第八章 微生物遗传学
第一节 遗传的物质基础及其特性
第二节 遗传信息的表达
第三节 细胞中遗传信息的变异
第四节 微生物的诱变育种和遗传工程
何谓遗传学？
遗传学 是关于遗传物质的生理生化性质、世代传递
方式，以及所携带的信息在个体发育中的表达的
一门科学。
早期的遗传学研究亲代与子代之间遗传性状的传递，
提出了遗传的染色体理论，对基因进行了作图，
并发现了基因重组现象，故名 传递遗传学 。
近代的遗传学则进一步从分子水平上研究基因的构
成、复制、表达、突变和修复等，被称为 分子遗
传学 。
微生物遗传学
涉及部分真核生物，所有的原核生物，以及病毒
的遗传；
介绍微生物的遗传物质的结构特点、遗传信息的
表达与调控、遗传变异的基本规律；
介绍通过基因操作改变微生物的遗传信息从而有
效地控制或利用微生物的基本策略。
第一节 遗传的物质基础及其特性
一、遗传物质的鉴定
二、脱氧核糖核酸
三、基因组 DNA和染色体
四、染色体以外的遗传因子
经典试验 1,肺炎链球菌的转化试验
图 8,1（ a） S型和 R型细胞侵染试验
一、遗传物质的鉴定
分离后的 S型细胞物质对 R型细胞的转化
图 8.1（ b）
结论
细胞生物的遗传物质是双链 DNA
病毒的乙醇物质可以是单链的或双链
的 DNA或 RNA,即,ssDNA，
dsDNA,ssRNA或 dsRNA。
二、脱氧核糖核酸
1．核酸的化学组成和结构
2,DNA的复制方式
3,DNA的理化性质
1．核酸的化学组成和结构
Watson 和 Crick在 1953年描述了 DNA的结构模型,
DNA分子是由两条相互平行、方向相反的多核
苷酸单链以右手螺旋方向相互缠绕而形成的双螺旋。
脱氧核糖和磷酸构成的主链位于外围，通过氢键
相互交联的碱基处于双螺旋的内部。
腺嘌呤与胸腺嘧啶配对，鸟嘌呤与胞嘧啶配对；
两条单链互补；一条链的碱基序列限定了另一条链的
序列。
Rosalind Franklin 的贡献
Watson and Crick proposed DNA
structure in 1953 by building models
based on chemical and physical data
that had been gathered in other labs,
primarily x-ray diffraction data collected
by Rosalind Franklin et al,
2,DNA的复制方式
细菌 DNA的 q-形复制 真核生物 DNA的复制
10～ 100 mm
复制叉
复
制
叉
复
制
原
点
模板
新生链
DNA的滚环复制模式
图 8,2
切口
5’
5’
3’
3’
3’
模板
新生链
互补链合成
3,DNA的理化性质
DNA的稳定性
在溶液中,DNA具有一定的粘性，易受剪切
力的破坏；易被核酸酶降解；
在强酸中,DNA能被水解成碱基、糖和磷酸；
在特定的稀酸中 (如 pH 3~4)，不同碱基与核糖
之间的糖苷键会发生特异性的断裂，根据这种特
异性可测定 DNA的碱基序列；
在稀碱如 0.2当量 NaOH中，双链 DNA很快变
性产生单链 DNA，继而单链 DNA被进一步破坏。
3,DNA的理化性质（ 2）
DNA的光学性质
DNA中的碱基属于芳香簇化合物，能够
吸收紫外光 (UV)。 DNA吸收峰的光波波长为
260纳米；当浓度为 1 mg/ml时,
dsDNA, A260=20
ssDNA,RNA, A260≌ 25
人们根据 A260测定 DNA的浓度,根据
A260 / A280和估算 DNA的纯度。
3,DNA的理化性质（ 3）
DNA的热变性
双链 DNA在一定的高温下解链 (变性 )产生
单链 DNA。双链 DNA完全解链后，紫外吸收值
A260可以提高 40％，当吸收值的提高达到中点
时的温度称为 解链温度 （ Tm）。
1.4
1.2
1.0
70 80 90
100° C Tm
3,DNA的理化性质（ 4）
复性、退火或杂交
当温度缓慢降低时，序列互补的单链
DNA能够渐渐地重新配对，即 复性 。
不同来源的 DNA之间碱基序列互补的
区段进行的碱基配对称为 退火 或 杂交,这
被广泛应用于 DNA的扩增、定点诱变、基
因鉴别。
3,DNA的理化性质（ 5）
分子特征 与 微生物分类鉴定
DNA中的 G＋ C含量通常通过 Tm值来测定。同
一个属的细菌,G＋ C含量的变化一般小于 10％。
DNA－ DNA杂交技术用于研究亲缘关系近的
微生物。
如果两菌株在最适条件下杂交,DNA相关性
>70%，且 Tm值差别 <5％，它们就被认为同种。
三、基因组 DNA和染色体
基因组 是指一种生物体内单套遗传物质的全
部遗传基因。 染色体 指携带细胞功能所必备的基
因的遗传单元。
病毒 是非细胞生物，它们的全套遗传基因称
为基因组，但不足以形成染色体。
原核生物 的染色体常为一个环状的 DNA分子。
真核生物 的细胞有几条至几十条染色体，各
含一个线状的 DNA分子。
细菌染色体 DNA的大小和结构
(a)大肠杆菌细胞大小和染色体 DNA长度的比较； (b)细菌细胞中的拟核； (c)大肠杆
菌染色体结构电镜图。 宽 1.1~1.5 mm、长 2~6 mm的细胞里包装着的一个 DNA分
子的长度达 1 mm；这个环状的 DNA分子在细胞中形成含有一个染色体的拟核；在染
色体的中心有一个由 DNA结合蛋白和膜组成的骨架,DNA分子附着在骨架上形成
50~100个超螺旋的环，每个环中含碱基对约 50~100 kb，这种多层次折叠使 DNA
处于高度压缩状态,
From figures in referenced book 5,
真核生物细胞中的 DNA中只有不到 5％的 DNA用于所需蛋白质的基因表达，其
余的 DNA起, 结构, 作用或, 调节, 作用。
DNA被紧密地包装在多条染色体中，每条染色体中含有一个线状 DNA分子，它
以左手螺旋方向围着一个个组蛋白八聚体绕圈 1.8周，形成串珠状的染色质，被
串在一起的小颗粒称为核小体，染色质进一步卷曲形成每圈 6个核小体、直径 30
nm的染色质丝，它折叠成许多超螺旋环附着在中央骨架上。
真核生物的染色体结构
From BIOLOGY by Jack C Carey et al.,eds
四、染色体以外的遗传因子
线粒体和叶绿体中含有的 DNA能够自体复制，并
编码执行线粒体和叶绿体功能的蛋白，属于染色体以
外的遗传因子。
质粒 一般指存在于细菌、真菌等微生物细胞中，
独立于染色体以外，能进行自我复制的遗传因子。质
粒的大小为 1～ 1000 kb，常为环状的双链 DNA分子，
也有线状 DNA或 RNA质粒。
有些质粒既能够整合到染色体上，又能以游离状
态存在，并能携带部分染色体基因进行转移，它们被
称为 附加体 。
第二节 遗传信息的表达
一、真核生物基因的转录及其调控
二、原核生物基因的转录及其调控
三、翻译过程中的调控
四、调控信号与系统性调控
主要调控机制的调控模型
图 8.5
一、真核生物的基因转录及其调控
1,真核生物的基因转录
常见启动子 是位于转录起始位点上游 25－ 30
个碱基对的 TATA盒；另一些基因则含有一个与转
录起始位点重叠的起始元件。
RNA聚合酶 Ⅱ 催化合成的是 Pre-RNA，它 必
须经过加工才形成成熟 mRNA。
Pre-RNA的 加工在细胞核中进行，主要加工步
骤,5′端加帽, 3′端加尾, 剪接去除插入子 等。
发生在 pre-mRNA转录的早期，当新生 RNA分子
长度达到 25～ 30核苷酸时，加帽酶使新生转录物的 5′
端第一个核苷酸 (A或 G)g位的磷酸水解，并加上 7-甲基
鸟苷三磷酸。
2,5′端加帽反应和帽子结构
图 8.8帽子结构,5′端第一个核苷酸是 7-甲基鸟苷三磷酸，它以
5′三磷酸酯键与第二个核苷酸的 5′端相连，而不是通常的 3′,5′磷酸二酯键。
甲基
3,3′端的加尾过程
3′端加 poly(A)发生于插入子剪切之前。
Pre-mRNA的尾部具有非编码区，其 3′端
约 20个核苷酸之前有一个称为 多聚 A位点 的序
列 AAUAAA。
特异性的核酸内切酶识别多聚 (A)位点后，
切除其后面的 20个核苷酸并产生 3′端游离羟基。
在 poly(A)聚合酶的作用下,20～ 250个
腺嘌呤核苷酸被加到 3′端，产生 poly(A)。
pre-mRNA中有编码和不编码
蛋白质的序列相间排列，其中不编码
蛋白质的序列被称为 插入子 ；编码蛋
白质的序列被称为 表达子 。
4,剪接去除插入子
插
入
子
的
切
除
和
表
达
子
的
拼
接
自
参
考
书
2
5,真核生物基因转录的调控
真核生物基因表达的调控作用可能发
生在转录,mRNA修饰和稳定、翻译、
mRNA的转运和降解等各个步骤。
真核细胞中基因表达的调控信号包括
两类：一类是激素和蛋白质分子，另一类
是外环境因素。
二、原核生物基因的转录及其调控
1,细菌的基因转录过程
mRNA不需要加工，转录与翻译同步。
启动子, 在－ 10和－ 35区具有特征性
的序列，被不同的 σ因子所识别。
多顺反子, 功能相关的多个基因往往聚
集成一个操纵子，处于同一个转录单元中。
细菌的转录和翻译同步进行
图片来自参考书 2
2,σ因子参与的转录调控
细菌 RNA聚合酶的核心酶的功能对任何
基因都一样，而 σ因子才是选择转录对象的关
键亚基。
每一种 σ因子识别的启动子在－ 10和－
35区都具有特征性的序列。
－ 10和－ 35区不仅被不同的 σ因子所识
别，而且是决定启动子强度。
例：大肠杆菌
在正常生长条件下，分子量为 70 kDa的
σ70指导 RNA聚合酶的活动；
当细胞需要进行趋化移动时，就产生分子
量为 28 kDa的 σ28启动鞭毛和趋化蛋白的合成；
如果环境温度突然上升，细胞会产生分子
量 32 kDa 的 σ32启动热休克蛋白基因的转录以
保护细胞不受高温伤害，并清除已变性的蛋白。
3,操纵子和转录的正、负调节
在原核细胞中，几个功能相近或相关的结构
基因经常有序地排列在一起，并被转录在同一个
RNA分子上；这种由一个转录控制区和 1至多个结
构基因组成的一个完整的转录单元称为 操纵子 。
有些基因需要在 活化蛋白 结合到 DNA的特定
位点后才能有效表达；由活化蛋白激活或促进基因
转录的调控方法叫做转录的 正调节 。
由 阻遏蛋白 结合到 DNA的特定位点上，对转
录的起始发生阻遏或解阻遏作用，这种调控方法被
称为转录的 负调节 。
例：乳糖操纵子的结构 图 8.6
其中有两个调控基因,
（ 1）阻遏蛋白的结合位点 Oprator，乳糖参与负调节；
（ 2）激活蛋白 CAP的结合位点,cAMP参与 正调节。
参考书 1
衰减作用 是通过衰减子使已经开始的转录提
早终止，从数量上减少完整 mRNA的产生。 图 8.7
4,衰减作用
三、翻译过程中的调控
固定式的调控：包含在 DNA序列之内，如稀有密
码子和重叠基因等，其调控不受环境影响。
非固定式的调控：作用受环境因素的影响，与
DNA 序列无关。
稀有密码子出现频率
基因的重叠排列
SD序列、与起始密码子的间距
mRNA形成的二级结构
反义 RNA的存在
影响翻译速
度的因素
四、调控信号与系统性调控
微生物必须对生存条件的变
化迅速作出反应；必须与其
它个体或群体进行竞争，获
取并有效地利用营养物质。
必须能够产生、感应、传
递信号，同时对多个相关
的操纵子进行系统性调控。
1,葡萄糖效应及其机理
当培养基中同时有葡萄糖、乳糖、阿
拉伯糖、麦芽糖存在时，大肠杆菌首先利用
葡萄糖，直到葡萄糖快要消耗完毕，其它糖
的代谢才能开始，这种由葡萄糖的代谢抑制
其它糖代谢现象称为 代谢抑制 （ catabolite
repression）或 葡萄糖效应 。
代谢抑制机理
细胞大量摄入并代谢葡萄糖,cAMP的含量
随之降低，使受 cAMP正调控的乳糖操纵子、阿
拉伯糖操纵子、麦芽糖操纵子等都不能被激活。
缺乏葡萄糖，或者人为地向培养基中加入
cAMP,细胞中 cAMP的浓度升高，产生的 cAMP-
CAP复合体与 DNA结合，激活代谢乳糖、阿拉伯
糖、麦芽糖的操纵子。
2,严紧反应
细菌在生长过程中如果得不到足够的氨基酸，
细胞内鸟苷四磷酸 (ppGpp)和鸟苷五磷酸 (pppGpp)
的含量迅速上升；与此同时,RNA的合成速率迅
速降低，蛋白质的合成也随之下降，从而细胞处
于低速代谢和缓慢生长状态。当环境中出现足够
的氨基酸时,pppGpp和 ppGpp被迅速降解,RNA
和蛋白质的合成很快恢复。这是在困难时期获得
生存的策略，被称为 严紧反应 （ stringent control）。
3,菌量感应系统
有些细菌具有一种能够感应自身细胞群
体密度并对其作出相应的应答反应的调控系统。
这些细菌在生长过程中释放某种信号分
子，当细胞群体密度达到了一个临界水平时，
信号分子积累到起诱导作用的浓度，从而激活
目标操纵子，这种调控叫做 菌量感应作用
(quorum sensing)。
4,双组分磷酸接力系统
双组分磷酸接力系统又名 双组分信号传导
系统,是一种通过磷酰基团的转移来传导信号，
并控制基因转录的调节系统。
双组分是：传感蛋白激酶、应答调节蛋白。
双组分系统广泛存在于细菌中，也存在于
真核微生物中；高等真核生物也利用 磷酸化 这一
信号传导机制传递信号。
例,枯草杆菌调控芽孢形成的双组分磷酸接力系统
在营养生长阶段，枯草杆菌 RNA聚合酶利用 σA 对与其营养生长有关的基因
进行转录； KinA,B,C,D等对环境信号进行传感反应的蛋白激酶，
在营养细胞中以非磷酸化的形式存在。当这些激酶感应到不适于生长的
信号时发生磷酸化；磷酸化的 KinA等将磷酸基团转移到 SpoOF； SpoOF
将磷酸基团传递给 SpoOB； SpoOB再将磷酸基团传递给 SpoOA。
磷酸化的 SpoOA能与 abrB基因的启动子结合并阻遏 abrB基因的表达,AbrB
是许多基因表达的抑制蛋白；
图 8.8 磷酸化的 SpoOA能够激活 σF,σE 等 Sigma因子的合成。
当细胞内的部分 σA被 σF,σE 取代时，芽孢开始形成，负责芽孢形成后期
基因的转录的 σG和 σK逐渐产生。
第三节 细胞中遗传信息的变异
一、微生物的遗传变异现象
二、基因突变的分子基础
三、基因重组
四、原核生物细胞间的基因转移
五、真核微生物细胞间的基因交换
一、微生物的遗传变异现象
自发突变发生的频率很低, 观察自发性突变
的经典试验是 波动试验 。
自发突变和诱发突变的本质相同：由于理化
因子作用于 DNA,导致遗传性状的变化 。
少数几个细胞的遗传变异能够使微生物群体
完全地改变成新的菌落 。
遗传学中常用的突变株包括营养缺陷型, 抗
药突变型, 温度敏感型等 。
抗 T1噬菌体的大肠杆菌的波动试验 表 8.1
艾姆氏试验的基本方法
缺陷型菌株
营养缺乏型平板
.,,
.,,
,
,
:,¨,,..,,
, ;, ;.,
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,
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.,.
.
,.
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.,
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.,
,
待测试剂
(图 8.10)
正常回复突变
诱变剂诱变
艾姆氏试验已成为测试化学物质诱变作用的标准方法,
其原理是检验待测试剂能否使营养缺陷型菌株的回复突变增加。
二、基因突变的分子基础
DNA分子与其它物质发生反应形成非正常
结构的现象称为 DNA损伤 。
DNA损伤的结果是导致基因突变或者细胞
死亡。
DNA分子自身的活动能够导致碱基错配；
此外,DNA损伤的分子机制都是由已知的或未
知的 理化因素 对 DNA的结构产生了破坏作用。
已知的化学致变剂和物理致变剂
物理致变剂
致变剂 电离辐射、紫外辐射等
化学致变剂 脱氨剂、烷化剂,
大型加合物供体、碱基类似物,
插入剂、交联剂。
常见的致变剂及其致变作用 图 7.11
(a) 亚硝基的脱氨作用； (b) 烷化剂和被甲基化的碱基；
(c) 5-溴脱氧嘧啶与鸟嘌呤配对。
嘧啶碱基受紫外辐射后产生的衍生物
图 7.12
分子的变异 与 信息的变化
三、基因重组
同源重组是 生物中普遍存在的一种基因重组方式，
其特点是可以在任何位置、任何两个具有同源序列的
DNA分子之间发生，需要类似 RecA的蛋白参与。
位点特异性重组 依赖于小范围同源序列的联会，
特点是需要在供体和靶分子中包含特定的 DNA序列，
并且需要特异性的蛋白质因子识别和催化。
转座子 是可在一个 DNA分子内或不同 DNA分子间
移动的 DNA片段。 转座作用 即由转座子介导的 DNA重
排现象，它不需 DNA同源性，无 RecA参与；转座子的
末端带有倒置重复序列，由 转座酶 识别和切割。
大肠杆菌 l噬菌体在特异性位点插入染色体 (a)
和脱离染色体的方式 (b)
位点特异性重组 图 8.14
转座子的插入和靶序列正向重复的产生过程。
转座作用 图 8.15
四、原核生物细胞间的基因转移
在供体细胞和受体细胞直接接触后，质粒
从供体细胞向受体细胞转移的过程叫做 接合作
用 (conjugation)。
转化 (transformation)是指细胞从周围介质
中摄取来自不同基因型细胞的 DNA，使受体的基
因型或表型发生相应变化的过程。
转导 (transduction)是由噬菌体介导的将
DNA片段从供体菌转移到受体菌的过程。
大肠杆菌中的 F质粒及其接合作用 图 8.16
大肠杆菌 l噬菌体介导的转导 图 8.17
(a) 普遍性转导 (b) 特异性转导
五、真核微生物细胞间的基因交换
准性生殖与有性生殖的比较 表 8.2
第四节 微生物的诱变育种
和遗传工程
一、菌株的诱变和筛选
二,DNA重组技术的发展
三、基因工程
四、生物种系的遗传改良
一、菌株的诱变和筛选
物理致变剂
致变剂 e.g,X-rays,g-rays,UV
化学致变剂
e.g,base analogs,nitrous acid,
alkylating,arylating agents
UVL VL
Photolyase
例：紫外线诱变的分子基础
紫外线诱变的操作步骤
青霉素生产菌的诱变育种
菌株 NRRL-B25 的诱变过程
Strain Mutagen Yield (U/ml) Time
NRRL-B25 250 1943
NRRL-X1612 X-rays 500 1943
NRRL-Q176 UV light 850 1945
NRRL-WIS-47-1564 UV light 850 1947
--- --- 50000 1977
对早期生物技术的发展贡献巨大；
适用于途径或基因未得到研究的菌株；
产生的变异程度相对较低；
变异的位点及性质不明；
没有相应的基因就不可能发生新功能。
诱变育种技术的特点
二,DNA重组技术的发展
1,限制性核酸内切酶
2,逆转录酶
3,DNA连接酶
4,DNA聚合酶和聚合酶链式反应
1,限制性核酸内切酶
20世纪 60年代末 Arber 等发现细菌能
够产生识别特定的 DNA序列并对其加以切割
的酶，即限制性核酸内切酶，简称 DNA内切
酶。这个发现标记着 DNA重组技术的诞生。
工具酶识别序列是 4～ 8个核苷酸，这些
位点的显著特点是它们具有双重旋转对称的结
构或称回纹结构,
图 7.18.(a)
限制性核酸内切酶的切割方式
粘性末端, 两条单链上的断裂位置交错且对
称，所产生的两个末端含有单链的互补序列。
平端切割, 两条单链上的断裂位置处在一个
对称结构的中心，裂口处两条单链的长短平等。
XhoI SciI
图 7.8,限制性内切酶切割方式实例 （ b）、（ c）
2,逆转录酶
逆转录酶 是以 RNA为模板合成序列与其
互补的 DNA链。 1970年，科学家发现逆转录
病毒以逆转录酶合成它们 RNA基因组的 DNA
拷贝。
以 5′→3 ′方向合成 DNA,前提条件：
有一段引物、一条模板分子、四种脱氧核糖核
苷酸、镁离子。
3,DNA连接酶
DNA连接酶 是一种能够催化 DNA中相邻
的 3′-OH和 5′-磷酸基团末端之间形成磷酸二
酯键并把两段 DNA拼接起来的一种酶。
1972年,David Jackson等使 DNA
片断的粘性末端退火（即碱基彼此配对），然
后用 DNA连接酶共价连接这些片段；同年内，
他们就发展出基因克隆中所需要的质粒载体与
外源 DNA的连接技术，成功地获得了重组
DNA分子。
4,DNA聚合酶和聚合酶链式反应
DNA聚合酶在有一条 DNA单链为模板和一
段寡核苷酸为引物的条件下，催化与模板互补的
另一条 DNA新链的合成反应。 1985年 Kary
Mullis等用 DNA聚合酶创建了 聚合酶链式反应
(PCR)；用该技术进行特定 DNA片段的体外扩增，
可以在短时间内获得数百万个特异序列的拷贝。
由于 PCR技术对现代生物技术发展的巨大
贡献，发明人获得了诺贝尔奖。
来自极端微生物的
热稳定性 DNA polymerase
如来自 Thermus aquatcus 的 Taq polymerase
95?C，半衰期 > 2 h
使 PCR实现自动化。 上图为 PCR仪，下图为示 PCR循环。
T (?C)
90
70
50
Time (min)
循环 1 循环 2 循环 3 循环
三、基因工程
1,基因工程总体策略
2,目标基因的克隆与鉴定
3,宿主和载体
4,重组蛋白的生产
1,基因工程总体策略（ 1）
基因工程 指用人为的方法将所需要的某一供
体生物的 DNA提取出来，在适当的条件下用适当
的酶切割后，把它与载体 DNA分子连接起来形成
具有自我复制能力的 DNA分子 —— 复制子，并将
它转移到宿主细胞中进行扩增和表达。
基因工程总体策略（ 2）
重组蛋白的生产 品种、菌株改良 遗传基因分析
2,目标基因的克隆与鉴定
蓝 -白选择
活性筛选
放射自显影或生色反应
用 32P标记探针
迪高莘标记探针及 Marker
3,宿主和载体
克隆载体 是一个能复制的 DNA分子，被
用来运载插入的外源基因进入受体细胞。它可
以是质粒、噬菌体、粘粒或人工染色体。
----- L M Prescott et al.,in
MICROBIOLOGY,5th ed,
外源基因由克隆载体携带进入宿主细胞
Vectors carry genes
into host cells
质粒图谱范例
大肠杆菌 K12及其衍生菌株
重组蛋白生产的优势,
a,可以对基因加以改造 ;
b,基因拷贝数大量提高 ;
c,用强启动子进行快速转录 ;
d,基因翻译得到优化 ;
e,可进行主动调节 ;
f,宿主细胞易于培养,
4,重组蛋白的生产
a,基因定位突变技术
YYYYYY
XXXXXX
YYYAAATTT CCCAAAYYY
XXXTTTAAA GGGTTTXXX
Blunting Kination
Ligation PCR
极耐热性木聚糖酶基因的突变效果
DNA
mRNA
Protein
基因组 重组基因
转录
翻译
多
拷
贝
强
转
录
优
化
翻
译
b,c,d,蛋白质合成过程中的优势
? E.coli 中 lac 启动子
? lac & trp 启动子的杂
合体 Ptac
? E,coli 噬菌体 T7启动
子
? E,coli 的 l噬菌体 启
动子 PL phage ? PHsh from E.coli
e,主动调节
E,coli表达体系中的调控模式
PL启动子的表达调控
PL +1 RBS FG Terminator
30℃
40 ℃
mRNA
热激 热敏感性抑制子 cI
T7启动子的表达调控
T7 Promoter
待表达基因
宿主细胞 宿主染色体
质粒
质粒
Plac
T7 RNA
聚合酶基因
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
0 2 4 6 8 10
I n d u c t i on t i m e ( h )
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p H s h - x y n I I c e l l d e n s i t y p J L A - x y n I I c e l l d e n s i t y p E T - x y n I I c e l l d e n s i t y
p H s h - x y n I I a c t i v i t y p J L A - x y n I I a c t i v i t y p E T - x y n I I a c t i v i t y
f,极端酶高效表达
极耐热性木聚糖酶基因的表达
四、生物种系的遗传改良
及疾病的基因治疗和基因药物
1,基因重组微生物
2,通过植物转基因改良品种
3,动物的转基因
4,基因治疗与基因药物
定义,代谢 (途径 )工程
is the use of molecular techniques (or
recombinant DNA techniques) to improve
the efficiency of pathways that synthesize
specific products,
----- L M Prescott et al.,in
MICROBIOLOGY,5th ed
1,基因重组微生物
Zymomonas mobilis
的乙醇发酵途径
Entner-Doudoroff pathway
丙酮酸
乙醛 + CO2
乙醇
丙酮酸脱羧酶
E,coli 的部分代谢途径
EMP途径
乳酸 丙酮酸
甲酸
CO2+H2 乙酰辅酶 A
磷酸转移酶 乙醛脱氢酶
乙酰磷酸 乙醛
乙酸激酶 乙醇脱氢酶
乙酸 乙醇
乳酸脱氢酶
E,coli 的代谢工程
EMP途径
乳酸 丙酮酸 乙醛
甲酸
CO2+H2 乙酰辅酶 A 乙醇
磷酸转移酶 乙醛脱氢酶
乙酰磷酸 乙醛
乙酸激酶 乙醇脱氢酶
乙酸 乙醇
乳酸脱氢酶
乙醇操纵子设计
宿主菌株的选择
基因的整合
表达水平的筛选
条件优化等
外原基因构建途径
利用木质纤维水解液的乙醇发酵菌株
菌株 产量 得率 速率
（ g/l） （ %） （ g/l /h）
Sacharomyces 1400 21.0 98 1.60
Z,mobilis CP4 22.6 88 1.04
E,coli KO11 34.7 80 1.16
代谢工程菌发酵水平比较
2,通过植物转基因改良品种
农杆菌属细菌生活在土壤中，从伤口侵入植
物组织后，将 T-DNA 插入植物的染色体，产生激
素刺激细胞生长，并指导细胞合成细菌所需要的营
养物质。
A,tumefaciens促使细胞过量生长产生大
块细胞团，引起冠瘿病； A,rhizogenes侵染植物
根部导致异常生长，形成, 发根, 。
这两个种是植物遗传工程的重要工具。
T-DNA
整合
分泌
细胞分裂素
植物生长素
植物细胞
核孔
分泌 冠瘿碱
伤害
分泌
乙酰丁香酮
农杆菌
细胞核
Pi-VirA
诱导 vir表达
从 Ti质粒中
切出 T－ DNA
VirD2 VirB
农杆菌和植物的相互作用
用 Ti质粒构建的穿梭载体
3,动物的转基因
最有效方法,
用病毒转染动物或动物胚胎。
主要目的,
? 用动物表达产生人类特定的组织或器官；
? 建立人类疾病治疗的动物模型；
? 昆虫、猪、羊等都能被用来表达人类蛋白。
逆转录蛋白（ retrovirus）
单链 RNA，侵染哺乳动物；
侵染后,RNA逆转录产生双链 DNA；
启动子很强，是基因治疗的理想载体。
杆状病毒（ baculovirus）
是双链 DNA昆虫病毒，粒子杆状，可以被
单独排出胞外，也能在细胞内被包装成多角体，
即：许多杆状粒子被包埋在多角蛋白中。
? 多角蛋白的启动子特别强，可大量表达外源基
因；
? 昆虫体系能完善翻译后的修饰；
? 适用于生产动物蛋白。
4,基因治疗与基因药物
有些疾病的发生是由于染色体中的某一个
基因失常，彻底治愈这类疾病的方法是用正常
基因来替代缺陷基因。将新基因导入人体，对
缺陷基因进行改正或修复，从而对疾病进行治
疗的方法称为 基因治疗 。
基因治疗中通常以 逆转录病毒 为载体，将
新基因直接导入体内的增殖细胞。
反义 RNA作为基因药物
有些疾病是由于某一种蛋白的不正常表达
所引起，如大多数病毒病、癌症、早老性痴呆等
都是由于一些不应有的基因表达所导致的病症。
解决这些问题的有效办法是防止相关基因的转录
和表达。
反义 RNA的碱基序列与 mRNA上翻译起始
区域附近的序列互补，与 mRNA结合后能有效地
阻止核糖体的结合和翻译的启动。
RNA干涉现象
这个现象最早发现于线虫中，其大致
过程是：进入细胞的双链 RNA在细胞质中
被双链 RNA酶切割成 21～ 23个碱基的 短小
干扰 RNA (siRNA)； siRNA随之解旋，所产
生的单链和其它的因子一起形成一种复合
体，叫做 RNA诱导的沉默复合体（ RISC）；
RISC通过 siRNA识别具有互补序列的靶
mRNA并将其切断。
siRNA作为基因药物
siRNA在使用效率和特异性方面优于
反义 RNA。
siRNA的发展非常迅速，已经开始进
入眼病、肝炎等疾病的临床应用。
2005年我国科学家宣布用 siRNA抑制
SARS病毒的试验取得成功。
主要参考书,
1,Madigan,MT,JM Martinko,and J Parker.2003,Brock
Biology of Microbiology,10th ed,Printice Hall,New Jersey,
2,Talaro,KP,2005,Foundations in Microbiology,5th ed,
McGraw-Hill co,& High Education Press,Beijing,
3,Prescott,LM,JP Harley,and DA Klein,2002,Microbiology,
5th ed,McGraw-Hill co,& High Education Press,Beijing,
4,Turner,PC,AG McLennan,AD Bates and MRH White,
1997,Instant Notes in Molecular Biolgy,Bios Scentific
Publishers Limited,2000,
5,Maloy,SR,JE Cronan Jr,and D Freifelder,1994,Microbial
Genetics,2nd ed,Jones and Bartlett Publishers,Boston,
6,陈三凤, 刘德虎, 2003,现代微生物遗传学, 化学工业出
版社, 北京,
7,周德庆,2002,微生物学教程, 高等教育出版社, 北京,
第一节 遗传的物质基础及其特性
第二节 遗传信息的表达
第三节 细胞中遗传信息的变异
第四节 微生物的诱变育种和遗传工程
何谓遗传学？
遗传学 是关于遗传物质的生理生化性质、世代传递
方式，以及所携带的信息在个体发育中的表达的
一门科学。
早期的遗传学研究亲代与子代之间遗传性状的传递，
提出了遗传的染色体理论，对基因进行了作图，
并发现了基因重组现象，故名 传递遗传学 。
近代的遗传学则进一步从分子水平上研究基因的构
成、复制、表达、突变和修复等，被称为 分子遗
传学 。
微生物遗传学
涉及部分真核生物，所有的原核生物，以及病毒
的遗传；
介绍微生物的遗传物质的结构特点、遗传信息的
表达与调控、遗传变异的基本规律；
介绍通过基因操作改变微生物的遗传信息从而有
效地控制或利用微生物的基本策略。
第一节 遗传的物质基础及其特性
一、遗传物质的鉴定
二、脱氧核糖核酸
三、基因组 DNA和染色体
四、染色体以外的遗传因子
经典试验 1,肺炎链球菌的转化试验
图 8,1（ a） S型和 R型细胞侵染试验
一、遗传物质的鉴定
分离后的 S型细胞物质对 R型细胞的转化
图 8.1（ b）
结论
细胞生物的遗传物质是双链 DNA
病毒的乙醇物质可以是单链的或双链
的 DNA或 RNA,即,ssDNA，
dsDNA,ssRNA或 dsRNA。
二、脱氧核糖核酸
1．核酸的化学组成和结构
2,DNA的复制方式
3,DNA的理化性质
1．核酸的化学组成和结构
Watson 和 Crick在 1953年描述了 DNA的结构模型,
DNA分子是由两条相互平行、方向相反的多核
苷酸单链以右手螺旋方向相互缠绕而形成的双螺旋。
脱氧核糖和磷酸构成的主链位于外围，通过氢键
相互交联的碱基处于双螺旋的内部。
腺嘌呤与胸腺嘧啶配对，鸟嘌呤与胞嘧啶配对；
两条单链互补；一条链的碱基序列限定了另一条链的
序列。
Rosalind Franklin 的贡献
Watson and Crick proposed DNA
structure in 1953 by building models
based on chemical and physical data
that had been gathered in other labs,
primarily x-ray diffraction data collected
by Rosalind Franklin et al,
2,DNA的复制方式
细菌 DNA的 q-形复制 真核生物 DNA的复制
10～ 100 mm
复制叉
复
制
叉
复
制
原
点
模板
新生链
DNA的滚环复制模式
图 8,2
切口
5’
5’
3’
3’
3’
模板
新生链
互补链合成
3,DNA的理化性质
DNA的稳定性
在溶液中,DNA具有一定的粘性，易受剪切
力的破坏；易被核酸酶降解；
在强酸中,DNA能被水解成碱基、糖和磷酸；
在特定的稀酸中 (如 pH 3~4)，不同碱基与核糖
之间的糖苷键会发生特异性的断裂，根据这种特
异性可测定 DNA的碱基序列；
在稀碱如 0.2当量 NaOH中，双链 DNA很快变
性产生单链 DNA，继而单链 DNA被进一步破坏。
3,DNA的理化性质（ 2）
DNA的光学性质
DNA中的碱基属于芳香簇化合物，能够
吸收紫外光 (UV)。 DNA吸收峰的光波波长为
260纳米；当浓度为 1 mg/ml时,
dsDNA, A260=20
ssDNA,RNA, A260≌ 25
人们根据 A260测定 DNA的浓度,根据
A260 / A280和估算 DNA的纯度。
3,DNA的理化性质（ 3）
DNA的热变性
双链 DNA在一定的高温下解链 (变性 )产生
单链 DNA。双链 DNA完全解链后，紫外吸收值
A260可以提高 40％，当吸收值的提高达到中点
时的温度称为 解链温度 （ Tm）。
1.4
1.2
1.0
70 80 90
100° C Tm
3,DNA的理化性质（ 4）
复性、退火或杂交
当温度缓慢降低时，序列互补的单链
DNA能够渐渐地重新配对，即 复性 。
不同来源的 DNA之间碱基序列互补的
区段进行的碱基配对称为 退火 或 杂交,这
被广泛应用于 DNA的扩增、定点诱变、基
因鉴别。
3,DNA的理化性质（ 5）
分子特征 与 微生物分类鉴定
DNA中的 G＋ C含量通常通过 Tm值来测定。同
一个属的细菌,G＋ C含量的变化一般小于 10％。
DNA－ DNA杂交技术用于研究亲缘关系近的
微生物。
如果两菌株在最适条件下杂交,DNA相关性
>70%，且 Tm值差别 <5％，它们就被认为同种。
三、基因组 DNA和染色体
基因组 是指一种生物体内单套遗传物质的全
部遗传基因。 染色体 指携带细胞功能所必备的基
因的遗传单元。
病毒 是非细胞生物，它们的全套遗传基因称
为基因组，但不足以形成染色体。
原核生物 的染色体常为一个环状的 DNA分子。
真核生物 的细胞有几条至几十条染色体，各
含一个线状的 DNA分子。
细菌染色体 DNA的大小和结构
(a)大肠杆菌细胞大小和染色体 DNA长度的比较； (b)细菌细胞中的拟核； (c)大肠杆
菌染色体结构电镜图。 宽 1.1~1.5 mm、长 2~6 mm的细胞里包装着的一个 DNA分
子的长度达 1 mm；这个环状的 DNA分子在细胞中形成含有一个染色体的拟核；在染
色体的中心有一个由 DNA结合蛋白和膜组成的骨架,DNA分子附着在骨架上形成
50~100个超螺旋的环，每个环中含碱基对约 50~100 kb，这种多层次折叠使 DNA
处于高度压缩状态,
From figures in referenced book 5,
真核生物细胞中的 DNA中只有不到 5％的 DNA用于所需蛋白质的基因表达，其
余的 DNA起, 结构, 作用或, 调节, 作用。
DNA被紧密地包装在多条染色体中，每条染色体中含有一个线状 DNA分子，它
以左手螺旋方向围着一个个组蛋白八聚体绕圈 1.8周，形成串珠状的染色质，被
串在一起的小颗粒称为核小体，染色质进一步卷曲形成每圈 6个核小体、直径 30
nm的染色质丝，它折叠成许多超螺旋环附着在中央骨架上。
真核生物的染色体结构
From BIOLOGY by Jack C Carey et al.,eds
四、染色体以外的遗传因子
线粒体和叶绿体中含有的 DNA能够自体复制，并
编码执行线粒体和叶绿体功能的蛋白，属于染色体以
外的遗传因子。
质粒 一般指存在于细菌、真菌等微生物细胞中，
独立于染色体以外，能进行自我复制的遗传因子。质
粒的大小为 1～ 1000 kb，常为环状的双链 DNA分子，
也有线状 DNA或 RNA质粒。
有些质粒既能够整合到染色体上，又能以游离状
态存在，并能携带部分染色体基因进行转移，它们被
称为 附加体 。
第二节 遗传信息的表达
一、真核生物基因的转录及其调控
二、原核生物基因的转录及其调控
三、翻译过程中的调控
四、调控信号与系统性调控
主要调控机制的调控模型
图 8.5
一、真核生物的基因转录及其调控
1,真核生物的基因转录
常见启动子 是位于转录起始位点上游 25－ 30
个碱基对的 TATA盒；另一些基因则含有一个与转
录起始位点重叠的起始元件。
RNA聚合酶 Ⅱ 催化合成的是 Pre-RNA，它 必
须经过加工才形成成熟 mRNA。
Pre-RNA的 加工在细胞核中进行，主要加工步
骤,5′端加帽, 3′端加尾, 剪接去除插入子 等。
发生在 pre-mRNA转录的早期，当新生 RNA分子
长度达到 25～ 30核苷酸时，加帽酶使新生转录物的 5′
端第一个核苷酸 (A或 G)g位的磷酸水解，并加上 7-甲基
鸟苷三磷酸。
2,5′端加帽反应和帽子结构
图 8.8帽子结构,5′端第一个核苷酸是 7-甲基鸟苷三磷酸，它以
5′三磷酸酯键与第二个核苷酸的 5′端相连，而不是通常的 3′,5′磷酸二酯键。
甲基
3,3′端的加尾过程
3′端加 poly(A)发生于插入子剪切之前。
Pre-mRNA的尾部具有非编码区，其 3′端
约 20个核苷酸之前有一个称为 多聚 A位点 的序
列 AAUAAA。
特异性的核酸内切酶识别多聚 (A)位点后，
切除其后面的 20个核苷酸并产生 3′端游离羟基。
在 poly(A)聚合酶的作用下,20～ 250个
腺嘌呤核苷酸被加到 3′端，产生 poly(A)。
pre-mRNA中有编码和不编码
蛋白质的序列相间排列，其中不编码
蛋白质的序列被称为 插入子 ；编码蛋
白质的序列被称为 表达子 。
4,剪接去除插入子
插
入
子
的
切
除
和
表
达
子
的
拼
接
自
参
考
书
2
5,真核生物基因转录的调控
真核生物基因表达的调控作用可能发
生在转录,mRNA修饰和稳定、翻译、
mRNA的转运和降解等各个步骤。
真核细胞中基因表达的调控信号包括
两类：一类是激素和蛋白质分子，另一类
是外环境因素。
二、原核生物基因的转录及其调控
1,细菌的基因转录过程
mRNA不需要加工，转录与翻译同步。
启动子, 在－ 10和－ 35区具有特征性
的序列，被不同的 σ因子所识别。
多顺反子, 功能相关的多个基因往往聚
集成一个操纵子，处于同一个转录单元中。
细菌的转录和翻译同步进行
图片来自参考书 2
2,σ因子参与的转录调控
细菌 RNA聚合酶的核心酶的功能对任何
基因都一样，而 σ因子才是选择转录对象的关
键亚基。
每一种 σ因子识别的启动子在－ 10和－
35区都具有特征性的序列。
－ 10和－ 35区不仅被不同的 σ因子所识
别，而且是决定启动子强度。
例：大肠杆菌
在正常生长条件下，分子量为 70 kDa的
σ70指导 RNA聚合酶的活动；
当细胞需要进行趋化移动时，就产生分子
量为 28 kDa的 σ28启动鞭毛和趋化蛋白的合成；
如果环境温度突然上升，细胞会产生分子
量 32 kDa 的 σ32启动热休克蛋白基因的转录以
保护细胞不受高温伤害，并清除已变性的蛋白。
3,操纵子和转录的正、负调节
在原核细胞中，几个功能相近或相关的结构
基因经常有序地排列在一起，并被转录在同一个
RNA分子上；这种由一个转录控制区和 1至多个结
构基因组成的一个完整的转录单元称为 操纵子 。
有些基因需要在 活化蛋白 结合到 DNA的特定
位点后才能有效表达；由活化蛋白激活或促进基因
转录的调控方法叫做转录的 正调节 。
由 阻遏蛋白 结合到 DNA的特定位点上，对转
录的起始发生阻遏或解阻遏作用，这种调控方法被
称为转录的 负调节 。
例：乳糖操纵子的结构 图 8.6
其中有两个调控基因,
（ 1）阻遏蛋白的结合位点 Oprator，乳糖参与负调节；
（ 2）激活蛋白 CAP的结合位点,cAMP参与 正调节。
参考书 1
衰减作用 是通过衰减子使已经开始的转录提
早终止，从数量上减少完整 mRNA的产生。 图 8.7
4,衰减作用
三、翻译过程中的调控
固定式的调控：包含在 DNA序列之内，如稀有密
码子和重叠基因等，其调控不受环境影响。
非固定式的调控：作用受环境因素的影响，与
DNA 序列无关。
稀有密码子出现频率
基因的重叠排列
SD序列、与起始密码子的间距
mRNA形成的二级结构
反义 RNA的存在
影响翻译速
度的因素
四、调控信号与系统性调控
微生物必须对生存条件的变
化迅速作出反应；必须与其
它个体或群体进行竞争，获
取并有效地利用营养物质。
必须能够产生、感应、传
递信号，同时对多个相关
的操纵子进行系统性调控。
1,葡萄糖效应及其机理
当培养基中同时有葡萄糖、乳糖、阿
拉伯糖、麦芽糖存在时，大肠杆菌首先利用
葡萄糖，直到葡萄糖快要消耗完毕，其它糖
的代谢才能开始，这种由葡萄糖的代谢抑制
其它糖代谢现象称为 代谢抑制 （ catabolite
repression）或 葡萄糖效应 。
代谢抑制机理
细胞大量摄入并代谢葡萄糖,cAMP的含量
随之降低，使受 cAMP正调控的乳糖操纵子、阿
拉伯糖操纵子、麦芽糖操纵子等都不能被激活。
缺乏葡萄糖，或者人为地向培养基中加入
cAMP,细胞中 cAMP的浓度升高，产生的 cAMP-
CAP复合体与 DNA结合，激活代谢乳糖、阿拉伯
糖、麦芽糖的操纵子。
2,严紧反应
细菌在生长过程中如果得不到足够的氨基酸，
细胞内鸟苷四磷酸 (ppGpp)和鸟苷五磷酸 (pppGpp)
的含量迅速上升；与此同时,RNA的合成速率迅
速降低，蛋白质的合成也随之下降，从而细胞处
于低速代谢和缓慢生长状态。当环境中出现足够
的氨基酸时,pppGpp和 ppGpp被迅速降解,RNA
和蛋白质的合成很快恢复。这是在困难时期获得
生存的策略，被称为 严紧反应 （ stringent control）。
3,菌量感应系统
有些细菌具有一种能够感应自身细胞群
体密度并对其作出相应的应答反应的调控系统。
这些细菌在生长过程中释放某种信号分
子，当细胞群体密度达到了一个临界水平时，
信号分子积累到起诱导作用的浓度，从而激活
目标操纵子，这种调控叫做 菌量感应作用
(quorum sensing)。
4,双组分磷酸接力系统
双组分磷酸接力系统又名 双组分信号传导
系统,是一种通过磷酰基团的转移来传导信号，
并控制基因转录的调节系统。
双组分是：传感蛋白激酶、应答调节蛋白。
双组分系统广泛存在于细菌中，也存在于
真核微生物中；高等真核生物也利用 磷酸化 这一
信号传导机制传递信号。
例,枯草杆菌调控芽孢形成的双组分磷酸接力系统
在营养生长阶段，枯草杆菌 RNA聚合酶利用 σA 对与其营养生长有关的基因
进行转录； KinA,B,C,D等对环境信号进行传感反应的蛋白激酶，
在营养细胞中以非磷酸化的形式存在。当这些激酶感应到不适于生长的
信号时发生磷酸化；磷酸化的 KinA等将磷酸基团转移到 SpoOF； SpoOF
将磷酸基团传递给 SpoOB； SpoOB再将磷酸基团传递给 SpoOA。
磷酸化的 SpoOA能与 abrB基因的启动子结合并阻遏 abrB基因的表达,AbrB
是许多基因表达的抑制蛋白；
图 8.8 磷酸化的 SpoOA能够激活 σF,σE 等 Sigma因子的合成。
当细胞内的部分 σA被 σF,σE 取代时，芽孢开始形成，负责芽孢形成后期
基因的转录的 σG和 σK逐渐产生。
第三节 细胞中遗传信息的变异
一、微生物的遗传变异现象
二、基因突变的分子基础
三、基因重组
四、原核生物细胞间的基因转移
五、真核微生物细胞间的基因交换
一、微生物的遗传变异现象
自发突变发生的频率很低, 观察自发性突变
的经典试验是 波动试验 。
自发突变和诱发突变的本质相同：由于理化
因子作用于 DNA,导致遗传性状的变化 。
少数几个细胞的遗传变异能够使微生物群体
完全地改变成新的菌落 。
遗传学中常用的突变株包括营养缺陷型, 抗
药突变型, 温度敏感型等 。
抗 T1噬菌体的大肠杆菌的波动试验 表 8.1
艾姆氏试验的基本方法
缺陷型菌株
营养缺乏型平板
.,,
.,,
,
,
:,¨,,..,,
, ;, ;.,
,¨,,
,
:,¨
.,.
.
,.
, ;
, ;
.,
.¨
,,.,,
.,
,
待测试剂
(图 8.10)
正常回复突变
诱变剂诱变
艾姆氏试验已成为测试化学物质诱变作用的标准方法,
其原理是检验待测试剂能否使营养缺陷型菌株的回复突变增加。
二、基因突变的分子基础
DNA分子与其它物质发生反应形成非正常
结构的现象称为 DNA损伤 。
DNA损伤的结果是导致基因突变或者细胞
死亡。
DNA分子自身的活动能够导致碱基错配；
此外,DNA损伤的分子机制都是由已知的或未
知的 理化因素 对 DNA的结构产生了破坏作用。
已知的化学致变剂和物理致变剂
物理致变剂
致变剂 电离辐射、紫外辐射等
化学致变剂 脱氨剂、烷化剂,
大型加合物供体、碱基类似物,
插入剂、交联剂。
常见的致变剂及其致变作用 图 7.11
(a) 亚硝基的脱氨作用； (b) 烷化剂和被甲基化的碱基；
(c) 5-溴脱氧嘧啶与鸟嘌呤配对。
嘧啶碱基受紫外辐射后产生的衍生物
图 7.12
分子的变异 与 信息的变化
三、基因重组
同源重组是 生物中普遍存在的一种基因重组方式，
其特点是可以在任何位置、任何两个具有同源序列的
DNA分子之间发生，需要类似 RecA的蛋白参与。
位点特异性重组 依赖于小范围同源序列的联会，
特点是需要在供体和靶分子中包含特定的 DNA序列，
并且需要特异性的蛋白质因子识别和催化。
转座子 是可在一个 DNA分子内或不同 DNA分子间
移动的 DNA片段。 转座作用 即由转座子介导的 DNA重
排现象，它不需 DNA同源性，无 RecA参与；转座子的
末端带有倒置重复序列，由 转座酶 识别和切割。
大肠杆菌 l噬菌体在特异性位点插入染色体 (a)
和脱离染色体的方式 (b)
位点特异性重组 图 8.14
转座子的插入和靶序列正向重复的产生过程。
转座作用 图 8.15
四、原核生物细胞间的基因转移
在供体细胞和受体细胞直接接触后，质粒
从供体细胞向受体细胞转移的过程叫做 接合作
用 (conjugation)。
转化 (transformation)是指细胞从周围介质
中摄取来自不同基因型细胞的 DNA，使受体的基
因型或表型发生相应变化的过程。
转导 (transduction)是由噬菌体介导的将
DNA片段从供体菌转移到受体菌的过程。
大肠杆菌中的 F质粒及其接合作用 图 8.16
大肠杆菌 l噬菌体介导的转导 图 8.17
(a) 普遍性转导 (b) 特异性转导
五、真核微生物细胞间的基因交换
准性生殖与有性生殖的比较 表 8.2
第四节 微生物的诱变育种
和遗传工程
一、菌株的诱变和筛选
二,DNA重组技术的发展
三、基因工程
四、生物种系的遗传改良
一、菌株的诱变和筛选
物理致变剂
致变剂 e.g,X-rays,g-rays,UV
化学致变剂
e.g,base analogs,nitrous acid,
alkylating,arylating agents
UVL VL
Photolyase
例：紫外线诱变的分子基础
紫外线诱变的操作步骤
青霉素生产菌的诱变育种
菌株 NRRL-B25 的诱变过程
Strain Mutagen Yield (U/ml) Time
NRRL-B25 250 1943
NRRL-X1612 X-rays 500 1943
NRRL-Q176 UV light 850 1945
NRRL-WIS-47-1564 UV light 850 1947
--- --- 50000 1977
对早期生物技术的发展贡献巨大；
适用于途径或基因未得到研究的菌株；
产生的变异程度相对较低；
变异的位点及性质不明；
没有相应的基因就不可能发生新功能。
诱变育种技术的特点
二,DNA重组技术的发展
1,限制性核酸内切酶
2,逆转录酶
3,DNA连接酶
4,DNA聚合酶和聚合酶链式反应
1,限制性核酸内切酶
20世纪 60年代末 Arber 等发现细菌能
够产生识别特定的 DNA序列并对其加以切割
的酶，即限制性核酸内切酶，简称 DNA内切
酶。这个发现标记着 DNA重组技术的诞生。
工具酶识别序列是 4～ 8个核苷酸，这些
位点的显著特点是它们具有双重旋转对称的结
构或称回纹结构,
图 7.18.(a)
限制性核酸内切酶的切割方式
粘性末端, 两条单链上的断裂位置交错且对
称，所产生的两个末端含有单链的互补序列。
平端切割, 两条单链上的断裂位置处在一个
对称结构的中心，裂口处两条单链的长短平等。
XhoI SciI
图 7.8,限制性内切酶切割方式实例 （ b）、（ c）
2,逆转录酶
逆转录酶 是以 RNA为模板合成序列与其
互补的 DNA链。 1970年，科学家发现逆转录
病毒以逆转录酶合成它们 RNA基因组的 DNA
拷贝。
以 5′→3 ′方向合成 DNA,前提条件：
有一段引物、一条模板分子、四种脱氧核糖核
苷酸、镁离子。
3,DNA连接酶
DNA连接酶 是一种能够催化 DNA中相邻
的 3′-OH和 5′-磷酸基团末端之间形成磷酸二
酯键并把两段 DNA拼接起来的一种酶。
1972年,David Jackson等使 DNA
片断的粘性末端退火（即碱基彼此配对），然
后用 DNA连接酶共价连接这些片段；同年内，
他们就发展出基因克隆中所需要的质粒载体与
外源 DNA的连接技术，成功地获得了重组
DNA分子。
4,DNA聚合酶和聚合酶链式反应
DNA聚合酶在有一条 DNA单链为模板和一
段寡核苷酸为引物的条件下，催化与模板互补的
另一条 DNA新链的合成反应。 1985年 Kary
Mullis等用 DNA聚合酶创建了 聚合酶链式反应
(PCR)；用该技术进行特定 DNA片段的体外扩增，
可以在短时间内获得数百万个特异序列的拷贝。
由于 PCR技术对现代生物技术发展的巨大
贡献，发明人获得了诺贝尔奖。
来自极端微生物的
热稳定性 DNA polymerase
如来自 Thermus aquatcus 的 Taq polymerase
95?C，半衰期 > 2 h
使 PCR实现自动化。 上图为 PCR仪，下图为示 PCR循环。
T (?C)
90
70
50
Time (min)
循环 1 循环 2 循环 3 循环
三、基因工程
1,基因工程总体策略
2,目标基因的克隆与鉴定
3,宿主和载体
4,重组蛋白的生产
1,基因工程总体策略（ 1）
基因工程 指用人为的方法将所需要的某一供
体生物的 DNA提取出来，在适当的条件下用适当
的酶切割后，把它与载体 DNA分子连接起来形成
具有自我复制能力的 DNA分子 —— 复制子，并将
它转移到宿主细胞中进行扩增和表达。
基因工程总体策略（ 2）
重组蛋白的生产 品种、菌株改良 遗传基因分析
2,目标基因的克隆与鉴定
蓝 -白选择
活性筛选
放射自显影或生色反应
用 32P标记探针
迪高莘标记探针及 Marker
3,宿主和载体
克隆载体 是一个能复制的 DNA分子，被
用来运载插入的外源基因进入受体细胞。它可
以是质粒、噬菌体、粘粒或人工染色体。
----- L M Prescott et al.,in
MICROBIOLOGY,5th ed,
外源基因由克隆载体携带进入宿主细胞
Vectors carry genes
into host cells
质粒图谱范例
大肠杆菌 K12及其衍生菌株
重组蛋白生产的优势,
a,可以对基因加以改造 ;
b,基因拷贝数大量提高 ;
c,用强启动子进行快速转录 ;
d,基因翻译得到优化 ;
e,可进行主动调节 ;
f,宿主细胞易于培养,
4,重组蛋白的生产
a,基因定位突变技术
YYYYYY
XXXXXX
YYYAAATTT CCCAAAYYY
XXXTTTAAA GGGTTTXXX
Blunting Kination
Ligation PCR
极耐热性木聚糖酶基因的突变效果
DNA
mRNA
Protein
基因组 重组基因
转录
翻译
多
拷
贝
强
转
录
优
化
翻
译
b,c,d,蛋白质合成过程中的优势
? E.coli 中 lac 启动子
? lac & trp 启动子的杂
合体 Ptac
? E,coli 噬菌体 T7启动
子
? E,coli 的 l噬菌体 启
动子 PL phage ? PHsh from E.coli
e,主动调节
E,coli表达体系中的调控模式
PL启动子的表达调控
PL +1 RBS FG Terminator
30℃
40 ℃
mRNA
热激 热敏感性抑制子 cI
T7启动子的表达调控
T7 Promoter
待表达基因
宿主细胞 宿主染色体
质粒
质粒
Plac
T7 RNA
聚合酶基因
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
0 2 4 6 8 10
I n d u c t i on t i m e ( h )
c
e
l
l
d
e
n
s
i
t
y (
O
D
600)
0
100
200
300
400
500
600
xyl
an
as
e
ac
t
i
vi
t
y(
U
/
m
L
)
p H s h - x y n I I c e l l d e n s i t y p J L A - x y n I I c e l l d e n s i t y p E T - x y n I I c e l l d e n s i t y
p H s h - x y n I I a c t i v i t y p J L A - x y n I I a c t i v i t y p E T - x y n I I a c t i v i t y
f,极端酶高效表达
极耐热性木聚糖酶基因的表达
四、生物种系的遗传改良
及疾病的基因治疗和基因药物
1,基因重组微生物
2,通过植物转基因改良品种
3,动物的转基因
4,基因治疗与基因药物
定义,代谢 (途径 )工程
is the use of molecular techniques (or
recombinant DNA techniques) to improve
the efficiency of pathways that synthesize
specific products,
----- L M Prescott et al.,in
MICROBIOLOGY,5th ed
1,基因重组微生物
Zymomonas mobilis
的乙醇发酵途径
Entner-Doudoroff pathway
丙酮酸
乙醛 + CO2
乙醇
丙酮酸脱羧酶
E,coli 的部分代谢途径
EMP途径
乳酸 丙酮酸
甲酸
CO2+H2 乙酰辅酶 A
磷酸转移酶 乙醛脱氢酶
乙酰磷酸 乙醛
乙酸激酶 乙醇脱氢酶
乙酸 乙醇
乳酸脱氢酶
E,coli 的代谢工程
EMP途径
乳酸 丙酮酸 乙醛
甲酸
CO2+H2 乙酰辅酶 A 乙醇
磷酸转移酶 乙醛脱氢酶
乙酰磷酸 乙醛
乙酸激酶 乙醇脱氢酶
乙酸 乙醇
乳酸脱氢酶
乙醇操纵子设计
宿主菌株的选择
基因的整合
表达水平的筛选
条件优化等
外原基因构建途径
利用木质纤维水解液的乙醇发酵菌株
菌株 产量 得率 速率
（ g/l） （ %） （ g/l /h）
Sacharomyces 1400 21.0 98 1.60
Z,mobilis CP4 22.6 88 1.04
E,coli KO11 34.7 80 1.16
代谢工程菌发酵水平比较
2,通过植物转基因改良品种
农杆菌属细菌生活在土壤中，从伤口侵入植
物组织后，将 T-DNA 插入植物的染色体，产生激
素刺激细胞生长，并指导细胞合成细菌所需要的营
养物质。
A,tumefaciens促使细胞过量生长产生大
块细胞团，引起冠瘿病； A,rhizogenes侵染植物
根部导致异常生长，形成, 发根, 。
这两个种是植物遗传工程的重要工具。
T-DNA
整合
分泌
细胞分裂素
植物生长素
植物细胞
核孔
分泌 冠瘿碱
伤害
分泌
乙酰丁香酮
农杆菌
细胞核
Pi-VirA
诱导 vir表达
从 Ti质粒中
切出 T－ DNA
VirD2 VirB
农杆菌和植物的相互作用
用 Ti质粒构建的穿梭载体
3,动物的转基因
最有效方法,
用病毒转染动物或动物胚胎。
主要目的,
? 用动物表达产生人类特定的组织或器官；
? 建立人类疾病治疗的动物模型；
? 昆虫、猪、羊等都能被用来表达人类蛋白。
逆转录蛋白（ retrovirus）
单链 RNA，侵染哺乳动物；
侵染后,RNA逆转录产生双链 DNA；
启动子很强，是基因治疗的理想载体。
杆状病毒（ baculovirus）
是双链 DNA昆虫病毒，粒子杆状，可以被
单独排出胞外，也能在细胞内被包装成多角体，
即：许多杆状粒子被包埋在多角蛋白中。
? 多角蛋白的启动子特别强，可大量表达外源基
因；
? 昆虫体系能完善翻译后的修饰；
? 适用于生产动物蛋白。
4,基因治疗与基因药物
有些疾病的发生是由于染色体中的某一个
基因失常，彻底治愈这类疾病的方法是用正常
基因来替代缺陷基因。将新基因导入人体，对
缺陷基因进行改正或修复，从而对疾病进行治
疗的方法称为 基因治疗 。
基因治疗中通常以 逆转录病毒 为载体，将
新基因直接导入体内的增殖细胞。
反义 RNA作为基因药物
有些疾病是由于某一种蛋白的不正常表达
所引起，如大多数病毒病、癌症、早老性痴呆等
都是由于一些不应有的基因表达所导致的病症。
解决这些问题的有效办法是防止相关基因的转录
和表达。
反义 RNA的碱基序列与 mRNA上翻译起始
区域附近的序列互补，与 mRNA结合后能有效地
阻止核糖体的结合和翻译的启动。
RNA干涉现象
这个现象最早发现于线虫中，其大致
过程是：进入细胞的双链 RNA在细胞质中
被双链 RNA酶切割成 21～ 23个碱基的 短小
干扰 RNA (siRNA)； siRNA随之解旋，所产
生的单链和其它的因子一起形成一种复合
体，叫做 RNA诱导的沉默复合体（ RISC）；
RISC通过 siRNA识别具有互补序列的靶
mRNA并将其切断。
siRNA作为基因药物
siRNA在使用效率和特异性方面优于
反义 RNA。
siRNA的发展非常迅速，已经开始进
入眼病、肝炎等疾病的临床应用。
2005年我国科学家宣布用 siRNA抑制
SARS病毒的试验取得成功。
主要参考书,
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McGraw-Hill co,& High Education Press,Beijing,
3,Prescott,LM,JP Harley,and DA Klein,2002,Microbiology,
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1997,Instant Notes in Molecular Biolgy,Bios Scentific
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