Cloning Vectors
二、基因工程的基本程序
载体质粒
外源 DNA片段 外源 DNA插入
剪切
引入宿
主细胞
选出含有重
组 DNA的细
胞扩增 表达
a b b
A A b
第六章 分子克隆常用的 载体
?第一节 质粒载体
?第二节 噬菌体载体
?第三节 真核细胞的克隆载体
第一节 质粒载体
? 一、质粒的基本特性
? 二、质粒的分离纯化方法
? 三、质粒载体的选择
? 四、大肠杆菌质粒载体
? 五、多种功能的衍生质粒的组建
一、质粒的基本特性
? 1,质粒及其命名
? 2,质粒的种类
? 3,质粒的复制类型
? 4,质粒的分子生物学特征
二、质粒的分离纯化方法
? 1,氯化铯溴乙锭浮密度超速离心密度梯
度分离法 （ 图 3-3）
? 2,Triton和 PEG化学提取法
? 3,煮沸裂解菌体, 异丙醇沉淀质粒 DNA
? 4,碱变性法抽提质粒 DNA
? 质粒的存在形式,呈共价闭合环状
①超螺旋的 SC构型 （ cccDNA）
②松弛开环的 OC型 （ ocDNA）
③松弛线性的 L构型（ cDNA）
基本步骤,
细菌生长和质粒的扩增
菌体收获和溶菌
质粒纯化
氯化铯浮密度分离法
当各种 DNA分子在有饱和溴乙锭染料存在
下进行氯化铯密度梯度离心时, 与共价闭环状
分子结合的染料要大大少于与开环状或线状
DNA的结合, 因此, 在氯化铯梯度离心中质粒
DNA与染料相结合后生成的条带是在较高的密
度范围内, 而断裂为线状的染色体 DNA与溴乙
锭结合较多, 生成的条带是低密度范围 。 所以,
离心后形成 2条带, 上面的条带主要是染色体
DNA及少量开环状质粒 DNA,下面的带则是共
价闭合环状质粒 DNA。
碱变性法抽提质粒 DNA
该法也是一种快速抽提质料 DNA的方法。
其分离原理，大肠杆菌的染色体约有 4700KB
长，在处理细胞过程中都断裂成不同长度的双
链 DNA片段。当溶液的 PH调到大于 12时双链
DNA中的氢键被破坏，于是染色体 DNA的双链
便分离成单链，而超螺旋状态的质粒 DNA仅仅
是氢链被破坏，并只发生部分双链解离成单链
的变化。再当 PH调回中性时单链 DNA互相缠
绕且与蛋白质结合生成网络状大分子，而超螺
旋的质粒发生复性反应后仍是小分子，通过离
心的方法很容易将二者分开，达到分离的目的。
三、质粒载体的选择
作为理想的质粒载体, 应具备以下几
个条件 （ 1） 能自主复制, 即本身是复制
子 （ 2） 具有一种或多种限制酶的单一切
割位点, 并在此位点中插入外源基因片
段, 不影响本身的复制功能； （ 3） 在基
因组中有 1-2个筛选标记, 为寄主细胞提
供易于检测的表型特征, （ 4） 分子量要
小, 多拷贝, 易于操作 。
四、大肠杆菌质粒载体
? 1,pSC101质粒载体
? 2,pBR322质粒载体
– 分别由 pMB1 (ori),pSF2124(Ampr ) 和
pSC101(Tetr) 三种质粒通过载体改造后形成，
使之具有松弛型 ori和 Ampr及 Tetr两种抗性
基因的理想的基因克隆载体。
Ampr （ Scal,PvuI,PstI切点 ）
Tetr （ EcoRI,Nhel,BamHI,SphI、
HindIII切点 ）
五、多种功能的衍生质粒的组建
? （ 一 ）, 带有不同种类抗性基因的质粒
载体
? （ 二 ）, 高拷贝数质粒 pAT153
? （ 三 ）, 正选择质粒
? （ 四 ）, 多功能质粒 -PUC质粒
带有不同种类抗性基因的质粒
载体
? pBR328是从 pBR322改建成的质粒，大小
为 4.907kb,它具有 Ampr,Tetr和 Cmlr基因。
Cmlr基因有 EcoRI,PvuⅡ 和 BalI的单一酶
切位点。除了 pBR328外,pBR325也有类
似结构。
? pAT153是由 pBR322
质粒改造而成，这种
质粒的拷贝数比
pBR322高 1.5～ 3倍。
它的大小是 3.6kb,选
择标记有氨苄青霉素
抗性基因 Ampr和四环
素抗性基因 Tetr、单
一切点的限制性内切
核酸酶有 PvuⅠ,
PstⅠ, BamHⅠ,
ScaⅠ, SalⅠ,
EcoRⅠ, HindⅢ 。
正选择质粒
? pTR262是正选择质粒。在这种质粒中，在四环
素的抗性基因（ Tetr）前有 λ噬菌体的 PR启动子，
同时在这种载体中还带有 λ噬菌体编码 CI蛋白
质（阻遏物）的基因。没有外源基因插入时，
由于 CI蛋白质阻遏从 PR进行的转录作用，因此
对四环素不表现抗性。在 CI蛋白质基因上有单
一的 HindⅢ 和 BclⅠ 切点，若利用其中任何一
个切点插入外源 DNA片段，都可以使 CI蛋白质
基因功能丧失，结果 PR激活 Tetr基因表达；表
现出对四环素的抗性，达到正选择的效果。
第二节 噬菌体 载体
? 一,噬菌体 的一般 生物学特性
? 二,λ噬菌体载体
? 三、粘性质粒
? 四、单链 DNA噬菌体载体
? 烈性 噬菌体
? 温和噬菌体
? 溶源化细菌
? 溶源化
? 原噬菌体
二,λ噬菌体载体
? （一） λ DNA分子
? (1) λ噬菌体基因结构：如 图 3-11,3-12
? Cos位点 （ Cohesive-end site）,λDNA为
线状双链分子，两端各有 12个碱基的单
链互补粘性末端，通过粘性末端的互补
作用形成双链环形 DNA。这种由粘末端
结合形成的双链区段即 Cos位点。
? (2) λ噬菌体 DNA的 复制
? （二） λ噬菌体的类型
? 插入型载体
? 替换型载体
? ( 三 ) λ噬菌体载体的应用
? 1.转染作用
? 转染,由宿主细胞捕获噬菌体或病毒 DNA的过程。
? 转导,以噬菌体为媒介转移遗传物质的过程。
? 转化,质粒等外源 DNA引入细胞的过程。
? 2,λ DNA的体外包装
? （四） 常用 λ噬菌体
? 凯伦噬菌体载体
? 这类载体有插入型的，如 Charon2；也有
替换型的，如 Charon30。在基因操作中
用途很广。
? Charon载体上具有适当数量的限制酶切
位点, 带有来自大肠杆菌的 β-半乳糖苷
酶基因 lacZ（ 中央区段 ） 。 插入基因经包
装后, 可通过蓝 /白斑筛选阳性克隆 。
? Charon载体的特点是容量大，对研究大
范围内的染色体结构很有用处。
三、粘性质粒
粘性质粒 （ Cosmid） 带有 λ噬菌体的
Cos位点和整个 pBR322的 DNA顺序 。 经感
染进入细菌细胞以后, 它就好象质粒那样
在细胞中进行复制 。 易环化和扩增 。 分子
量小, 可包装 30-45kb 外源基因, 可由
Ampr抗性筛选, 常用于构建基因文库 。
在酵母细胞中常用的载体的共
同特点
? 这些载体，它们共同的特点是：（ 1）能在大
肠杆菌中克隆，并且具有较高的拷贝数。这样
可使外源基因转化到酵母细胞之前先在大肠杆
菌中扩增；（ 2）含有在酵母中便于选择的遗
传标记。这些标记一般能和大肠杆菌相应的突
变体互补，如 Leu2+,His+,Ura3+,Trpl+等。
有些还携带用于大肠杆菌的抗菌素抗性标记；
（ 3）含有合适的限制酶切位点，以便外源基
因的插入。共有三种类型的载体,如图 3-19 。
第三节 真核细胞的克隆载体
? 一、在酵母细胞中克隆基因常用的载体
（ 共同特点 ）
1.整合型载体（ YIP）
2.复制型载体（ YRP）
3.附加体型载体（ YEP）
? 二、植物基因克隆的载体 ——Ti质粒
? 三、动物细胞基因克隆的载体
整合型载体（ YIP）
? YIP型载体是由大肠杆菌质粒和酵母的
DNA片段构成的。如 Pyeleu10是由 ColEI
质粒和酵母 DNA提供的亮氨酸基因
（ Leu2+）片段构成，在细菌中复制、扩
增，进入酵母后可整合表达。 YIP型载体
的特点是转化率低 (只有 1-10转化子 /微克
DNA)，但转化子遗传性稳定稳定，多用
于遗传分析工作。
复制型载体（ YRP）
? YRP型载体是带有选择标记和复制子的酵母的
DNA片段插入到大肠杆菌质粒中构成的。因为
它同时含有大肠杆菌和酵母的自主复制基因，
所以能在两种细胞中存在和复制。可以在两种
截然不同的生物细胞中复制的载体称为穿梭载
体（ Shuttle Vector）,（如图 3-20） 穿梭载体
在基因工程中广泛使用。 YRP型载体转化率高，
拷贝也高，但不稳定，易丢失。
附加体型载体（ YEP）
? YEP型载体一般由大肠杆菌质粒,2μm质粒以
及酵母染色体的选择标记构成。 2μm质粒含有
自主复制起始区（ Ori）和 STB区,STB序列能够
使质粒在供体细胞中维持稳定。利用 2μm质粒，
人们已经构建出许多 YEP型载体。 YEP型载体
PYF92（如图 3-21） 就是由酵母的 2μm质粒、
pBR322质粒和酵母的 His3+(组氨酸 )基因构成
的。 YEP型载体对酵母具有很高的转化活性，
一般为 103-105转化子 /微克 DNA。比 YRP型载
体更稳定，拷贝数也高（ 25-100个 /细胞），是
基因克隆中的常用载体。
载 体
载体 （ Vector）：能携带外源基因导入受
体细胞，这种运载工具称载体。
1.克隆载体, 具组装、复制、扩增功能。如：
pBR322,pUC18/19等。
2.表达载体, 不仅具组装、复制、扩增功能，
还有转录表达功能。如,pBV220,pKK223-3
3.载体的种类：质粒、噬菌体衍生物（ COS、
M13）、动物病毒。
共同特征,
① 自主复制
② 易于扩增分离纯化
③ 有非必需区
④ 有单一酶切位点 （ 多 克隆 位点 ）
单一酶切位点：一种酶在一个载体上只有一个酶切位点
多 克隆 位点：一个载体上的某一个区域含有多个单一酶
切位点
⑤ 有选择标记基因
⑥ 表达载体还应有表达调控元件 （ 启动子, 增强子, 终
止子,SD序列 ）
质粒
? 本质是细菌染色体以外的遗传物质，是
一种简单的，环状 DNA分子，能自主复
制。
? 命名：前一个小写 p代表质粒，后两个大
写英文字母代表发现者或实验室，数字
代表编号，如 pBR322质粒。
?种类,
? F质粒：使宿主染色体上的基因通过性菌
毛随其一起转移到原先不存在该质粒的
受体细胞中。
? R质粒：抗性因子，携有一种或多种抗生
素抗性基因转移到原先不存在该质粒的
受体细胞中。
? Col质粒：有编码大肠杆菌素基因
质粒的类型和特性
? 传递类型,
? ①接合型：含有自主转移基因，使质粒从一个细胞转
移到另一个细胞。如,F质粒、部分 R,Col质粒
? ②非接合型：不含有自主转移基因，质粒不能自主从
一个细胞转移到另一个细胞。如：部分 R,Col质粒
（安全常用）
? 复制类型,①严紧型：低拷贝 1-3个拷贝 /菌
? ②松弛型：高拷贝 10-60个拷贝 /菌
? 特性：自主复制、转移、选择标记遗传特性、不相容
性（同者相斥、异着共存）、分配功能（亲代 子代）
?特性, CopA和 CopB基因
? 1.复制,负调控
? RI质粒,repA基因表达 复制
? PSC101,正调控 是由 ori复制子向左单向复制
? 2.不相容性；在同一细胞中，同类质粒不能并
存的现象。 PUC18 PUC19
? 分配功能：质粒复制后，随细胞分裂的进行，
质粒分配到子细胞中。
Triton和 PEG化学提取法
? Triton和 PEG处理法，此法简单，不用昂贵的
氯化铯，不必长时间的超速离心，费用较低，
分离效果也很好，此法大体过程如下,
? 培养菌体并加入氯霉素使质粒扩增 → 离心沉淀
菌体。在 TE缓冲液中悬浮 → 加入溶菌酶和去污
剂 Triton部分裂解菌体 → 35000r/min离心除去菌
体，留上清液 → 上清液用酚处理除去蛋白质 →
用乙醇初步沉淀 DNA→ 将 DNA悬浮于 TE缓冲
液中 → 加聚乙二醇（ PEG6000），在 4℃ 下过
夜 → 10000r/min离心 15分钟 → DNA沉淀悬浮后
再用乙醇沉淀 → 将 DNA沉淀悬浮即得到提纯的
质粒 DNA。
煮沸裂解菌体，异丙醇沉淀质
粒 DNA
? 该法简便迅速，是实验室中制备小量质粒 DNA
时常用的一种方法。将菌液移入 1.5ml塑料管，
离心去上清，先用 Triton和新鲜配制的溶菌酶
处理细胞,100℃ 加热 60秒种裂解细菌细胞。
将裂解液放置冰浴 2分钟，离心 5分钟，根据不
同的复性特性，从而去除染色体 DNA及细胞碎
片。然后用酚氯仿抽提上清去除蛋白质，再加
入异丙醇，置于室温 20-30分钟，离心取沉淀，
70%乙醇洗两次，最后悬浮于 TE，即为提纯的
质粒 DNA。根据实验要求，亦可省去酚：氯仿
抽提步骤，使实验在 2小时内完成。
多功能质粒 -PUC质粒
? 多功能质粒 -PUC质粒是由 pBR322改建成
的带有 LacZ基因的 PUC质粒。 LacZ 上有
多克隆位点，插入外源基因后在 X-gal平
板上使原先的蓝斑变成白斑。
插入型载体
? 在 λimm434区有 EcoRI单一酶切位点便于外源
DNA插入的称为插入型载体。 λ gt10（ CI)
λgt11(LacZ)
? 若 CI插入外源基因 溶菌 透明噬斑
? 若 不插入外源基因 溶源 混浊斑
? 若 LacZ插入基因 IPTG/X-gal平板有白斑
? 若 LacZ无插入基因 IPTG/X-gal平板有蓝斑
替换型载体
在 λ NM781/791/762替换型载体的 SupE基因中可
致使宿主菌 lacZ琥珀突变，在该基因中具有成对
的 EcoRI限制酶位点，在这两个位点之间的 DNA
区段可以被插入的外源 DNA片段所取代，亦称取
代型载体。由于上述 λ噬菌体的感染，寄主细胞
lacZ基因的琥珀突变被抑制,所以能在乳糖麦康基
氏 (McConkey)琼脂培养基上产生红色的噬菌斑,
或是在 X-gal琼脂培养基上产生蓝色的噬菌斑。但
如果 supE基因的 EcoRI区段被外源 DNA所取代，
那么形成的重组体噬菌体只能产生出白色的噬菌
斑。可方便地筛选出阳性克隆。 如图 3-15
单链 DNA噬菌体载体
? M13单链 DNA噬菌
体为细线状 DNA，
呈单链环状 包装在
线状蛋白外壳中。
载体有多聚接头，
可进行 LacZ插入失
活白斑筛选。可应
用于克隆基因，测
序，基因突变的诱
变技术。
三、动物细胞基因克隆的载体
? ㈠ SV40病毒
? ㈡ SV40病毒载体
– (1)取代型重组病毒载体
? ① 晚期区段取代载体
? ② 早期区段取代载体
– (2)重组的病毒 -质粒载体
SV40病毒
? SV40病毒呈小型 20面体, 环状 DNA,外壳蛋白
由 VP1,VP2,VP3构成 。
? 受纳细胞 （ permissive cell）,能使细胞裂解释放
感染性病毒颗粒, 产生 CPE。
? 非受纳细胞 （ non permissive cell）,不产生感染
性病毒颗粒, 但能整合到细胞染色体中产生癌变 。
? 基因结构 。 如图 3-25
– 早期表达区编码大 T抗原和小 t抗原 （ 即肿瘤蛋白质或
抗原 ） 。 T抗原的功能是控制 SV40基因组的复制和调
节 。 小 t抗原的功能不详 。
– 晚期表达区合成 Vp1,Vp2,Vp3,包装释放
(1)取代型重组病毒载体
? 取代型的重组病毒载体（ recombinant
Virus Vector）,其特点是外源 DNA直接插
入在缺陷型的病毒基因组上。插入的外
源 DNA片段在大小同被取代的病毒基因
组区段是等同的，这样形成的重组体
DNA能够在哺乳动物的受纳细胞中增殖，
并被包装成病毒颗粒。但为了补充被取
代的病毒基因组 DNA的功能，必须使用
一种与之互补的辅助病毒。
(2)重组的病毒 -质粒载体
? 由大 T抗原、复制子和 pBR322构成 pAC10
载体。在细菌中扩增提取基因重组质粒，
转染小鼠细胞 5-6天后可高拷贝扩增、进而
高表达基因产物 （如图 3-30） 。另外微型
病毒复制子 -质粒载体，可用特殊细胞来克
隆和表达 （ 如图 3-31 ） 。
① 晚期区段取代载体
? SV40晚期基因被外源 DNA取代后，失去合成
外壳蛋白功能，若加入一种温度敏感（ ts）的
辅助病毒 tsA58（它是一种在 41℃ 下便不能合
成 T抗原的突变体），与缺乏了整个晚期区段
功能的 SV40病毒，可以互补，这两种病毒混合
感染时，仍然能够增殖。重组体病毒能提供此
种 T抗原,tsA58则可以复制，并合成出外壳蛋
白质，这样就能在受纳细胞中扩增表达。
如图 3-26,3-27,3-28
② 早期区段取代载体
? 这种载体被外源
基因取代早期基
因而缺失大 T抗
原，可由 COS细
胞提供大 T抗原，
故可利于重组病
毒在 COS细胞中
增殖和扩增。
? A：成熟包被，切开
cos环,
? D,E,(占头蛋白 75%)
? W,F：头尾连接
? Int(整合 ),Xis(删
除 ),Red促重组
? N(早期调控 )促 O,P(复
制 ).Red,Xis,Int转录和
整合。
? Q(晚期调控 )促头,
尾,S,R基因表达和溶
菌
? CI,CII,CIII为负调控，
阻止溶菌
?包装有限制，
λ φDNA全长
48kb，必需基
因为 28kb,包装
外源基因限制
全长 105-75％
（即 51－ 28＝
23kb;36 － 28
＝ 8kb）包装
限制范围为 12-
23kb。
The end
二、基因工程的基本程序
载体质粒
外源 DNA片段 外源 DNA插入
剪切
引入宿
主细胞
选出含有重
组 DNA的细
胞扩增 表达
a b b
A A b
第六章 分子克隆常用的 载体
?第一节 质粒载体
?第二节 噬菌体载体
?第三节 真核细胞的克隆载体
第一节 质粒载体
? 一、质粒的基本特性
? 二、质粒的分离纯化方法
? 三、质粒载体的选择
? 四、大肠杆菌质粒载体
? 五、多种功能的衍生质粒的组建
一、质粒的基本特性
? 1,质粒及其命名
? 2,质粒的种类
? 3,质粒的复制类型
? 4,质粒的分子生物学特征
二、质粒的分离纯化方法
? 1,氯化铯溴乙锭浮密度超速离心密度梯
度分离法 （ 图 3-3）
? 2,Triton和 PEG化学提取法
? 3,煮沸裂解菌体, 异丙醇沉淀质粒 DNA
? 4,碱变性法抽提质粒 DNA
? 质粒的存在形式,呈共价闭合环状
①超螺旋的 SC构型 （ cccDNA）
②松弛开环的 OC型 （ ocDNA）
③松弛线性的 L构型（ cDNA）
基本步骤,
细菌生长和质粒的扩增
菌体收获和溶菌
质粒纯化
氯化铯浮密度分离法
当各种 DNA分子在有饱和溴乙锭染料存在
下进行氯化铯密度梯度离心时, 与共价闭环状
分子结合的染料要大大少于与开环状或线状
DNA的结合, 因此, 在氯化铯梯度离心中质粒
DNA与染料相结合后生成的条带是在较高的密
度范围内, 而断裂为线状的染色体 DNA与溴乙
锭结合较多, 生成的条带是低密度范围 。 所以,
离心后形成 2条带, 上面的条带主要是染色体
DNA及少量开环状质粒 DNA,下面的带则是共
价闭合环状质粒 DNA。
碱变性法抽提质粒 DNA
该法也是一种快速抽提质料 DNA的方法。
其分离原理，大肠杆菌的染色体约有 4700KB
长，在处理细胞过程中都断裂成不同长度的双
链 DNA片段。当溶液的 PH调到大于 12时双链
DNA中的氢键被破坏，于是染色体 DNA的双链
便分离成单链，而超螺旋状态的质粒 DNA仅仅
是氢链被破坏，并只发生部分双链解离成单链
的变化。再当 PH调回中性时单链 DNA互相缠
绕且与蛋白质结合生成网络状大分子，而超螺
旋的质粒发生复性反应后仍是小分子，通过离
心的方法很容易将二者分开，达到分离的目的。
三、质粒载体的选择
作为理想的质粒载体, 应具备以下几
个条件 （ 1） 能自主复制, 即本身是复制
子 （ 2） 具有一种或多种限制酶的单一切
割位点, 并在此位点中插入外源基因片
段, 不影响本身的复制功能； （ 3） 在基
因组中有 1-2个筛选标记, 为寄主细胞提
供易于检测的表型特征, （ 4） 分子量要
小, 多拷贝, 易于操作 。
四、大肠杆菌质粒载体
? 1,pSC101质粒载体
? 2,pBR322质粒载体
– 分别由 pMB1 (ori),pSF2124(Ampr ) 和
pSC101(Tetr) 三种质粒通过载体改造后形成，
使之具有松弛型 ori和 Ampr及 Tetr两种抗性
基因的理想的基因克隆载体。
Ampr （ Scal,PvuI,PstI切点 ）
Tetr （ EcoRI,Nhel,BamHI,SphI、
HindIII切点 ）
五、多种功能的衍生质粒的组建
? （ 一 ）, 带有不同种类抗性基因的质粒
载体
? （ 二 ）, 高拷贝数质粒 pAT153
? （ 三 ）, 正选择质粒
? （ 四 ）, 多功能质粒 -PUC质粒
带有不同种类抗性基因的质粒
载体
? pBR328是从 pBR322改建成的质粒，大小
为 4.907kb,它具有 Ampr,Tetr和 Cmlr基因。
Cmlr基因有 EcoRI,PvuⅡ 和 BalI的单一酶
切位点。除了 pBR328外,pBR325也有类
似结构。
? pAT153是由 pBR322
质粒改造而成，这种
质粒的拷贝数比
pBR322高 1.5～ 3倍。
它的大小是 3.6kb,选
择标记有氨苄青霉素
抗性基因 Ampr和四环
素抗性基因 Tetr、单
一切点的限制性内切
核酸酶有 PvuⅠ,
PstⅠ, BamHⅠ,
ScaⅠ, SalⅠ,
EcoRⅠ, HindⅢ 。
正选择质粒
? pTR262是正选择质粒。在这种质粒中，在四环
素的抗性基因（ Tetr）前有 λ噬菌体的 PR启动子，
同时在这种载体中还带有 λ噬菌体编码 CI蛋白
质（阻遏物）的基因。没有外源基因插入时，
由于 CI蛋白质阻遏从 PR进行的转录作用，因此
对四环素不表现抗性。在 CI蛋白质基因上有单
一的 HindⅢ 和 BclⅠ 切点，若利用其中任何一
个切点插入外源 DNA片段，都可以使 CI蛋白质
基因功能丧失，结果 PR激活 Tetr基因表达；表
现出对四环素的抗性，达到正选择的效果。
第二节 噬菌体 载体
? 一,噬菌体 的一般 生物学特性
? 二,λ噬菌体载体
? 三、粘性质粒
? 四、单链 DNA噬菌体载体
? 烈性 噬菌体
? 温和噬菌体
? 溶源化细菌
? 溶源化
? 原噬菌体
二,λ噬菌体载体
? （一） λ DNA分子
? (1) λ噬菌体基因结构：如 图 3-11,3-12
? Cos位点 （ Cohesive-end site）,λDNA为
线状双链分子，两端各有 12个碱基的单
链互补粘性末端，通过粘性末端的互补
作用形成双链环形 DNA。这种由粘末端
结合形成的双链区段即 Cos位点。
? (2) λ噬菌体 DNA的 复制
? （二） λ噬菌体的类型
? 插入型载体
? 替换型载体
? ( 三 ) λ噬菌体载体的应用
? 1.转染作用
? 转染,由宿主细胞捕获噬菌体或病毒 DNA的过程。
? 转导,以噬菌体为媒介转移遗传物质的过程。
? 转化,质粒等外源 DNA引入细胞的过程。
? 2,λ DNA的体外包装
? （四） 常用 λ噬菌体
? 凯伦噬菌体载体
? 这类载体有插入型的，如 Charon2；也有
替换型的，如 Charon30。在基因操作中
用途很广。
? Charon载体上具有适当数量的限制酶切
位点, 带有来自大肠杆菌的 β-半乳糖苷
酶基因 lacZ（ 中央区段 ） 。 插入基因经包
装后, 可通过蓝 /白斑筛选阳性克隆 。
? Charon载体的特点是容量大，对研究大
范围内的染色体结构很有用处。
三、粘性质粒
粘性质粒 （ Cosmid） 带有 λ噬菌体的
Cos位点和整个 pBR322的 DNA顺序 。 经感
染进入细菌细胞以后, 它就好象质粒那样
在细胞中进行复制 。 易环化和扩增 。 分子
量小, 可包装 30-45kb 外源基因, 可由
Ampr抗性筛选, 常用于构建基因文库 。
在酵母细胞中常用的载体的共
同特点
? 这些载体，它们共同的特点是：（ 1）能在大
肠杆菌中克隆，并且具有较高的拷贝数。这样
可使外源基因转化到酵母细胞之前先在大肠杆
菌中扩增；（ 2）含有在酵母中便于选择的遗
传标记。这些标记一般能和大肠杆菌相应的突
变体互补，如 Leu2+,His+,Ura3+,Trpl+等。
有些还携带用于大肠杆菌的抗菌素抗性标记；
（ 3）含有合适的限制酶切位点，以便外源基
因的插入。共有三种类型的载体,如图 3-19 。
第三节 真核细胞的克隆载体
? 一、在酵母细胞中克隆基因常用的载体
（ 共同特点 ）
1.整合型载体（ YIP）
2.复制型载体（ YRP）
3.附加体型载体（ YEP）
? 二、植物基因克隆的载体 ——Ti质粒
? 三、动物细胞基因克隆的载体
整合型载体（ YIP）
? YIP型载体是由大肠杆菌质粒和酵母的
DNA片段构成的。如 Pyeleu10是由 ColEI
质粒和酵母 DNA提供的亮氨酸基因
（ Leu2+）片段构成，在细菌中复制、扩
增，进入酵母后可整合表达。 YIP型载体
的特点是转化率低 (只有 1-10转化子 /微克
DNA)，但转化子遗传性稳定稳定，多用
于遗传分析工作。
复制型载体（ YRP）
? YRP型载体是带有选择标记和复制子的酵母的
DNA片段插入到大肠杆菌质粒中构成的。因为
它同时含有大肠杆菌和酵母的自主复制基因，
所以能在两种细胞中存在和复制。可以在两种
截然不同的生物细胞中复制的载体称为穿梭载
体（ Shuttle Vector）,（如图 3-20） 穿梭载体
在基因工程中广泛使用。 YRP型载体转化率高，
拷贝也高，但不稳定，易丢失。
附加体型载体（ YEP）
? YEP型载体一般由大肠杆菌质粒,2μm质粒以
及酵母染色体的选择标记构成。 2μm质粒含有
自主复制起始区（ Ori）和 STB区,STB序列能够
使质粒在供体细胞中维持稳定。利用 2μm质粒，
人们已经构建出许多 YEP型载体。 YEP型载体
PYF92（如图 3-21） 就是由酵母的 2μm质粒、
pBR322质粒和酵母的 His3+(组氨酸 )基因构成
的。 YEP型载体对酵母具有很高的转化活性，
一般为 103-105转化子 /微克 DNA。比 YRP型载
体更稳定，拷贝数也高（ 25-100个 /细胞），是
基因克隆中的常用载体。
载 体
载体 （ Vector）：能携带外源基因导入受
体细胞，这种运载工具称载体。
1.克隆载体, 具组装、复制、扩增功能。如：
pBR322,pUC18/19等。
2.表达载体, 不仅具组装、复制、扩增功能，
还有转录表达功能。如,pBV220,pKK223-3
3.载体的种类：质粒、噬菌体衍生物（ COS、
M13）、动物病毒。
共同特征,
① 自主复制
② 易于扩增分离纯化
③ 有非必需区
④ 有单一酶切位点 （ 多 克隆 位点 ）
单一酶切位点：一种酶在一个载体上只有一个酶切位点
多 克隆 位点：一个载体上的某一个区域含有多个单一酶
切位点
⑤ 有选择标记基因
⑥ 表达载体还应有表达调控元件 （ 启动子, 增强子, 终
止子,SD序列 ）
质粒
? 本质是细菌染色体以外的遗传物质，是
一种简单的，环状 DNA分子，能自主复
制。
? 命名：前一个小写 p代表质粒，后两个大
写英文字母代表发现者或实验室，数字
代表编号，如 pBR322质粒。
?种类,
? F质粒：使宿主染色体上的基因通过性菌
毛随其一起转移到原先不存在该质粒的
受体细胞中。
? R质粒：抗性因子，携有一种或多种抗生
素抗性基因转移到原先不存在该质粒的
受体细胞中。
? Col质粒：有编码大肠杆菌素基因
质粒的类型和特性
? 传递类型,
? ①接合型：含有自主转移基因，使质粒从一个细胞转
移到另一个细胞。如,F质粒、部分 R,Col质粒
? ②非接合型：不含有自主转移基因，质粒不能自主从
一个细胞转移到另一个细胞。如：部分 R,Col质粒
（安全常用）
? 复制类型,①严紧型：低拷贝 1-3个拷贝 /菌
? ②松弛型：高拷贝 10-60个拷贝 /菌
? 特性：自主复制、转移、选择标记遗传特性、不相容
性（同者相斥、异着共存）、分配功能（亲代 子代）
?特性, CopA和 CopB基因
? 1.复制,负调控
? RI质粒,repA基因表达 复制
? PSC101,正调控 是由 ori复制子向左单向复制
? 2.不相容性；在同一细胞中，同类质粒不能并
存的现象。 PUC18 PUC19
? 分配功能：质粒复制后，随细胞分裂的进行，
质粒分配到子细胞中。
Triton和 PEG化学提取法
? Triton和 PEG处理法，此法简单，不用昂贵的
氯化铯，不必长时间的超速离心，费用较低，
分离效果也很好，此法大体过程如下,
? 培养菌体并加入氯霉素使质粒扩增 → 离心沉淀
菌体。在 TE缓冲液中悬浮 → 加入溶菌酶和去污
剂 Triton部分裂解菌体 → 35000r/min离心除去菌
体，留上清液 → 上清液用酚处理除去蛋白质 →
用乙醇初步沉淀 DNA→ 将 DNA悬浮于 TE缓冲
液中 → 加聚乙二醇（ PEG6000），在 4℃ 下过
夜 → 10000r/min离心 15分钟 → DNA沉淀悬浮后
再用乙醇沉淀 → 将 DNA沉淀悬浮即得到提纯的
质粒 DNA。
煮沸裂解菌体，异丙醇沉淀质
粒 DNA
? 该法简便迅速，是实验室中制备小量质粒 DNA
时常用的一种方法。将菌液移入 1.5ml塑料管，
离心去上清，先用 Triton和新鲜配制的溶菌酶
处理细胞,100℃ 加热 60秒种裂解细菌细胞。
将裂解液放置冰浴 2分钟，离心 5分钟，根据不
同的复性特性，从而去除染色体 DNA及细胞碎
片。然后用酚氯仿抽提上清去除蛋白质，再加
入异丙醇，置于室温 20-30分钟，离心取沉淀，
70%乙醇洗两次，最后悬浮于 TE，即为提纯的
质粒 DNA。根据实验要求，亦可省去酚：氯仿
抽提步骤，使实验在 2小时内完成。
多功能质粒 -PUC质粒
? 多功能质粒 -PUC质粒是由 pBR322改建成
的带有 LacZ基因的 PUC质粒。 LacZ 上有
多克隆位点，插入外源基因后在 X-gal平
板上使原先的蓝斑变成白斑。
插入型载体
? 在 λimm434区有 EcoRI单一酶切位点便于外源
DNA插入的称为插入型载体。 λ gt10（ CI)
λgt11(LacZ)
? 若 CI插入外源基因 溶菌 透明噬斑
? 若 不插入外源基因 溶源 混浊斑
? 若 LacZ插入基因 IPTG/X-gal平板有白斑
? 若 LacZ无插入基因 IPTG/X-gal平板有蓝斑
替换型载体
在 λ NM781/791/762替换型载体的 SupE基因中可
致使宿主菌 lacZ琥珀突变，在该基因中具有成对
的 EcoRI限制酶位点，在这两个位点之间的 DNA
区段可以被插入的外源 DNA片段所取代，亦称取
代型载体。由于上述 λ噬菌体的感染，寄主细胞
lacZ基因的琥珀突变被抑制,所以能在乳糖麦康基
氏 (McConkey)琼脂培养基上产生红色的噬菌斑,
或是在 X-gal琼脂培养基上产生蓝色的噬菌斑。但
如果 supE基因的 EcoRI区段被外源 DNA所取代，
那么形成的重组体噬菌体只能产生出白色的噬菌
斑。可方便地筛选出阳性克隆。 如图 3-15
单链 DNA噬菌体载体
? M13单链 DNA噬菌
体为细线状 DNA，
呈单链环状 包装在
线状蛋白外壳中。
载体有多聚接头，
可进行 LacZ插入失
活白斑筛选。可应
用于克隆基因，测
序，基因突变的诱
变技术。
三、动物细胞基因克隆的载体
? ㈠ SV40病毒
? ㈡ SV40病毒载体
– (1)取代型重组病毒载体
? ① 晚期区段取代载体
? ② 早期区段取代载体
– (2)重组的病毒 -质粒载体
SV40病毒
? SV40病毒呈小型 20面体, 环状 DNA,外壳蛋白
由 VP1,VP2,VP3构成 。
? 受纳细胞 （ permissive cell）,能使细胞裂解释放
感染性病毒颗粒, 产生 CPE。
? 非受纳细胞 （ non permissive cell）,不产生感染
性病毒颗粒, 但能整合到细胞染色体中产生癌变 。
? 基因结构 。 如图 3-25
– 早期表达区编码大 T抗原和小 t抗原 （ 即肿瘤蛋白质或
抗原 ） 。 T抗原的功能是控制 SV40基因组的复制和调
节 。 小 t抗原的功能不详 。
– 晚期表达区合成 Vp1,Vp2,Vp3,包装释放
(1)取代型重组病毒载体
? 取代型的重组病毒载体（ recombinant
Virus Vector）,其特点是外源 DNA直接插
入在缺陷型的病毒基因组上。插入的外
源 DNA片段在大小同被取代的病毒基因
组区段是等同的，这样形成的重组体
DNA能够在哺乳动物的受纳细胞中增殖，
并被包装成病毒颗粒。但为了补充被取
代的病毒基因组 DNA的功能，必须使用
一种与之互补的辅助病毒。
(2)重组的病毒 -质粒载体
? 由大 T抗原、复制子和 pBR322构成 pAC10
载体。在细菌中扩增提取基因重组质粒，
转染小鼠细胞 5-6天后可高拷贝扩增、进而
高表达基因产物 （如图 3-30） 。另外微型
病毒复制子 -质粒载体，可用特殊细胞来克
隆和表达 （ 如图 3-31 ） 。
① 晚期区段取代载体
? SV40晚期基因被外源 DNA取代后，失去合成
外壳蛋白功能，若加入一种温度敏感（ ts）的
辅助病毒 tsA58（它是一种在 41℃ 下便不能合
成 T抗原的突变体），与缺乏了整个晚期区段
功能的 SV40病毒，可以互补，这两种病毒混合
感染时，仍然能够增殖。重组体病毒能提供此
种 T抗原,tsA58则可以复制，并合成出外壳蛋
白质，这样就能在受纳细胞中扩增表达。
如图 3-26,3-27,3-28
② 早期区段取代载体
? 这种载体被外源
基因取代早期基
因而缺失大 T抗
原，可由 COS细
胞提供大 T抗原，
故可利于重组病
毒在 COS细胞中
增殖和扩增。
? A：成熟包被，切开
cos环,
? D,E,(占头蛋白 75%)
? W,F：头尾连接
? Int(整合 ),Xis(删
除 ),Red促重组
? N(早期调控 )促 O,P(复
制 ).Red,Xis,Int转录和
整合。
? Q(晚期调控 )促头,
尾,S,R基因表达和溶
菌
? CI,CII,CIII为负调控，
阻止溶菌
?包装有限制，
λ φDNA全长
48kb，必需基
因为 28kb,包装
外源基因限制
全长 105-75％
（即 51－ 28＝
23kb;36 － 28
＝ 8kb）包装
限制范围为 12-
23kb。
The end
