第九章 目的基因 的分离和克隆
? 第一节 目的基因的获得
? 第二节 获得目的基因方法的选择
? 第三节 目的基因重组体的构建
第一节 目的基因的获得
? 一、化学合成
? 二、聚合酶链反应（ PCR） 方法扩增目
的基因
? 三、建立基因组 DNA文库
? 四,构建 cDNA文库筛选目的基因
? 五,其他方法
一,化学合成法 自动化 DNA合成仪
? 1.要求, 1） 已知目的基因的核苷酸序列或其对
应的多肽链氨基酸序列
? 2）较短的 DNA片段，有专一性和定
向性
? 2.原理,第一个核苷酸固定于不溶性的固相载
体上,然后按预定顺序从该核苷酸开始，以 3’、
5’-磷酸二酯键与另一核苷酸进行缩合反应（封
闭非反应基团 ），其后用洗涤法除去多余的反
应物和副产物,再用同样的步骤与下一个核苷
酸进行缩合反应,如此循环将合成的寡核苷酸
链从载体上洗脱下来,解除保护基,进一步纯化。
? 应用范围,1）合成 PCR引物
? 2）寡核苷酸探针
? 3）人工接头及较小的基因
二、建立基因组 DNA文库
基因组文库,分离真核生物中某种 DNA成分,
通常是分离供体细胞中的染色体 DNA，酶
切后，将这些染色体 DNA片段与某种载体
相接，而后转入大肠杆菌，建立包含有真
核细胞染色体 DNA片断的克隆株,这种克
隆株群体。
1.特点：提供全套遗传信息,即完整的基因组
DNA,可以研究基因组中 5’端控制基因转录
的调控序列,内含子的分布和作用,以及重
复序列的数量分布及大小
2.构建基因组文库全过程（ DNA重组的过程 ）
⑴ 分离纯化基因组 DNA,
提取哺乳动物细胞染色体 DNA
⑵ 制备全部基因组的 DNA片断
①机械断裂 法
用超声波或高速搅拌 DNA溶液
断裂片段两端没有与克隆载体匹配的粘末端,因此插入
载体之前还需要进行修饰加工，少用
②限制性内切酶降解（鸟枪法）
过去用 EcoRⅠ,现在用 Sau3A
断裂片段两端有与克隆载体匹配的粘末端，可以直接与
处理过的载体连接。
? ⑶ DNA片断与载体的连接包装
? 常用载体：粘性质粒 λ噬菌体
? 酵母人工染色体
? ①基因组 DNA +粘性质粒 —— 重组 DNA—
— 转化细菌 菌落
? ②基因组 DNA + λ噬菌体 —— 重组 DNA—
包装成噬菌体 —— 感染细菌 噬菌斑
? 1个克隆含有基因组的某个片段，整个克隆
群体就包含基因组的全部基因片段总和。
基因组文库大小的计算
1975年 L.Clarke等提出了一种计算完整的基因组文库最低重
组体所需实际克隆数（ N ）的公式,
In（ 1－ P）
N = ———————
In （ 1－ f）
P为在基因组文库目的基因出现的几率（一般为 99％）； f为
插入的限制片断长度／整个基因组 DNA总长度。
例如：从人基因组 DNA（总长度为 3× 109bp）的文库中筛选
到长约 1.5kb目的基因的可能性为 99％，那么这个基因组文
库要多大？
In（ 1－ 0.99）
N = ——————————————— = 9.2× 106
In （ 1－ 1.5× 103／ 3× 109）
? 若用质粒（ pBR322）克隆目的基因（ 1.5kb）
需要有 9× 106克隆才能汇集人基因组全部 DNA
序列 ;若 用 λ噬菌体载体可构建含 15kb目的基因
的人基因组 DNA文库，按上式计算所需要的重
组体克隆数可以减少到 9× 105,而要用柯斯质粒
将 40kb目的基因片断所需要重组体克隆数可降
到 3.5× 105左右,均可满足建库要求。
载体种类
装载量
转 染 率
λ噬菌体
粘性质粒 (Cosmid)
酵母人工染色体
(YAC)
9～ 22kb
30～ 45kb
100～ 1000kb
105～ 106转化子／ μgDNA
104～ 106转化子／ μgDNA
～ 500转化子／ μgDNA
表 4-1 三种常用基因组文库克隆载体的比较
四、构建 cDNA文库
cDNA文库：以 mRNA为模板在反转录酶的
作用下将形成的互补 DNA（ cDNA ）建
立基因文库（ gene library）。
特点,
1,cDNA无内含子,长度较基因组基因小,使操
作更为方便。
2,mRNA比基因组中基因少,因此筛选某一特
定功能基因工作量较小。
3,mRNA中拷贝数大于基因组中的拷贝数,利
于获得较多的模板。（转录特征）
4,可在原核细胞中表达有生物活性蛋白
5,不同种类不同状态的细胞的 cDNA文库不同
6,不能研究基因组的结构功能
构建 cDNA文库
1.制备 mRNA
1)取材,mRNA约占总 RNA的 1－ 5％，所以应选
用目的基因 mRNA表达最丰富的组织细胞为材
料来源，如获胰岛素基因，由应以胰岛 β细胞
为原始生物材料，细胞因子基因应选用经抗原
或丝裂原刺激培养的淋巴细胞为材料
2)从总的 RNA中分离 mRNA
将提取的 mRNA在寡聚脱氧胸苷酸 [ oligo(dT) ] 纤
维素中进行 亲和层析
2.第一股 cDNA合成
1）以 Oligo(dT) 为引物：从模板 3’末端开始，
沿模板的 3’→5’ 方向合成,对于较长的 mRNA
分子很难得到全长 cDNA
2）随机引物：以 6～ 8个核苷酸为随机引物，从
mRNA的不同结合点合成全长 cDNA第一链
（ RNA-DNA）
3.第二股 cDNA的合成
⑴ 自身引导法,
⑵ 置换合成法
⑶ 外加引物合成法
4.cDNA与载体连接和
导入宿主细胞
(如图 4-5)
筛选目的基因
⑴ 核酸杂交法 特殊标记的寡核苷酸链为探
针
将扩增好的 cDNA文库（即许多带有 cDNA重
组体大肠杆菌培养皿内所形成的菌落或噬
菌斑）转印到硝酸纤维素膜上，碱解后加
带标记的探针进行杂交，能显示特异结合
探针的点（克隆）便是目的基因所在处。
确定菌落或噬菌斑的位置，扩增，提取，
再用限制性酶切出 cDNA基因片断，即为目
的基因。 （如图）
? ⑵ 免疫结合法
? 噬菌斑转印到硝酸纤维膜上，各种 cDNA
表达并呈现在噬菌体表面的蛋白质便牢
固地结合在膜上。然后将膜放入含有特
异抗体的溶液中进行免疫结合反应，洗
去未结合的抗体后，再与 125 I 标记的第二
抗体结合,从而找出带有放射性示踪信号
的斑点,进而找出对应噬菌斑,克隆扩增,
提取 DNA后经酶切可获目的基因。
获得目的基因的其他方法
㈠ 构建差示文库筛选特殊基因
差示文库（ differential library）又称扣除
文库（ subtracted library）,是反映不同组织细
胞或同一种细胞在不同生理状态下,基因表达差
异的 cDNA文库。
㈡ mRNA差异显示法 获得目的基因
mRNA差异显示（ mRNA differential
display DD） PCR法全称为 DD-PCR法其用途
和应用目的与构建差示文库大体一致。
㈢ 基因改造可获得新型目的基因
采用基因拼接、基因缺失或点突变等方法，使
表达产物量提高或降低毒性，有助于研究基因
间的相互作用（如协同／抑制效应）。
第二节 获得目的基因方法的选择
? 一、根据获得目的基因的研究目的选择方法
? 为了研究基因全长结构、调控,DNA信息分析 构建基因组文库,
? 为了开展目的基因重组表达 制药、治疗 构建 cDNA文库。
? 若目的基因序列明确可设计引物通过 PCR/RT-PCR克隆。
? 若目的基因序列短小可化学合成。
? 二、根据目的基因本身特点选择方法
? 对从基因组中克隆的基因 (内含子 ) 只能真核表达
? 对从 cDNA中克隆的基因 (无内含子 ) 可在原核 /真核表达
? 要选择 mRNA表达丰富的组织材料,PCR克隆的基因必须测序。
? 三、根据实验室设备条件选择方法
? 构建文库无需自行构建，有商品出售。
? 目的基因序列明确，也无需建库，可直接用 PCR/RT-PCR克隆。
第三节 目的基因重组体的构建
? 一、质粒 DNA的分离纯化
? 二、目的基因与载体的连接
二、目的基因与载体的连接
? ㈠ 粘性末端的连接
1,单酶切点的粘性末端 全同源性粘性末端
⑴ 高背景
⑵ 双向插入,不能定向 （ 如前图 2-5,2-6）
2,双酶切片段的定向克隆
① 粘－粘 非同源互补的粘性末端
重组方案中最有效简捷的途径 。
② 粘－平
? ㈡ 平端连接法
1,同聚物加尾法
2,用衔接物连接法
3.适配子连接法 （ 带有相应酶切点的粘性末端 ）
EcoRI粘性末端, 5’－ AGCGGCCGCG － 3’
TCGCCGGCGCTTAA－ 5’
BamHI／ PasI粘性末端,5’－ GATCCGG……,CACTGCA－ 3’
3’－ GCC……,GTG － 5’
BamHI PasI
4,T－ A克隆法
TaqDNA聚合酶在扩增目的基因 DNA的同时,能不依赖
模板而在扩增产物两 3’端加上两个游离的,A”。
目的基因
目的基因：特定功能的基因与相应载体重
组后能在宿主细胞中表达的 DNA。 相对
宿主细胞称外源基因 。
化学合成法
? 用脱氧单核苷酸按特定的已知序列以 3’-5’
磷酸二酯键的形成（采用缩合反应），
逐个进行延伸达所需长度后，去除保护
剂，再分离纯化，即可获得目的基因。
二、聚合酶链反应
1.原理：以 DNA变性复制的某些特性为原理，以目的
DNA片段为模板,利用酶促反应（ Taq酶），在特定
引物的引导下，将加入的 4种 dNTP由引物沿模板从
5’→3’ 按碱基配对原则,形成与模板 DNA互补的半保
留复制链,新合成的链又可作为下一轮循环的模板。
经 25-30个循环产物呈 2n指数扩增，由 pg— μg（紫外
可见），可获得基因片段。 （如图）
目的 DNA片段,染色体 DNA
RT-PCR, cDNA
? 2.应用,
? 1）诊断 ①带有异常外源基因（如病毒）
? ②变异基因（肿瘤、遗传病等）
? 2）合成特异基因或目的基因
? 3）合成特异探针
? 3,特点,
? ⑴反复循环便于获得大量的基因拷贝
? ⑵ Taq酶作用下每一轮 PCR循环会产生 10
－ 3～ 10－ 4的错配率,所以多用于基因检测，
如果用于基因重组表达，在此之前必须
进行 DNA序列分析。
? 原核生物, 基因组小，限制性核酸内
切酶切成若干片段后，用带有标记的核
酸探针进行杂交筛选,
? 人或哺乳类动物细胞,基因组庞大，
采用 DNA重组技术把某种生物细胞的所
有基因分区组装到载体（质粒或噬菌体）
上，并随载体导入宿主细胞中进行克隆
培养和保存这种克隆群体，这种通过重
组、克隆方法保存在宿主细胞（大肠杆
菌）中的各种重组 DNA分子的集合体叫
做 DNA文库,简称文库（ Library）。
? 第一节 目的基因的获得
? 第二节 获得目的基因方法的选择
? 第三节 目的基因重组体的构建
第一节 目的基因的获得
? 一、化学合成
? 二、聚合酶链反应（ PCR） 方法扩增目
的基因
? 三、建立基因组 DNA文库
? 四,构建 cDNA文库筛选目的基因
? 五,其他方法
一,化学合成法 自动化 DNA合成仪
? 1.要求, 1） 已知目的基因的核苷酸序列或其对
应的多肽链氨基酸序列
? 2）较短的 DNA片段，有专一性和定
向性
? 2.原理,第一个核苷酸固定于不溶性的固相载
体上,然后按预定顺序从该核苷酸开始，以 3’、
5’-磷酸二酯键与另一核苷酸进行缩合反应（封
闭非反应基团 ），其后用洗涤法除去多余的反
应物和副产物,再用同样的步骤与下一个核苷
酸进行缩合反应,如此循环将合成的寡核苷酸
链从载体上洗脱下来,解除保护基,进一步纯化。
? 应用范围,1）合成 PCR引物
? 2）寡核苷酸探针
? 3）人工接头及较小的基因
二、建立基因组 DNA文库
基因组文库,分离真核生物中某种 DNA成分,
通常是分离供体细胞中的染色体 DNA，酶
切后，将这些染色体 DNA片段与某种载体
相接，而后转入大肠杆菌，建立包含有真
核细胞染色体 DNA片断的克隆株,这种克
隆株群体。
1.特点：提供全套遗传信息,即完整的基因组
DNA,可以研究基因组中 5’端控制基因转录
的调控序列,内含子的分布和作用,以及重
复序列的数量分布及大小
2.构建基因组文库全过程（ DNA重组的过程 ）
⑴ 分离纯化基因组 DNA,
提取哺乳动物细胞染色体 DNA
⑵ 制备全部基因组的 DNA片断
①机械断裂 法
用超声波或高速搅拌 DNA溶液
断裂片段两端没有与克隆载体匹配的粘末端,因此插入
载体之前还需要进行修饰加工，少用
②限制性内切酶降解（鸟枪法）
过去用 EcoRⅠ,现在用 Sau3A
断裂片段两端有与克隆载体匹配的粘末端，可以直接与
处理过的载体连接。
? ⑶ DNA片断与载体的连接包装
? 常用载体：粘性质粒 λ噬菌体
? 酵母人工染色体
? ①基因组 DNA +粘性质粒 —— 重组 DNA—
— 转化细菌 菌落
? ②基因组 DNA + λ噬菌体 —— 重组 DNA—
包装成噬菌体 —— 感染细菌 噬菌斑
? 1个克隆含有基因组的某个片段，整个克隆
群体就包含基因组的全部基因片段总和。
基因组文库大小的计算
1975年 L.Clarke等提出了一种计算完整的基因组文库最低重
组体所需实际克隆数（ N ）的公式,
In（ 1－ P）
N = ———————
In （ 1－ f）
P为在基因组文库目的基因出现的几率（一般为 99％）； f为
插入的限制片断长度／整个基因组 DNA总长度。
例如：从人基因组 DNA（总长度为 3× 109bp）的文库中筛选
到长约 1.5kb目的基因的可能性为 99％，那么这个基因组文
库要多大？
In（ 1－ 0.99）
N = ——————————————— = 9.2× 106
In （ 1－ 1.5× 103／ 3× 109）
? 若用质粒（ pBR322）克隆目的基因（ 1.5kb）
需要有 9× 106克隆才能汇集人基因组全部 DNA
序列 ;若 用 λ噬菌体载体可构建含 15kb目的基因
的人基因组 DNA文库，按上式计算所需要的重
组体克隆数可以减少到 9× 105,而要用柯斯质粒
将 40kb目的基因片断所需要重组体克隆数可降
到 3.5× 105左右,均可满足建库要求。
载体种类
装载量
转 染 率
λ噬菌体
粘性质粒 (Cosmid)
酵母人工染色体
(YAC)
9～ 22kb
30～ 45kb
100～ 1000kb
105～ 106转化子／ μgDNA
104～ 106转化子／ μgDNA
～ 500转化子／ μgDNA
表 4-1 三种常用基因组文库克隆载体的比较
四、构建 cDNA文库
cDNA文库：以 mRNA为模板在反转录酶的
作用下将形成的互补 DNA（ cDNA ）建
立基因文库（ gene library）。
特点,
1,cDNA无内含子,长度较基因组基因小,使操
作更为方便。
2,mRNA比基因组中基因少,因此筛选某一特
定功能基因工作量较小。
3,mRNA中拷贝数大于基因组中的拷贝数,利
于获得较多的模板。（转录特征）
4,可在原核细胞中表达有生物活性蛋白
5,不同种类不同状态的细胞的 cDNA文库不同
6,不能研究基因组的结构功能
构建 cDNA文库
1.制备 mRNA
1)取材,mRNA约占总 RNA的 1－ 5％，所以应选
用目的基因 mRNA表达最丰富的组织细胞为材
料来源，如获胰岛素基因，由应以胰岛 β细胞
为原始生物材料，细胞因子基因应选用经抗原
或丝裂原刺激培养的淋巴细胞为材料
2)从总的 RNA中分离 mRNA
将提取的 mRNA在寡聚脱氧胸苷酸 [ oligo(dT) ] 纤
维素中进行 亲和层析
2.第一股 cDNA合成
1）以 Oligo(dT) 为引物：从模板 3’末端开始，
沿模板的 3’→5’ 方向合成,对于较长的 mRNA
分子很难得到全长 cDNA
2）随机引物：以 6～ 8个核苷酸为随机引物，从
mRNA的不同结合点合成全长 cDNA第一链
（ RNA-DNA）
3.第二股 cDNA的合成
⑴ 自身引导法,
⑵ 置换合成法
⑶ 外加引物合成法
4.cDNA与载体连接和
导入宿主细胞
(如图 4-5)
筛选目的基因
⑴ 核酸杂交法 特殊标记的寡核苷酸链为探
针
将扩增好的 cDNA文库（即许多带有 cDNA重
组体大肠杆菌培养皿内所形成的菌落或噬
菌斑）转印到硝酸纤维素膜上，碱解后加
带标记的探针进行杂交，能显示特异结合
探针的点（克隆）便是目的基因所在处。
确定菌落或噬菌斑的位置，扩增，提取，
再用限制性酶切出 cDNA基因片断，即为目
的基因。 （如图）
? ⑵ 免疫结合法
? 噬菌斑转印到硝酸纤维膜上，各种 cDNA
表达并呈现在噬菌体表面的蛋白质便牢
固地结合在膜上。然后将膜放入含有特
异抗体的溶液中进行免疫结合反应，洗
去未结合的抗体后，再与 125 I 标记的第二
抗体结合,从而找出带有放射性示踪信号
的斑点,进而找出对应噬菌斑,克隆扩增,
提取 DNA后经酶切可获目的基因。
获得目的基因的其他方法
㈠ 构建差示文库筛选特殊基因
差示文库（ differential library）又称扣除
文库（ subtracted library）,是反映不同组织细
胞或同一种细胞在不同生理状态下,基因表达差
异的 cDNA文库。
㈡ mRNA差异显示法 获得目的基因
mRNA差异显示（ mRNA differential
display DD） PCR法全称为 DD-PCR法其用途
和应用目的与构建差示文库大体一致。
㈢ 基因改造可获得新型目的基因
采用基因拼接、基因缺失或点突变等方法，使
表达产物量提高或降低毒性，有助于研究基因
间的相互作用（如协同／抑制效应）。
第二节 获得目的基因方法的选择
? 一、根据获得目的基因的研究目的选择方法
? 为了研究基因全长结构、调控,DNA信息分析 构建基因组文库,
? 为了开展目的基因重组表达 制药、治疗 构建 cDNA文库。
? 若目的基因序列明确可设计引物通过 PCR/RT-PCR克隆。
? 若目的基因序列短小可化学合成。
? 二、根据目的基因本身特点选择方法
? 对从基因组中克隆的基因 (内含子 ) 只能真核表达
? 对从 cDNA中克隆的基因 (无内含子 ) 可在原核 /真核表达
? 要选择 mRNA表达丰富的组织材料,PCR克隆的基因必须测序。
? 三、根据实验室设备条件选择方法
? 构建文库无需自行构建，有商品出售。
? 目的基因序列明确，也无需建库，可直接用 PCR/RT-PCR克隆。
第三节 目的基因重组体的构建
? 一、质粒 DNA的分离纯化
? 二、目的基因与载体的连接
二、目的基因与载体的连接
? ㈠ 粘性末端的连接
1,单酶切点的粘性末端 全同源性粘性末端
⑴ 高背景
⑵ 双向插入,不能定向 （ 如前图 2-5,2-6）
2,双酶切片段的定向克隆
① 粘－粘 非同源互补的粘性末端
重组方案中最有效简捷的途径 。
② 粘－平
? ㈡ 平端连接法
1,同聚物加尾法
2,用衔接物连接法
3.适配子连接法 （ 带有相应酶切点的粘性末端 ）
EcoRI粘性末端, 5’－ AGCGGCCGCG － 3’
TCGCCGGCGCTTAA－ 5’
BamHI／ PasI粘性末端,5’－ GATCCGG……,CACTGCA－ 3’
3’－ GCC……,GTG － 5’
BamHI PasI
4,T－ A克隆法
TaqDNA聚合酶在扩增目的基因 DNA的同时,能不依赖
模板而在扩增产物两 3’端加上两个游离的,A”。
目的基因
目的基因：特定功能的基因与相应载体重
组后能在宿主细胞中表达的 DNA。 相对
宿主细胞称外源基因 。
化学合成法
? 用脱氧单核苷酸按特定的已知序列以 3’-5’
磷酸二酯键的形成（采用缩合反应），
逐个进行延伸达所需长度后，去除保护
剂，再分离纯化，即可获得目的基因。
二、聚合酶链反应
1.原理：以 DNA变性复制的某些特性为原理，以目的
DNA片段为模板,利用酶促反应（ Taq酶），在特定
引物的引导下，将加入的 4种 dNTP由引物沿模板从
5’→3’ 按碱基配对原则,形成与模板 DNA互补的半保
留复制链,新合成的链又可作为下一轮循环的模板。
经 25-30个循环产物呈 2n指数扩增，由 pg— μg（紫外
可见），可获得基因片段。 （如图）
目的 DNA片段,染色体 DNA
RT-PCR, cDNA
? 2.应用,
? 1）诊断 ①带有异常外源基因（如病毒）
? ②变异基因（肿瘤、遗传病等）
? 2）合成特异基因或目的基因
? 3）合成特异探针
? 3,特点,
? ⑴反复循环便于获得大量的基因拷贝
? ⑵ Taq酶作用下每一轮 PCR循环会产生 10
－ 3～ 10－ 4的错配率,所以多用于基因检测，
如果用于基因重组表达，在此之前必须
进行 DNA序列分析。
? 原核生物, 基因组小，限制性核酸内
切酶切成若干片段后，用带有标记的核
酸探针进行杂交筛选,
? 人或哺乳类动物细胞,基因组庞大，
采用 DNA重组技术把某种生物细胞的所
有基因分区组装到载体（质粒或噬菌体）
上，并随载体导入宿主细胞中进行克隆
培养和保存这种克隆群体，这种通过重
组、克隆方法保存在宿主细胞（大肠杆
菌）中的各种重组 DNA分子的集合体叫
做 DNA文库,简称文库（ Library）。
