应：大多数非放射性标记物是半抗原 (如地高
辛 ),因此可以通过抗原抗体反应系统与显色体系偶联：
Dig-DNA探针 +抗 Dig抗体 -碱性磷酸酶 (或辣根过氧化
物酶 )+底物 (BCIP和 NBT)；生物素可与抗生物素蛋白
(卵白素, avidin)或链亲合素 (streptavidin)结合, 再与
显色体系相偶联 。
⒉ 显色反应：通过连接在抗体或抗生物素蛋白上的显色物质
(如酶, 荧光素等 )进行杂交信号的检测 。 碱性磷酸酶可使其底
物 BCIP脱磷并聚合, 在此过程中释放出的氢可使 NBT (四氮唑
蓝 )还原而形成紫色的化合物 (图 7-7)。
第三节 核酸分子杂交技术
在液体中进行杂交反应称为液相杂交；在固相支持
物上进行杂交则称为固相杂交 。
固相杂交包括膜上印迹杂交和细胞原位杂交两类 。
固相杂交是印迹技术及杂交信号检测技术等相结合,
从而获得清晰的杂交图谱, 有利于定性或定量分析待
测核酸样品中的特定片段 (靶序列 ),在核酸的结构和
功能研究以及基因工程研究中, 其应用比液相杂交更
为广泛, 其技术发展也更为迅速 。
一, 膜上印迹杂交
膜上印迹杂交是指将待测核酸序列结合到一定的
支持物上，然后与存在于液相中的核酸探针进行杂交
的过程，是目前最常用的一种核酸分子杂交方法。
㈠ 滤膜杂交的基本过程 如图 7-8所示 。
(1) 核酸的制备
(2) 电泳
(3) 印迹
(4) 预杂交
(5) 杂交
(6) 洗膜
(7) 检测
㈡ 固相支持物的选择
一种良好的固相支持物应具备以下几个特点,
(1) 具有较强的结合核酸分子的能力, 一
(2) 与核酸分子结合后应不影响其与探针分子的
杂交反应 。
(3) 与核酸分子的结合稳定牢固,
(4) 非特异性吸附少 。
(5) 具有良好的机械性能 。
下面介绍几种常用的固相支持物,
(1) 硝酸纤维素膜：特别适用于蛋白质 (如抗体和酶等 )
的非放射性标记探针的杂交体系 。
(2) 尼龙膜 (nylon membrane)：尼龙膜结合单链及双链
DNA和 RNA的能力较硝酸纤维素膜更强, 耐碱处理适
合于一步法的菌落原位印迹法 。
尼龙膜的缺点是不宜使用非同位素探针, 即使用各种
蛋白 (如 BSA,牛奶等 )进行预杂交, 产生的杂交信号
本底较高, 与非特异吸附有关 。
PVDF膜：比尼龙膜结合力更强，且在预杂交中很容
易被封闭，使用同位素和非同位素探针都可产生较浅
的本底，而且结实耐用，可以多次杂交。
㈢ 印迹方法
⒈ 虹吸印迹法 (图 7-9)
利用毛细管的虹吸作用由转移缓冲液带动核酸分
子转移至滤膜上 。
⒉ 真空转移法 (图 7-10)
其原理是利用真空泵将转移缓冲液从上层容器中
通过凝胶抽到下层真空室中，同时带动核酸分子转
移到凝胶下面的滤膜上。该法的最大优点是快速，
转膜的同时进行 DNA的变性和中和，整个过程只需
1h左右。
⒊ 电转法如图 7-11所示。
㈣ 印迹类型
Southern印迹杂交法 (Southern blot hybridization)(图
7-12)。
2,Northern印迹杂交 (Northern blot hybridization),
Northern杂交是将 RNA样品变性和通过琼脂糖
凝胶电泳进行分离，再转移到硝酸纤维素膜等固相
载体上，用标记的 DNA或 RNA特异探针对固定在膜
上的 RNA进行杂交。其基本原理与 Southern杂交相
同，只不过变性方法不能采用碱变性法，因为碱导
致 RNA水解，一般采用聚乙二醛和二甲基亚砜、甲
醛、甲基氢氧化汞等变性方法。
3.斑点杂交 (dot hybridization)：直接将变性 DNA样
品点于硝酸纤维素膜上，固定好后先预杂交，再与
标记探针杂交，然后通过高严谨性冲洗 (低盐高温 )，
降低本底和提高特异性。预杂交和杂交可在密封袋
中进行，密封袋比较方便，反应体积小，可以使用
高浓度探针，封口前去除气泡，使杂交液与膜充分
接触，反应体积以膜不贴壁、能浮动为宜。探针与
同源样品杂交后，阳性结果产生斑点，故称斑点杂
交。
4.反向斑点杂交 (reverse dot hybridization)：直接将不
同的探针点印并固定在膜上, 再将待测的 DNA样品与
之杂交, 这样一次杂交反应就可以判断待测 DNA是否
含有这些探针的同源序列 。
5.菌落或噬菌斑杂交 (图 7-13)。
二, 核酸原位杂交
用标记的已知核酸序列为探针, 使其与细胞或组
织切片中核酸进行杂交检测的方法称为核酸原位杂
交 (nucleic acid hybridization in situ)
一般的原位杂交有两种类型：与胞内 DNA的杂交和
与 RNA的杂交 。
三, 液相杂交技术
液相杂交是指待测的核酸和标记的探针同时溶于
杂交液中进行反应, 然后分离杂交双链和未参加反
应的标记探针, 再进行检测 。
㈠ 核酸酶 Sl保护分析法 (nuclease Sl protection assay)
用标记的基因组 DNA作为探针, 在适宜条件下与
待测 RNA进行液相杂交, DNA外显子区可与 mRNA
形成 DNA:RNA杂交体, 而 DNA的其余部分 (内含子等 )
仍为单链, 核酸酶 S1可专一地降解未形成杂交体的
DNA单链, 而与 RNA杂交的 DNA区则受到保护不被
降解 。 通过聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分析消化产
物, 即可确定不被降解的 DNA片段大小, 用目的基因
不同区段的 DNA进行杂交, 可确定 mRNA的 3′,5′端
以及内含子的精确定位等, 通过杂交条带的光密度扫
描还可进行定量分析 (图 7-14,15)。
㈡ RNA酶保护分析法 (RNase protection assay)
其原理是体外转录合成一个高比放射活性的单链
RNA探针，此探针与待测 RNA互补，二者杂交后，
用 RNase A和 RNase T1消化，未形成双链的 RNA单
链被水解成单核苷酸，杂交形成的双链 RNA受到保
护，不被核酸酶水解，通过电泳进行 RNA:RNA杂交
体的检测。
四, 引物延伸分析法 (图 7-17)
引物延伸法可用于 RNA 5′端的定位及 mRNA的定
量, 还可检测 mRNA的前体和中间加工体 。 其原理
是待测 RNA与过量的 5′末端标记的单链 DNA引物 (合
成的寡核苷酸或限制性内切酶片段 )杂交, 随后用反
转录酶延伸此引物, 合成与 RNA互补的 cDNA,通过
变性聚丙烯酰胺凝胶电泳测定 cDNA长度, 该长度就
是引物末端与 RNA 5′端的距离, cDNA的量与 mRNA
样品中靶序列浓度成正比 。
