第四章 真核细胞的基因表
达调控
? 第一节 真核细胞基因表达的调控
? 第二节 哺乳动物细胞表达系统的选择
标记基因
? 第三节 真核细胞表达系统的载体种类
第一节 真核细胞基因表达
的调控
? 一、真核生物基因表达的特点及优势
? 二、真核细胞表达及调控元件
第二节 哺乳动物细胞表达
系统的选择标记基因
? 一、胸苷激酶基因选择标记 （ 定义 ）
? 二、二氢叶酸还原酶基因选择标记
? 三、新霉素抗性基因选择标记
? 四、氯霉素已酰转移酶基因选择标记
? 五、黄嘌呤 -鸟嘌呤转移酶（ XGPRT）基
因
第三节 真核细胞表达系统
的载体种类
? 一、载体的类型
? 二、几种常用的真核表达载体
一,真核生物基因表达的特点
及优势
? 1.细胞的全能性
? 2.转录和翻译分开进行
? 3.有相当大的非编码区（调控序列）
? 4.有三种不同 RNA聚合酶参与转录
? 5.初级转录产物能进行剪接加工修饰
? 6.不存在操纵子结构
? 7.基因多拷贝，功能基因分散在不同区域，分
别转录
二、真核细胞表达及调控元件
? （一）真核生物基因转录水平的调控
? （二）转录后水平的调控
? （三）翻译水平的调控
胸苷激酶
? 胸腺嘧啶核苷激酶简称胸苷激酶
（ thymidine Kinase,TK）在所有真核细胞
中都有表达,是嘧啶生物合成补救代谢途
径中的一个关键酶,它可催化胸苷磷酸化
转变成为 dTMP,继续磷酸化生成 dTTP,参
与 DNA的生物合成。
一、载体的类型
? 1.质粒型载体
? 2.病毒载体
? 3.整合型表达载体
? 4.游离型表达载体
? 5.瞬时表达载体
? 6.稳定性表达载体
? 7.非复制性 HSV-Ⅰ 病毒（单纯疱疹病毒 HSV-
Ⅰ 型）载体
? 8.裂解性 HSV-Ⅰ 病毒载体
二、几种常用的真核表达载体
? ㈠ 逆转录病毒载体
– 1.卸甲载体
– 2.穿梭载体
? ㈡ 痘类病毒载体
? ㈢ HSV-Ⅰ 单纯疱疹病毒载体
– 1.重组病毒型载体
– 2.重组质粒型载体
– 3.裂解型病毒载体
（一）真核生物基因转录水平
的调控
1,基因调控的 顺式作用元件
1) 启动子
2) 增强子
3) RNA剪接信号
4) 负调控元件
5) 终止子和 polyA信号
2,基因调控的反式作用因子
1) 概念
2) 反式作用因子主要作用规律
（二）转录后水平的调控
1,mRNA前体加工：转录的 mRNA前体经
5’加帽,3’酶切加尾去除内含子后，产
生成熟 mRNA，通过核孔进入胞质中。
2,RNA编辑（ RNA editing）
（三）翻译水平的调控
1,翻译起始序列
2,eIF-2的磷酸化反应
3,由模板来源的遗传信息，进而可编码产
生不同氨基酸序列的多种蛋白质，这是
生物适应性的保护措施。
顺式作用元件
? 顺式作用元件为一些能与 DBP结合的特
定序列 DNA片段,位于真核基因上游,含有
特有的相似或一致序列,决定转录起始位
点和 RNA聚合酶的转录按效应和功能可
分为启动子、增强子,RNA间接信号、
负调控元件、终止子等调控元件。
反式作用因子主要作用规律
1,同一 DNA序列可被不同蛋白质识别
2,同一蛋白质因子可与多种不同 DNA序列发生
联系，多数是通过蛋白质 -蛋白质先相互作用
后，再与 DNA结合，发挥调节作用。
3,反式作用因子的自身生物合成有相当大的可
变性、可塑性。反式作用因子与顺式作用元
件相互作用的特定结构域，有两种类型,
1) 通用转录因子的结构域为识别特异 DNA的 DNA结
合结构域，如：锌指结构。
2) 转录调节因子的结构域又称转录活化结构域，如：
酸性 α-螺旋结构域。
? 不同结构域各自的特征
不同结构域各自的特征
1,通用转录因子的 DNA结合结构域
1) 锌指结构
2) 亮氨酸拉链
3) 螺旋 -转角 -螺旋（ HTH）
4) 螺旋 -环 -螺旋
2,转录调节因子的转录活化结构域
RNA编辑（ RNA editing）
? RNA编辑是在转录时或转录后，能够改变 RNA
分子编码特性，是与剪切形式不同的一种修饰
形式，如可使 mRNA某位点密码子 CAA转变为
UAA，使 C变 U，编辑的结果形成了 UAA终止
密码子，在编码酶的作用下，除使 C变 U，还
可在 RNA上添加多个 U或呈单个 C的添加，使
前体 mRNA变成成熟 mRNA时，通过插入或替
换方式，可改变和扩大原遗传信息，编码多种
蛋白,是生物的适应性保护。
翻译起始序列
? 在 ATG起始密码子周围要有 5’-CCACCA-
TGG-3’保守序列，以利 mRNA翻译起始，
若发生突变，其翻译水平可下降 10倍。
在起始 AUG上游若有比较多的二级结构
序列，也会影响翻译，建议外源基因的 5’
端 AUG上游序列不宜过长。
eIF-2的磷酸化反应
? eIF-2为转译起始因子 -2是蛋白质合成起始阶段
13种起始因子中最为关注的因子。若转入动物
细胞中的质粒 DNA的两条链一旦都发生转录，
就会形成双链互补 mRNA，而激活胞内的双链
RNA激活的蛋白激酶（ DAI PK）该激酶可使
eIF-2的 α-亚基磷酸化，转译受抑，为防止该激
酶活化，常在载体上加上腺病毒的 VARNA基
因,VARNA是由 RNA聚合酶 Ⅲ 合成的小分子
RNA，能阻止双链 RNA对 DAI激酶的激活作用，
使转译得以正常进行。
一、胸苷激酶基因选择标记
? 外源基因 +载体 (TK+)的重组体导入 TK-细胞中，
在 HAT（次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷）
选择培养基中筛选,TK-细胞因氨基喋呤抑制
了 dTTP的合成而死亡,TK+细胞可存活，以此
进行筛选。（ HSV-1的 TK基因转染细胞加 GCV
后被杀死，如小鼠 LMTK-细胞。）
? 注,TK++BrUdR因掺入后对紫外线敏感而死亡,
? TK-+BrUdR因不掺入，对紫外线不敏感而存活。
二、二氢叶酸还原酶基因
（ DHFR）选择标记
? DHFR是合成 dATP和 dGTP的关键酶。常
用 DHFR—的 CHO细胞因不能合成四氢叶
酸，只能在含胸腺嘧啶核苷、甘氨酸和
嘌呤的培养基中生长。在不含该培养基
中导入该标记基因重组子，则可筛选出
阳性克隆，也可将 DHFR基因置在强启动
子下高表达或通过 DHFR基因突变以提高
抵抗高浓度氨甲喋呤（抗 MTX的抗性）
的能力，从而筛选阳性克隆。
三、新霉素抗性基因选择标记
? 新霉素类似物 G418抗生素，可影响 80s
核糖体 RNA功能，对细胞有毒性。新霉
素抗性基因 neo的载体可在真核细胞中表
达产生新霉素磷酸转移酶能使 G418失活，
可在含 G418培养基中筛选重组体转化的
阳性克隆细胞。阳性克隆存活，阴性者
死亡。
五、黄嘌呤 -鸟嘌呤转移酶（ XGPRT）
基因
? 哺乳动物细胞无 XGPRT酶，不能利用黄嘌呤形成黄
嘌呤磷酸（ XMP），但有鸟嘌呤磷酸核糖转移酶
（ HGPRT），可催化黄嘌呤形成次黄嘌呤磷酸
（ IMP）。哺乳动物细胞可通过 IMP生成 GMP。当用
IMP脱氢酶抑制剂霉酚酸，抑制了 GMP的合成，使
细胞失去合成 DNA能力而死亡。
? 将含 XGPRT基因的重组体导入真核细胞后，在转化
细胞中就能表达 XGPRT酶，可在含有黄嘌呤的培养
基中通过 XMP中间体补救合成 GMP，使 DNA合成正
常进行，加入霉酚酸后，阳性克隆因不受霉酚酸的
抑制而存活，而未转化的阴性细胞则受霉酚酸的抑
制而死亡，以此可用来筛选阳性细胞 。
1.质粒型载体
? 质粒型载体（穿梭载体）：实际上是病
毒质粒型载体，共有两套复制元件和选
择标记，在原核中复制，真核中表达。
2.病毒载体
? 病毒载体种类多,SV40,Adv,RV、
HSV-1、痘苗 V。可在敏感细胞中复制，
表达外源基因，有的还可通过整合后表
达。
3.整合型表达载体
? RV,SV40可携带外源基因整合到宿主细
胞的基因组中进行表达。
4.游离型表达载体
? 该病毒载体是以完整的或缺陷病毒形式
携带外源基因导入宿主细胞后不发生整
合，可在胞浆中游离复制，表达外源基
因，如痘苗 V,Adv。
5.瞬时表达载体
? 瞬时表达载体（转染后 70-90h左右）：
含病毒复制子的病毒载体，可携带外源
基因导入宿主细胞，不整合到染色体上，
只在细胞内进行暂时性表达，不能随细
胞传代，随后逐渐降低或消失。常用
SV40复制子载体，在 COS细胞中表达，
由于载体复制，若超过 104个 /细胞，细胞
不能承受而死亡。
6.稳定性表达载体
? 将外源基因与具标记基因（ DHFR）病毒
载体转染动物细胞（ CHO），可将基因
整合到细胞染色体上，可随细胞转录表
达和传代。（ CHO,DUKX-B11因加入
氨甲喋呤而死亡，依此筛选阳性克隆。）
7.非复制性 HSV-Ⅰ 病毒（单纯
疱疹病毒 HSV-Ⅰ 型）载体
? HSV-1病毒去除 α极早期基因，失去复制
能力，但携带外源基因转染细胞后高效
表达，毒性小，转染和表达能力强。
8.裂解性 HSV-Ⅰ 病毒载体
? HSV-1病毒去除了 β早期基因，而不能产
生 DNA合成所需的酶，该病毒在静止细
胞中不能复制和裂解细胞，但在高度分
裂活跃的细胞中（如肿瘤）可复制并裂
解感染的细胞，因分裂活跃细胞可提供
病毒复制所需的 DNA合成酶，复制时只
杀死肿瘤细胞，对正常细胞无损害。
㈠ 逆转录病毒载体
? 逆转录病毒载体是 RNA单链,pol基因产
生逆转录酶，使单链生成双链。有 5’,3’
的 U3RU5的长末端重复序列，有 TATA强
启动子和加尾功能，经体外包装，可整
合表达。穿梭质粒载体组装基因后，可
由辅助病毒协助或经体外细胞包装，形
成具感染性假病毒颗粒，再感染宿主细
胞进行表达。
㈡ 痘类病毒载体
? 已用于构建多价活疫苗载体（ HBsAg、
HA、狂犬,HAV、麻疹 V,HSV-Ⅱ,
EBV等。该载体的双链 DNA的大病毒载
体，组装量大，安全，可在细胞独立复
制，表达。
1.重组病毒型载体
? 在 HSV-1非必需区插入外源基因的重组
体 DNA与野毒株共转染细胞，可发生同
源重组，通过 LacZ筛选，转染效率高，
无需辅助病毒，但有毒性作用 。
启动子
? 大多位于基因 5’端上游区，是一种与基
因转录起始有关的 5’端 DNA序列，在 -
30bp区有 TATA box，可引导 RNA聚合酶
Ⅱ 转录起始，在 -70~-80bp区还有 GC box，
可协同调节转录起始频率和提高转录效
率。
? 常用的启动子有 RSV启动子,CMV启动
子,SV40早期启动子。
增强子
? 增强子是一类可使启动子的基因转录效率显著
提高的顺式作用元件，本身无启动子活性，可
独立存在与上游区、下游区或基因内部，可进
行远距离增强启动作用，而且无方向性。它有
特征性序列，常由 812bp组成，以单拷贝或多
拷贝的形式存在。
? 增强子可使转录效率增强 10-100倍，通常来源
于 SV40,RSV或 CMV病毒。一旦增强子的作
用使表达产物对细胞有毒性时，最好改用诱导
型启动子来表达外源基因，如热休克启动子、
金属硫蛋白启动子。
RNA剪接信号
? 虽然 cDNA来源的基因转入哺乳类细胞后，
其表达不受有或无内含子的影响，但在
该细胞中表达最好有一段内含子序列的
剪接信号，以提供对 cDNA基因表达的需
要，常用 SV40的小 t抗原的内含子序列来
作为 cDNA中的内含子剪接序列。
负调控元件
? 沉默子和衰减子为转录的负调控元件，
它们与反式作用因子相互作用而起作用，
不受距离、方向、基因来源的限制。
终止子和 polyA信号
? 真核基因转录的确切终止信号和终止机制目前
尚不清楚，现发现在模板 DNA分子 3’端有一终
止序列，称终止子，产生具有 polyA尾的转录
序列，在 DNA区域内 G/T簇。如 SV40中的终止
子序列为 AGGTTTTTT的 DNA序列，并有发夹
结构的反向重复序列。
? polyA可使 mRNA稳定其多聚腺苷酸化需要两
种序列：①位于 polyA位点下游的 GU或 U丰富
区，②位于 polyA上游 11-30bp处的 6bp高度保守
序列（ 5’-AAUAAA）与转录后的 RNA切割和
加尾有关。
反式作用因子的概念
? 反式作用因子是一组能直接或间接地与 DNA的
顺式作用元件特定序列结合，发挥调节作用的
核内非组蛋白，即 DNA结合蛋白（ DBP），
DBP又称转录因子（ transcription factor,TF）分
通用转录因子及转录调节因子两大类。基因表
达的组织特异性及细胞周期特异性受上述元件
和因子的相互作用所决定，通用转录因子中识
别 TATA box的为 TFⅡ D，可与 RNA聚合酶 Ⅱ
结合使转录起始，识别 GC box的 DBP为 SP1，
可调控转录效率。
锌指结构
? 锌指（ zine finger）结构：由
两个半胱氨酸（ Cys）和两个
组氨酸（ His）残基通过位于
中心的锌离子结合成一个稳定
的指状结构，表面暴露的碱基
及其极性氨基酸与 DNA结合
有关。一个蛋白分子有 2-9个
锌指重复单位，由指部碱基或
极性氨基酸（赖氨酸 Lys、精
氨酸 Arg）结合于 DNA双螺旋
的深沟内。结构域为以锌辅基
螯和形成的环状结构作为活性
结构域。
亮氨酸拉链
? 亮氨酸拉链（ Leucine zipper，
LZ）：为两组走向平行带亮氨
酸的 α-螺旋形成的对称二聚体，
每个亚基含 4个亮氨酸，每 2个
Leu之间相隔 6个氨基酸。于 α-螺
旋的某一侧面，每 2圈（ 3.6碱基
/圈）就出现一个 Leu，排成一排，
使 2个 α-螺旋蛋白分子间形成一
条拉链，只有在形成二聚体拉链
后，链上富含的碱性氨基酸区可
与 DNA结合。
? 结构域为链上碱性区和亮氨酸拉
链形成的稳定结构为基础。
螺旋 -转角 -螺旋（ HTH）
? 螺旋 -转角 -螺旋（ helix-turn-helix,HTH）：此 α-
螺旋中含碱性氨基酸较多，其所带的正电荷基团
可与带负电荷的 DNA链结合。
螺旋 -环 -螺旋
? 螺旋 -环 -螺旋（ helix-loop-helix,HLH）,HLH
与 HTH结构相似，不同之处为两个 α-螺旋之间的
肽链为非螺旋的环，在 α-螺旋附近的氨基酸也有
碱性区，为与 DNA结合所必需,DNA结合性质
与亮氨酸拉链相似。
转录调节因子的转录活化结构
域
? DBP中有一段与非特异性调控转录活性
功能有关的结构区域，主要有：①酸性
α-螺旋结构域。此结构域含有较多的带
负电荷，并能形成亲脂性 α-螺旋区域。
②富含谷氨酰胺结构域，在结构域中含
有 25%谷氨酰胺。③富含脯氨酸结构区
域，在此结构中有富含脯氨酸结构区域，
约含有 20-30%脯氨酸。
达调控
? 第一节 真核细胞基因表达的调控
? 第二节 哺乳动物细胞表达系统的选择
标记基因
? 第三节 真核细胞表达系统的载体种类
第一节 真核细胞基因表达
的调控
? 一、真核生物基因表达的特点及优势
? 二、真核细胞表达及调控元件
第二节 哺乳动物细胞表达
系统的选择标记基因
? 一、胸苷激酶基因选择标记 （ 定义 ）
? 二、二氢叶酸还原酶基因选择标记
? 三、新霉素抗性基因选择标记
? 四、氯霉素已酰转移酶基因选择标记
? 五、黄嘌呤 -鸟嘌呤转移酶（ XGPRT）基
因
第三节 真核细胞表达系统
的载体种类
? 一、载体的类型
? 二、几种常用的真核表达载体
一,真核生物基因表达的特点
及优势
? 1.细胞的全能性
? 2.转录和翻译分开进行
? 3.有相当大的非编码区（调控序列）
? 4.有三种不同 RNA聚合酶参与转录
? 5.初级转录产物能进行剪接加工修饰
? 6.不存在操纵子结构
? 7.基因多拷贝，功能基因分散在不同区域，分
别转录
二、真核细胞表达及调控元件
? （一）真核生物基因转录水平的调控
? （二）转录后水平的调控
? （三）翻译水平的调控
胸苷激酶
? 胸腺嘧啶核苷激酶简称胸苷激酶
（ thymidine Kinase,TK）在所有真核细胞
中都有表达,是嘧啶生物合成补救代谢途
径中的一个关键酶,它可催化胸苷磷酸化
转变成为 dTMP,继续磷酸化生成 dTTP,参
与 DNA的生物合成。
一、载体的类型
? 1.质粒型载体
? 2.病毒载体
? 3.整合型表达载体
? 4.游离型表达载体
? 5.瞬时表达载体
? 6.稳定性表达载体
? 7.非复制性 HSV-Ⅰ 病毒（单纯疱疹病毒 HSV-
Ⅰ 型）载体
? 8.裂解性 HSV-Ⅰ 病毒载体
二、几种常用的真核表达载体
? ㈠ 逆转录病毒载体
– 1.卸甲载体
– 2.穿梭载体
? ㈡ 痘类病毒载体
? ㈢ HSV-Ⅰ 单纯疱疹病毒载体
– 1.重组病毒型载体
– 2.重组质粒型载体
– 3.裂解型病毒载体
（一）真核生物基因转录水平
的调控
1,基因调控的 顺式作用元件
1) 启动子
2) 增强子
3) RNA剪接信号
4) 负调控元件
5) 终止子和 polyA信号
2,基因调控的反式作用因子
1) 概念
2) 反式作用因子主要作用规律
（二）转录后水平的调控
1,mRNA前体加工：转录的 mRNA前体经
5’加帽,3’酶切加尾去除内含子后，产
生成熟 mRNA，通过核孔进入胞质中。
2,RNA编辑（ RNA editing）
（三）翻译水平的调控
1,翻译起始序列
2,eIF-2的磷酸化反应
3,由模板来源的遗传信息，进而可编码产
生不同氨基酸序列的多种蛋白质，这是
生物适应性的保护措施。
顺式作用元件
? 顺式作用元件为一些能与 DBP结合的特
定序列 DNA片段,位于真核基因上游,含有
特有的相似或一致序列,决定转录起始位
点和 RNA聚合酶的转录按效应和功能可
分为启动子、增强子,RNA间接信号、
负调控元件、终止子等调控元件。
反式作用因子主要作用规律
1,同一 DNA序列可被不同蛋白质识别
2,同一蛋白质因子可与多种不同 DNA序列发生
联系，多数是通过蛋白质 -蛋白质先相互作用
后，再与 DNA结合，发挥调节作用。
3,反式作用因子的自身生物合成有相当大的可
变性、可塑性。反式作用因子与顺式作用元
件相互作用的特定结构域，有两种类型,
1) 通用转录因子的结构域为识别特异 DNA的 DNA结
合结构域，如：锌指结构。
2) 转录调节因子的结构域又称转录活化结构域，如：
酸性 α-螺旋结构域。
? 不同结构域各自的特征
不同结构域各自的特征
1,通用转录因子的 DNA结合结构域
1) 锌指结构
2) 亮氨酸拉链
3) 螺旋 -转角 -螺旋（ HTH）
4) 螺旋 -环 -螺旋
2,转录调节因子的转录活化结构域
RNA编辑（ RNA editing）
? RNA编辑是在转录时或转录后，能够改变 RNA
分子编码特性，是与剪切形式不同的一种修饰
形式，如可使 mRNA某位点密码子 CAA转变为
UAA，使 C变 U，编辑的结果形成了 UAA终止
密码子，在编码酶的作用下，除使 C变 U，还
可在 RNA上添加多个 U或呈单个 C的添加，使
前体 mRNA变成成熟 mRNA时，通过插入或替
换方式，可改变和扩大原遗传信息，编码多种
蛋白,是生物的适应性保护。
翻译起始序列
? 在 ATG起始密码子周围要有 5’-CCACCA-
TGG-3’保守序列，以利 mRNA翻译起始，
若发生突变，其翻译水平可下降 10倍。
在起始 AUG上游若有比较多的二级结构
序列，也会影响翻译，建议外源基因的 5’
端 AUG上游序列不宜过长。
eIF-2的磷酸化反应
? eIF-2为转译起始因子 -2是蛋白质合成起始阶段
13种起始因子中最为关注的因子。若转入动物
细胞中的质粒 DNA的两条链一旦都发生转录，
就会形成双链互补 mRNA，而激活胞内的双链
RNA激活的蛋白激酶（ DAI PK）该激酶可使
eIF-2的 α-亚基磷酸化，转译受抑，为防止该激
酶活化，常在载体上加上腺病毒的 VARNA基
因,VARNA是由 RNA聚合酶 Ⅲ 合成的小分子
RNA，能阻止双链 RNA对 DAI激酶的激活作用，
使转译得以正常进行。
一、胸苷激酶基因选择标记
? 外源基因 +载体 (TK+)的重组体导入 TK-细胞中，
在 HAT（次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷）
选择培养基中筛选,TK-细胞因氨基喋呤抑制
了 dTTP的合成而死亡,TK+细胞可存活，以此
进行筛选。（ HSV-1的 TK基因转染细胞加 GCV
后被杀死，如小鼠 LMTK-细胞。）
? 注,TK++BrUdR因掺入后对紫外线敏感而死亡,
? TK-+BrUdR因不掺入，对紫外线不敏感而存活。
二、二氢叶酸还原酶基因
（ DHFR）选择标记
? DHFR是合成 dATP和 dGTP的关键酶。常
用 DHFR—的 CHO细胞因不能合成四氢叶
酸，只能在含胸腺嘧啶核苷、甘氨酸和
嘌呤的培养基中生长。在不含该培养基
中导入该标记基因重组子，则可筛选出
阳性克隆，也可将 DHFR基因置在强启动
子下高表达或通过 DHFR基因突变以提高
抵抗高浓度氨甲喋呤（抗 MTX的抗性）
的能力，从而筛选阳性克隆。
三、新霉素抗性基因选择标记
? 新霉素类似物 G418抗生素，可影响 80s
核糖体 RNA功能，对细胞有毒性。新霉
素抗性基因 neo的载体可在真核细胞中表
达产生新霉素磷酸转移酶能使 G418失活，
可在含 G418培养基中筛选重组体转化的
阳性克隆细胞。阳性克隆存活，阴性者
死亡。
五、黄嘌呤 -鸟嘌呤转移酶（ XGPRT）
基因
? 哺乳动物细胞无 XGPRT酶，不能利用黄嘌呤形成黄
嘌呤磷酸（ XMP），但有鸟嘌呤磷酸核糖转移酶
（ HGPRT），可催化黄嘌呤形成次黄嘌呤磷酸
（ IMP）。哺乳动物细胞可通过 IMP生成 GMP。当用
IMP脱氢酶抑制剂霉酚酸，抑制了 GMP的合成，使
细胞失去合成 DNA能力而死亡。
? 将含 XGPRT基因的重组体导入真核细胞后，在转化
细胞中就能表达 XGPRT酶，可在含有黄嘌呤的培养
基中通过 XMP中间体补救合成 GMP，使 DNA合成正
常进行，加入霉酚酸后，阳性克隆因不受霉酚酸的
抑制而存活，而未转化的阴性细胞则受霉酚酸的抑
制而死亡，以此可用来筛选阳性细胞 。
1.质粒型载体
? 质粒型载体（穿梭载体）：实际上是病
毒质粒型载体，共有两套复制元件和选
择标记，在原核中复制，真核中表达。
2.病毒载体
? 病毒载体种类多,SV40,Adv,RV、
HSV-1、痘苗 V。可在敏感细胞中复制，
表达外源基因，有的还可通过整合后表
达。
3.整合型表达载体
? RV,SV40可携带外源基因整合到宿主细
胞的基因组中进行表达。
4.游离型表达载体
? 该病毒载体是以完整的或缺陷病毒形式
携带外源基因导入宿主细胞后不发生整
合，可在胞浆中游离复制，表达外源基
因，如痘苗 V,Adv。
5.瞬时表达载体
? 瞬时表达载体（转染后 70-90h左右）：
含病毒复制子的病毒载体，可携带外源
基因导入宿主细胞，不整合到染色体上，
只在细胞内进行暂时性表达，不能随细
胞传代，随后逐渐降低或消失。常用
SV40复制子载体，在 COS细胞中表达，
由于载体复制，若超过 104个 /细胞，细胞
不能承受而死亡。
6.稳定性表达载体
? 将外源基因与具标记基因（ DHFR）病毒
载体转染动物细胞（ CHO），可将基因
整合到细胞染色体上，可随细胞转录表
达和传代。（ CHO,DUKX-B11因加入
氨甲喋呤而死亡，依此筛选阳性克隆。）
7.非复制性 HSV-Ⅰ 病毒（单纯
疱疹病毒 HSV-Ⅰ 型）载体
? HSV-1病毒去除 α极早期基因，失去复制
能力，但携带外源基因转染细胞后高效
表达，毒性小，转染和表达能力强。
8.裂解性 HSV-Ⅰ 病毒载体
? HSV-1病毒去除了 β早期基因，而不能产
生 DNA合成所需的酶，该病毒在静止细
胞中不能复制和裂解细胞，但在高度分
裂活跃的细胞中（如肿瘤）可复制并裂
解感染的细胞，因分裂活跃细胞可提供
病毒复制所需的 DNA合成酶，复制时只
杀死肿瘤细胞，对正常细胞无损害。
㈠ 逆转录病毒载体
? 逆转录病毒载体是 RNA单链,pol基因产
生逆转录酶，使单链生成双链。有 5’,3’
的 U3RU5的长末端重复序列，有 TATA强
启动子和加尾功能，经体外包装，可整
合表达。穿梭质粒载体组装基因后，可
由辅助病毒协助或经体外细胞包装，形
成具感染性假病毒颗粒，再感染宿主细
胞进行表达。
㈡ 痘类病毒载体
? 已用于构建多价活疫苗载体（ HBsAg、
HA、狂犬,HAV、麻疹 V,HSV-Ⅱ,
EBV等。该载体的双链 DNA的大病毒载
体，组装量大，安全，可在细胞独立复
制，表达。
1.重组病毒型载体
? 在 HSV-1非必需区插入外源基因的重组
体 DNA与野毒株共转染细胞，可发生同
源重组，通过 LacZ筛选，转染效率高，
无需辅助病毒，但有毒性作用 。
启动子
? 大多位于基因 5’端上游区，是一种与基
因转录起始有关的 5’端 DNA序列，在 -
30bp区有 TATA box，可引导 RNA聚合酶
Ⅱ 转录起始，在 -70~-80bp区还有 GC box，
可协同调节转录起始频率和提高转录效
率。
? 常用的启动子有 RSV启动子,CMV启动
子,SV40早期启动子。
增强子
? 增强子是一类可使启动子的基因转录效率显著
提高的顺式作用元件，本身无启动子活性，可
独立存在与上游区、下游区或基因内部，可进
行远距离增强启动作用，而且无方向性。它有
特征性序列，常由 812bp组成，以单拷贝或多
拷贝的形式存在。
? 增强子可使转录效率增强 10-100倍，通常来源
于 SV40,RSV或 CMV病毒。一旦增强子的作
用使表达产物对细胞有毒性时，最好改用诱导
型启动子来表达外源基因，如热休克启动子、
金属硫蛋白启动子。
RNA剪接信号
? 虽然 cDNA来源的基因转入哺乳类细胞后，
其表达不受有或无内含子的影响，但在
该细胞中表达最好有一段内含子序列的
剪接信号，以提供对 cDNA基因表达的需
要，常用 SV40的小 t抗原的内含子序列来
作为 cDNA中的内含子剪接序列。
负调控元件
? 沉默子和衰减子为转录的负调控元件，
它们与反式作用因子相互作用而起作用，
不受距离、方向、基因来源的限制。
终止子和 polyA信号
? 真核基因转录的确切终止信号和终止机制目前
尚不清楚，现发现在模板 DNA分子 3’端有一终
止序列，称终止子，产生具有 polyA尾的转录
序列，在 DNA区域内 G/T簇。如 SV40中的终止
子序列为 AGGTTTTTT的 DNA序列，并有发夹
结构的反向重复序列。
? polyA可使 mRNA稳定其多聚腺苷酸化需要两
种序列：①位于 polyA位点下游的 GU或 U丰富
区，②位于 polyA上游 11-30bp处的 6bp高度保守
序列（ 5’-AAUAAA）与转录后的 RNA切割和
加尾有关。
反式作用因子的概念
? 反式作用因子是一组能直接或间接地与 DNA的
顺式作用元件特定序列结合，发挥调节作用的
核内非组蛋白，即 DNA结合蛋白（ DBP），
DBP又称转录因子（ transcription factor,TF）分
通用转录因子及转录调节因子两大类。基因表
达的组织特异性及细胞周期特异性受上述元件
和因子的相互作用所决定，通用转录因子中识
别 TATA box的为 TFⅡ D，可与 RNA聚合酶 Ⅱ
结合使转录起始，识别 GC box的 DBP为 SP1，
可调控转录效率。
锌指结构
? 锌指（ zine finger）结构：由
两个半胱氨酸（ Cys）和两个
组氨酸（ His）残基通过位于
中心的锌离子结合成一个稳定
的指状结构，表面暴露的碱基
及其极性氨基酸与 DNA结合
有关。一个蛋白分子有 2-9个
锌指重复单位，由指部碱基或
极性氨基酸（赖氨酸 Lys、精
氨酸 Arg）结合于 DNA双螺旋
的深沟内。结构域为以锌辅基
螯和形成的环状结构作为活性
结构域。
亮氨酸拉链
? 亮氨酸拉链（ Leucine zipper，
LZ）：为两组走向平行带亮氨
酸的 α-螺旋形成的对称二聚体，
每个亚基含 4个亮氨酸，每 2个
Leu之间相隔 6个氨基酸。于 α-螺
旋的某一侧面，每 2圈（ 3.6碱基
/圈）就出现一个 Leu，排成一排，
使 2个 α-螺旋蛋白分子间形成一
条拉链，只有在形成二聚体拉链
后，链上富含的碱性氨基酸区可
与 DNA结合。
? 结构域为链上碱性区和亮氨酸拉
链形成的稳定结构为基础。
螺旋 -转角 -螺旋（ HTH）
? 螺旋 -转角 -螺旋（ helix-turn-helix,HTH）：此 α-
螺旋中含碱性氨基酸较多，其所带的正电荷基团
可与带负电荷的 DNA链结合。
螺旋 -环 -螺旋
? 螺旋 -环 -螺旋（ helix-loop-helix,HLH）,HLH
与 HTH结构相似，不同之处为两个 α-螺旋之间的
肽链为非螺旋的环，在 α-螺旋附近的氨基酸也有
碱性区，为与 DNA结合所必需,DNA结合性质
与亮氨酸拉链相似。
转录调节因子的转录活化结构
域
? DBP中有一段与非特异性调控转录活性
功能有关的结构区域，主要有：①酸性
α-螺旋结构域。此结构域含有较多的带
负电荷，并能形成亲脂性 α-螺旋区域。
②富含谷氨酰胺结构域，在结构域中含
有 25%谷氨酰胺。③富含脯氨酸结构区
域，在此结构中有富含脯氨酸结构区域，
约含有 20-30%脯氨酸。
