二、基因工程的基本程序
载体质粒
外源 DNA片段 外源 DNA插入
剪切
引入宿
主细胞
选出含有重
组 DNA的细
胞扩增 表达
a b b
A A b
第五章 分子克隆常用的工具酶
第一节 限制性核酸内切酶与 DNA
分子的体外切割
第二节 DNA连接酶和 DNA分子的
体外连接
第三节 其他工具酶
第一节 限制性核酸内切酶与 DNA
分子的体切割
限制性核酸内切酶，是一类能够识别双链
DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切
割 DNA双链结构的核酸内切酶。
? 一、寄主控制的限制与修饰作用如 图 2-1,图 2-
2
? 二、限制性核酸内切酶的制备方法
? 三、限制性核酸内切酶 分类 和 命名
? 四,Ⅱ 型限制性核酸内切酶的基本特性
? 五、影响限制性内切酶活性的因素
分类,Ⅰ Ⅱ Ⅲ
Ⅰ,识别和切割位点不固定，随机性。
Ⅲ,核酸内切酶活性和甲基化活性是
不分开的。
Ⅱ,能在识别位点处切割 DNA，切割位
点固定。核酸内切酶活性和甲基化活性
是分开的。常用。
四,Ⅱ 型限制性核酸内切酶的基本特性
识别序列, 1.4~7个核苷酸组成的特定核苷酸序
列
2.回文结构：两个顺序相同的拷贝
在 DNA链上呈反向排列 。
EcoRⅠ 5 ’-G AATTC-3 ’
3 ’-CTTAA G-5 ’
?经限制酶切割后的位点,DNA断裂类型
1.粘性末端
(1)3’-OH单链延伸的粘性末端,如,Pst Ⅰ
5’-CTGCA G-3’ 5’-CTGCA G-3’
3’-G ACGTC-5’ 3’-G ACGTC-5’
(2)5’-P单链延伸的粘性末端,如,EcoRⅠ
5’-G AATTC-3’ 5’-G AATTC-3’
3’-CTTAA G-5’ 3’-CTTAA G-5’
2.平末端 如,SmaⅠ
5’-CCC GGG-3’
3’-GGG CCC-5’
两种特殊的限制酶
(1)同尾酶 识别位点不同，酶切后产生同样的粘性末段的
两种酶。如,BamH Ⅰ 和 Bgl Ⅱ
(2)同裂酶 识别序列相同，对甲基化切点敏感性不同的两
种酶 。如,Mbo Ⅰ 和 Sau3AⅠ 共同识别序列 GATC, 但对
GmeATC切点,前者不能切，后者能切。
? 五、影响限制性内切酶活性的因素
? 1.DNA的纯度
? 2,DNA的甲基化
? （ 1）基因工程使用失去甲基化酶的大肠杆菌
? （ 2）研究基因工程 DNA的甲基化程度
? （ 3）改变限制酶的识别特性
? 3.温度
? 4.分子结构
? 5.限制酶的缓冲液
? 星号活性
? EcoRⅠ 切 GAATTC
EcoRⅠ *切 pupuATpypy 或 AATT
第二节 DNA连接酶和 DNA分子的
体外连接
? 一,DNA连接酶
DNA连接酶 （ Ligase）是一种能
够催化在双股 DNA链的 3′-OH和 5′-P
之间形成磷酸二酯键的酶，可连接互
补粘性末端或平端以及缺口修复，不
能连接单链 DNA或裂口,
温度
? 二,DNA分子的体外连接
二,DNA分子的体外连接
? 1,粘性末端 DNA片段的连接 和 单切点的
磷酸化
? 2,平末端 DNA片段的连接
? （ 1） T4DNA连接酶法
? （ 2） 同聚物加尾法
? （ 3） 用化学合成的衔接物连接 DNA分子
第三节 其他工具酶
? 一、大肠杆菌 DNA聚合酶 Ⅰ
? 二,DNA聚合酶 Ⅰ 大片段（ Klenow酶）
? 三,T4DNA聚合酶
? 四、逆转录酶
? 五、末端脱氧核苷酰转移酶
? 六、核酸酶 S1
? 七、核酸酶 BAL31
? 八、外切核酸酶 Ⅲ
? 九,T4多聚核苷酸激酶
? 十、碱性磷酸酶
? 十一,甲基化酶
命名
HindⅢ
H,Haemophilus 嗜血杆菌属
in,influenzae 流感
d,Rd株
Ⅲ,该菌株中第三个被分离到的限制酶
同尾酶 BamHI和 BglII
? AGATCT? ? GGATCC?
? TCTAGA? ? CCTAGG?
BglⅡ BamHI
? A GATCC?
? TCTAG G?
T4连接酶
AGATCC? （连接后的切点均不能被上述两种酶切）
TCTAGG?
一、大肠杆菌 DNA聚合酶 Ⅰ
? 1.三种活性
? （ 1） 5’-3’聚合酶活性 （在有 dNTP时）
? （ 2） 3’外切酶活性 （无 dNTP时大亚基活性）
? （ 3） 5’外切核酸酶活性 （无 dNTP时小亚基活性）
? 2.在基因工程中的应用, 缺口平移 标记技术。
二,DNA聚合酶 Ⅰ 大片段
（ Klenow酶）
? 1.DNA聚合酶活性 （切除小亚基，保留大亚基）
? 2,3’外切酶活性（无 dNTP时）
? 3,在基因工程中的应用
? （ 1） 标记粘性末端, ?-32P—dNTP
? 标记平末端 ?-32P—dNTP
? （ 2） 将 5’端伸出的末端填平
? （ 3） 可用来反转录合成双链 cDNA。
? （ 4） 补平粘性末端 。
三,T4DNA聚合酶
? 具有 5’-3’聚合酶活性和 3’-5’外切酶活性。
其外切酶活性比 E.coli DNA聚合酶 I的活
性高 200倍。
取代反应
四、逆转录酶
逆转录酶可以 RNA为模板，逆转录成 cDNA
第一链，又称依赖 RNA的 DNA聚合酶。
1.聚合酶活性 RNA或 DNA为模板
2,3’外切 酶 活性 能使 DNA-RNA杂合链中的
RNA降解。
应用,
? 1.RT-PCR 使 mRNA逆转录成 cDNA
? 2.制备探针。
五、末端脱氧核苷酰转移酶
? 可催化 DNA片段上的 3’-OH端加接脱氧核
糖核苷酸。
? 常用于同种碱 基多聚体接尾反应
? 核素标记 DNA片段的 3’端
六、核酸酶 S1
可以降解单链 DNA和 RNA
? (1)将 DNA切成平末端 。 有些限制性内切核酸酶
可以将 DNA切成粘性末端, 经过核酸酶 S1降解
可切除 DNA末端的单链 。 生成平末端 DNA。
? (2)切除 cDNA中 单链发夹状结构 。 反转录反应
合成的 cDNA,可能形成单链发夹状结构, 为
了得到平末端 cDNA可用核酸酶 S1分解, 生成
无发夹结构的 cDNA。
? (3)可用核酸酶 S1分析 DNA·RNA杂交分子的结
构 。
十、碱性磷酸酶
? 该酶的功能是以单链或双链的 DNA、
RNA为基质，将 DNA或 RNA片段 5’端的
磷酸切除，产生 5’-OH。
? 应用,
– (1)用该酶催化切除 DNA或 RNA5’端的磷酸,
然后加上 γ-32P-NTP在 DNA多聚核苷酸激酶
的作用下标记 5’端 。
– (2)用于避免单酶切后质粒自我环化。
十一,甲基化酶
? 常见的有 dam甲基化酶和 dcm甲基化酶，
可使相应碱基甲基化。 dam可在限制酶识
别的 5′GATC3 ′或 5′GAAT3 ′序列的 5′腺嘌
呤 N6位上引入甲基。 dcm可在限制识别的
5′CCAGG3 ′或 5′CCTGG3 ′序列的 5′胞嘧
啶引入甲基。常用于使酶切位点中的碱
基甲基化而避免降解，保护酶切位点。
核酸酶 BAL31
从线形 DNA分子两端（粘端 /平端）以渐进方式切去单核
苷酸，以形成寡聚核苷酸或制造末端缺失。此外也有类似于 SI
酶单链特异降解活性，可除去粘性末端或单链发夹结构。
外切核酸酶 Ⅲ
能从线性 DNA的 3′-OH末端沿 3 ′→ 5′ 方向切去单核苷酸，
制造 3 ′端缺失，制备 DNA模板或特异 DNA探针。
T4多聚核苷酸激酶
能将 ATP上的 γ位磷酸转移到单链或双链 DNA或 RNA的 5′-
OH上，可将 γ-32P-ATP中的 32P连接到 5′端的 5′-OH上，以完成寡
聚核苷酸的核素标记。
八、外切核酸酶 Ⅲ
它的功能是将带有 3 ’-OH末端的双链 DNA从
3 ’到 5 ’端方向切除，产生 5 ’单核苷酸
载体质粒
外源 DNA片段 外源 DNA插入
剪切
引入宿
主细胞
选出含有重
组 DNA的细
胞扩增 表达
a b b
A A b
第五章 分子克隆常用的工具酶
第一节 限制性核酸内切酶与 DNA
分子的体外切割
第二节 DNA连接酶和 DNA分子的
体外连接
第三节 其他工具酶
第一节 限制性核酸内切酶与 DNA
分子的体切割
限制性核酸内切酶，是一类能够识别双链
DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切
割 DNA双链结构的核酸内切酶。
? 一、寄主控制的限制与修饰作用如 图 2-1,图 2-
2
? 二、限制性核酸内切酶的制备方法
? 三、限制性核酸内切酶 分类 和 命名
? 四,Ⅱ 型限制性核酸内切酶的基本特性
? 五、影响限制性内切酶活性的因素
分类,Ⅰ Ⅱ Ⅲ
Ⅰ,识别和切割位点不固定，随机性。
Ⅲ,核酸内切酶活性和甲基化活性是
不分开的。
Ⅱ,能在识别位点处切割 DNA，切割位
点固定。核酸内切酶活性和甲基化活性
是分开的。常用。
四,Ⅱ 型限制性核酸内切酶的基本特性
识别序列, 1.4~7个核苷酸组成的特定核苷酸序
列
2.回文结构：两个顺序相同的拷贝
在 DNA链上呈反向排列 。
EcoRⅠ 5 ’-G AATTC-3 ’
3 ’-CTTAA G-5 ’
?经限制酶切割后的位点,DNA断裂类型
1.粘性末端
(1)3’-OH单链延伸的粘性末端,如,Pst Ⅰ
5’-CTGCA G-3’ 5’-CTGCA G-3’
3’-G ACGTC-5’ 3’-G ACGTC-5’
(2)5’-P单链延伸的粘性末端,如,EcoRⅠ
5’-G AATTC-3’ 5’-G AATTC-3’
3’-CTTAA G-5’ 3’-CTTAA G-5’
2.平末端 如,SmaⅠ
5’-CCC GGG-3’
3’-GGG CCC-5’
两种特殊的限制酶
(1)同尾酶 识别位点不同，酶切后产生同样的粘性末段的
两种酶。如,BamH Ⅰ 和 Bgl Ⅱ
(2)同裂酶 识别序列相同，对甲基化切点敏感性不同的两
种酶 。如,Mbo Ⅰ 和 Sau3AⅠ 共同识别序列 GATC, 但对
GmeATC切点,前者不能切，后者能切。
? 五、影响限制性内切酶活性的因素
? 1.DNA的纯度
? 2,DNA的甲基化
? （ 1）基因工程使用失去甲基化酶的大肠杆菌
? （ 2）研究基因工程 DNA的甲基化程度
? （ 3）改变限制酶的识别特性
? 3.温度
? 4.分子结构
? 5.限制酶的缓冲液
? 星号活性
? EcoRⅠ 切 GAATTC
EcoRⅠ *切 pupuATpypy 或 AATT
第二节 DNA连接酶和 DNA分子的
体外连接
? 一,DNA连接酶
DNA连接酶 （ Ligase）是一种能
够催化在双股 DNA链的 3′-OH和 5′-P
之间形成磷酸二酯键的酶，可连接互
补粘性末端或平端以及缺口修复，不
能连接单链 DNA或裂口,
温度
? 二,DNA分子的体外连接
二,DNA分子的体外连接
? 1,粘性末端 DNA片段的连接 和 单切点的
磷酸化
? 2,平末端 DNA片段的连接
? （ 1） T4DNA连接酶法
? （ 2） 同聚物加尾法
? （ 3） 用化学合成的衔接物连接 DNA分子
第三节 其他工具酶
? 一、大肠杆菌 DNA聚合酶 Ⅰ
? 二,DNA聚合酶 Ⅰ 大片段（ Klenow酶）
? 三,T4DNA聚合酶
? 四、逆转录酶
? 五、末端脱氧核苷酰转移酶
? 六、核酸酶 S1
? 七、核酸酶 BAL31
? 八、外切核酸酶 Ⅲ
? 九,T4多聚核苷酸激酶
? 十、碱性磷酸酶
? 十一,甲基化酶
命名
HindⅢ
H,Haemophilus 嗜血杆菌属
in,influenzae 流感
d,Rd株
Ⅲ,该菌株中第三个被分离到的限制酶
同尾酶 BamHI和 BglII
? AGATCT? ? GGATCC?
? TCTAGA? ? CCTAGG?
BglⅡ BamHI
? A GATCC?
? TCTAG G?
T4连接酶
AGATCC? （连接后的切点均不能被上述两种酶切）
TCTAGG?
一、大肠杆菌 DNA聚合酶 Ⅰ
? 1.三种活性
? （ 1） 5’-3’聚合酶活性 （在有 dNTP时）
? （ 2） 3’外切酶活性 （无 dNTP时大亚基活性）
? （ 3） 5’外切核酸酶活性 （无 dNTP时小亚基活性）
? 2.在基因工程中的应用, 缺口平移 标记技术。
二,DNA聚合酶 Ⅰ 大片段
（ Klenow酶）
? 1.DNA聚合酶活性 （切除小亚基，保留大亚基）
? 2,3’外切酶活性（无 dNTP时）
? 3,在基因工程中的应用
? （ 1） 标记粘性末端, ?-32P—dNTP
? 标记平末端 ?-32P—dNTP
? （ 2） 将 5’端伸出的末端填平
? （ 3） 可用来反转录合成双链 cDNA。
? （ 4） 补平粘性末端 。
三,T4DNA聚合酶
? 具有 5’-3’聚合酶活性和 3’-5’外切酶活性。
其外切酶活性比 E.coli DNA聚合酶 I的活
性高 200倍。
取代反应
四、逆转录酶
逆转录酶可以 RNA为模板，逆转录成 cDNA
第一链，又称依赖 RNA的 DNA聚合酶。
1.聚合酶活性 RNA或 DNA为模板
2,3’外切 酶 活性 能使 DNA-RNA杂合链中的
RNA降解。
应用,
? 1.RT-PCR 使 mRNA逆转录成 cDNA
? 2.制备探针。
五、末端脱氧核苷酰转移酶
? 可催化 DNA片段上的 3’-OH端加接脱氧核
糖核苷酸。
? 常用于同种碱 基多聚体接尾反应
? 核素标记 DNA片段的 3’端
六、核酸酶 S1
可以降解单链 DNA和 RNA
? (1)将 DNA切成平末端 。 有些限制性内切核酸酶
可以将 DNA切成粘性末端, 经过核酸酶 S1降解
可切除 DNA末端的单链 。 生成平末端 DNA。
? (2)切除 cDNA中 单链发夹状结构 。 反转录反应
合成的 cDNA,可能形成单链发夹状结构, 为
了得到平末端 cDNA可用核酸酶 S1分解, 生成
无发夹结构的 cDNA。
? (3)可用核酸酶 S1分析 DNA·RNA杂交分子的结
构 。
十、碱性磷酸酶
? 该酶的功能是以单链或双链的 DNA、
RNA为基质，将 DNA或 RNA片段 5’端的
磷酸切除，产生 5’-OH。
? 应用,
– (1)用该酶催化切除 DNA或 RNA5’端的磷酸,
然后加上 γ-32P-NTP在 DNA多聚核苷酸激酶
的作用下标记 5’端 。
– (2)用于避免单酶切后质粒自我环化。
十一,甲基化酶
? 常见的有 dam甲基化酶和 dcm甲基化酶，
可使相应碱基甲基化。 dam可在限制酶识
别的 5′GATC3 ′或 5′GAAT3 ′序列的 5′腺嘌
呤 N6位上引入甲基。 dcm可在限制识别的
5′CCAGG3 ′或 5′CCTGG3 ′序列的 5′胞嘧
啶引入甲基。常用于使酶切位点中的碱
基甲基化而避免降解，保护酶切位点。
核酸酶 BAL31
从线形 DNA分子两端（粘端 /平端）以渐进方式切去单核
苷酸，以形成寡聚核苷酸或制造末端缺失。此外也有类似于 SI
酶单链特异降解活性，可除去粘性末端或单链发夹结构。
外切核酸酶 Ⅲ
能从线性 DNA的 3′-OH末端沿 3 ′→ 5′ 方向切去单核苷酸，
制造 3 ′端缺失，制备 DNA模板或特异 DNA探针。
T4多聚核苷酸激酶
能将 ATP上的 γ位磷酸转移到单链或双链 DNA或 RNA的 5′-
OH上，可将 γ-32P-ATP中的 32P连接到 5′端的 5′-OH上，以完成寡
聚核苷酸的核素标记。
八、外切核酸酶 Ⅲ
它的功能是将带有 3 ’-OH末端的双链 DNA从
3 ’到 5 ’端方向切除，产生 5 ’单核苷酸
