第三章 酶活性的测定及分离纯化 在酶的分离纯化、性质研究以及酶制剂的生产和应用时，都要遇到对酶的活性、纯度及含量进行经常的、大量的测定工作，这是必不可少的指标。酶活性是指酶催化一定化学反应的能力，检查酶的含量及存在，通常是用该酶在一定条件下催化某一特定反应的速度，即酶的活性来表示。 3.1 酶活性单位 酶活性指的是酶制剂催化能力的大小，它既与酶蛋白的浓度有关，又与酶分子的催化能力大小有关。酶活性用单位体积或单位质量酶制剂所含的酶单位来表示，即u/ml或u/mg。 3.1.1 实用单位 不同的酶采用不同的标准。如DNA聚合酶Ⅰ以在特定反应条件下，30分钟内催化10nmol dNTP合成为TCA（三氯乙酸）不溶物所需的酶量；又如T4 DNA连接酶的单位定义为：在20μl反应体积中，16℃，30分钟内，将50%的HindⅢ酶切的λDNA片段重新连接起来所需的酶量。ACC合成酶的单位是：30℃，1小时转化SAM生成1nmol ACC所需的酶量。 3.1.2 国际酶活性单位 1961年，国际酶学会议为酶活性单位规定了一个统一的标准，即在特定的条件下，1分钟转化1μmol底物，或转化1μN底物有关基团所需的酶量为1个单位(u)。这是酶活性的国际单位。 3.1.3 Katal 1972年，国际酶学委员会提出了一个新的酶活单位，叫katal(kat)，katal是一个很大的酶活单位，1 katal是指1秒钟转化1mol底物，或转化1N底物有关基团所需的酶量。1 katal＝6×10u。 3.1.4 转换数 在标准条件下，每摩尔单体酶或每摩尔催化中心在1分钟内转换底物成产物的μmol数，可表示为： 1/Kp称为一个催化循环，单位为分钟。 3.1.5 比活性 酶的纯度往往用比活性来表示，比活性是用同一酶制剂的酶活性除以蛋白质的质量，即单位质量蛋白质所具有的酶活性，常用的单位为u/mg protein。酶制剂的比活性越高说明酶的纯度越高。 但在实际工作中，人们为了工作方便，往往对不同的酶使用不同的酶活单位。 3.2 酶活性测定的主要方法 酶活性的测定应再最适酶反应条件下进行（温度、pH、离子强度、反应时间等），可测定反应物的减少量或产物的生成量。随着反应的进行，底物减少，产物积累，会使得反应速度变慢。因此，必须测定反应的初速度。通常以底物浓度的变化在起始浓度的5%以内的速度为初速度的近似值。酶反应速度可用单位时间内底物的减少量或产物的生成量来表示，而酶反应速度又与酶浓度密切相关。 3.2.1 分光光度法（spectrophotometry） 硝酸还原酶将NO3－ 还原成NO2－，NO2－ 与加入的显色剂对－氨基苯磺酸和α－萘胺反应生成玫瑰红色的偶氮化合物，在520nm处比色可测定产物的生成量。一些脱氢酶以NAD+或NADP+为辅酶，NAD+或NADP+在340nm处光吸收很少，而其还原形式NADH和NADPH在340nm处光吸收较大，因此可以测定340nm处的光吸收变化来检测NADH和NADPH的生成或减少，从而得知脱氢酶的活性。 对于一些底物或产物没有光吸收变化的酶反应，可以偶联一个适当的酶，以原初反应的产物作为偶联酶的底物，而偶联酶的产物可用分光光度法测定。 3.2.2 旋光测定法（polarimetry） 若底物和产物的旋光性不同，可通过测定反应混合物的旋光性（方向和大小）变化来测定酶活性。 3.2.3 荧光法（fluorescence） 氧化态的黄素（flavin）化合物发出强烈的荧光，还原态失去荧光。NAD+ 和NADP+无荧光，而NADH和NADPH有460nm蓝色荧光。荧光法灵敏度高。 3.2.4 同位素测定法（isotope determination） 用放射性同位素标记底物，酶反应后分离产物，测产物的放射性强度。此法灵敏度高，但分离产物较麻烦。若底物或产物中有一种是气体，就易于分离。 3.2.5 电化学方法（electrochemistry） 3.2.5.1 pH测定 对于某些酶促反应过程中会产生H＋或减少H＋的反应来说，用pH单位的pH计测定反应液的pH变化，或为保持pH不变而加入酸或碱，记录一段时间内加入的酸碱量。 3.2.5.2 电位测定 在一些酶促氧化还原反应中，底物和产物具有不同的氧化还原电位，可用由一恒定微电流极化的两个铂电极之间的电位差来测定电位变化 3.2.5.3 电流测定 原理同上，以恒定电压的两个铂电极测电流变化。 3.2.6 化学反应法（chemical reaction） 酶促反应一段时间后，取出一部分反应液，用化学方法分析底物或产物的量。如ACC的测定：加HgCl2终止反应，加NaOCl-NaOH混合液使ACC转化成乙烯，再用气相色谱测乙烯。 3.3 酶的分离纯化 3.3.1 酶分离纯化的一般原则 酶的分离纯化是酶学研究的基础，对于不同的研究内容需要不同纯度的酶制剂。因为酶是蛋白质，所以分离纯化蛋白质的方法也都适用于酶的分离纯化。但酶又有特殊性，利用它们的特殊性还可以设计出特殊的纯化方法。为了进行酶学研究，必须获得适量的酶。首先要选择适当的材料，破碎细胞（酶存在于细胞外则不必破碎细胞）。若酶主要存在于某一细胞器中，应尽量分离出该细胞器。纯化酶的过程中要注意保护酶的活性，每一步骤后都要测量酶活性及蛋白质浓度，算出比活性、收率及纯化倍数。若某一步骤的收率或纯化倍数太低，说明该步骤不合适。酶纯化一般在低温条件下进行（0～4℃），但也有些酶有冷失活现象，如丙酮酸羧化酶在25℃下最稳定，低温下容易失活。有些酶虽然本身耐高温，但只要其没有冷失活现象，也应在低温下操作，这样能抑制蛋白酶对目标酶的破坏作用。各种溶液（抽提液、萃取液、层析用液等）应该用缓冲液，pH应调到使酶最稳定的pH。若需要用到较酸或较碱的pH（如三氯乙酸沉淀），应尽量缩短时间。有机溶剂沉淀时也要尽量缩短时间，尽快除去有机溶剂。各种溶液中还可以加入酶保护剂，常用的酶保护剂有巯基保护剂（巯基乙醇、谷胱甘肽GSH、二硫苏糖醇DTT）、金属离子、EDTA、辅酶等，有时还可加入甘油、牛血清白蛋白、明胶。 用于酶纯化的方法主要有：分级沉淀、柱层析、萃取、制备电泳等。 3.3.2 材料的收集与处理 3.3.2.1 原材料的选择 生物体中酶含量一般很低，应选择含酶量高的材料作为原料。选择适当的物种、器官、组织、细胞，甚至细胞器作为酶的来源，还应注意材料处于适当的发育阶段。必要时还可以采用人工处理（环境条件、试剂处理）来提高酶的含量。材料来源应尽量方便、价廉，动物主要是选择器官和组织（如兔肌、牛心等），植物要选择器官和发育阶段（如黄化幼苗、绿叶等），微生物要选择菌株（还可以通过诱变来提高酶的含量）。 要注意，不同来源的同一种酶，其结构和性质可能会有差异。 3.3.2.2 细胞的破碎 动植物组织少量时可用研钵研磨或匀浆器匀浆，研磨前可用低温预冷或液氮速冻。大量组织可用高速组织捣碎机。将组织制成丙酮粉，具有含水量低，脱脂，比较稳定等优点，往组织匀浆中加入－15～－20℃的冷丙酮，抽滤，再加几次丙酮并抽滤，沉淀部分在室温下放置1小时左右至无丙酮味，然后转移到盛有五氧化二磷的真空干燥器中干燥，干燥后的丙酮粉置于低温冰箱中保存备用。丙酮粉中的脂肪已被除去，可以避免脂质的干扰，并使原来不溶的酶（膜结合酶）溶于水。从丙酮粉中提取酶可往丙酮粉中加抽提液搅拌，过滤或离心即可。 对于微生物细胞的破碎，可采用碱处理、溶菌酶加EDTA处理、渗透冲击、超声波破碎、固体剪切、液体剪切等方法。 3.3.2.3 酶的抽提 在破碎细胞时应加入抽提液。抽提液常由缓冲液、蛋白酶抑制剂（如苯甲磺酰氟PMSF）、EDTA、巯基保护剂、甘油、Mg2＋等组成。若抽提的酶是膜结合酶，抽提液中还应含有非离子型的表面活性剂（Triton x-100、Tween 20、Tween 80等）。 3.3.3 酶的初步纯化 酶的分离纯化是把目标酶与其他杂质分离开，使目标酶的纯度提高。酶的纯度用比活性来衡量，以电泳结果为单带，且进一步纯化不能提高比活性为达到均一。 3.3.3.1 沉淀法 1．盐析法 不同的蛋白质在不同的盐浓度下溶解性不同，在低温下往酶溶液中慢慢加入某种盐，在不同的盐浓度下有不同的蛋白质沉淀出来，离心可获得不同的蛋白质沉淀组分，这叫分级沉淀。常用的盐是硫酸铵，因为它在低温下溶解度高，对大多数酶无毒，价廉，有时对酶还有稳定作用。 2．有机溶剂沉淀 常用来沉淀蛋白质的有机溶剂是乙醇、甲醇、丙酮。不同的蛋白质在不同的有机溶剂浓度下沉淀出来。 3．三氯乙酸沉淀 尽快恢复到中性pH。 4．PEG沉淀 聚乙二醇对蛋白质有保护作用，用PEG分级沉淀纯化效果很好。PEG2000、4000、6000、8000都可以用（平均分子量）。 沉淀法要注意酶溶液的pH、离子强度、蛋白质浓度、温度等条件。沉淀法还能起到浓缩的作用。 对于耐热的酶还可以采用热变性的方法，高温下短时间处理，许多不耐热的蛋白质发生沉淀，离心后耐热的目标酶保留在上清液中。 3.3.3.2 透析与超滤 1．透析 将酶液装进透析袋中，置于适当的缓冲液中，在低温下搅拌，更换几次透析液，可除去酶液中高浓度的盐及一些小分子杂质，也能起到换缓冲液的作用。 在装有酶液的透析袋外加固体Sephadex或PEG吸水，可浓缩酶液。 2．超滤 超滤也是一种既可纯化又可浓缩的技术，他是利用不同孔径的超滤膜，截留下不同分子量的蛋白质，从而使分子量不同的蛋白质分离开，从而达到浓缩和纯化的目的。 超滤的方式有真空吸滤和离心超滤两种。 蛋白质的超滤特性是可变的，这取决于许多因素。Westmacott（1972）研究了大肠杆菌部分纯化的青霉素酶制剂的超滤特性，他使用一种截留分子量30,000的各向异性膜，缓冲液的pH和盐浓度不同，酶的通透量变化在1.6%到55%之间；最高通透量在pH5.1～6.2，接近酶的等电点；在pH8.0时，把缓冲液的浓度从1mmol/L提高到30mmol/L，酶的通透量从1.6%增加到20%；加EDTA也能提高酶的通透量，而尿素有相反的作用。 通过控制影响蛋白质超滤特性的因素，可使纯化倍数得到明显的提高，如经超滤可使大肠杆菌青霉素酶的纯度提高7倍。超滤也可用于快速除去大量的低分子溶质，如从酶液中去掉乙醇或脱盐，这种过程称为析滤。 3.3.4 酶的进一步纯化 3.3.4.1 吸附层析 羟基磷灰石（hydroxyapatite，HA）是最常用于蛋白质分离的一种吸附剂，它是一种白色颗粒，分子式为Ca10(PO4)6(OH)2，它非特异性地吸附蛋白质。羟基磷灰石分离大分子的机理还不完全清楚，一般认为HA的结晶表面外露的Ca2+和PO43－参与大分子的分级分离。酸性和中性的蛋白质与HA上的Ca2+位点结合，高浓度的NaCl、KCl或CaCl2的存在既不影响两者的结合，也不影响洗脱。酸性和中性蛋白质的洗脱一般是用pH约6.8的低浓度磷酸缓冲液（20～120mmol/L）。碱性蛋白质是结合在HA的PO43－基团上，NaCl、KCl或CaCl2的存在会强烈影响吸附和洗脱。一般可用这些盐或浓度为120～230mmol/L的磷酸缓冲液进行洗脱。但也有一些碱性蛋白质用浓度很高的CaCl2也洗不下来。总之，不同的蛋白质洗脱所需的条件不同。一般将酶在低浓度磷酸缓冲液条件下上样，然后用逐渐增加磷酸盐浓度的阶段洗脱或浓度梯度洗脱，从而使各种蛋白质分离。HA柱的再生方法是：500mmol/L磷酸钾缓冲液→100 mmol/L磷酸钾缓冲液→水→起始缓冲液平衡（起始缓冲液为5、10或20 mmol/L磷酸钾缓冲液）。 3.3.4.2 离子交换层析 离子交换剂分为阳离子交换剂和阴离子交换剂两类，阳离子交换剂的衬质上带有阳离子交换基团，常见的阳离子交换基团有-SO3H、-COOH、-CH2COOH（CM）等；阴离子交换剂的衬质上带有阴离子交换基团，常见的阴离子交换基团有-NH3＋Cl－、二乙基胺乙基（DEAE）等。蛋白质分子上具有各种阴阳离子基团，在一定的pH和离子强度下，这些基团可与离子交换剂上的相应基团进行离子交换，使蛋白质分子通过静电引力吸附到离子交换剂上。改变pH和（或）离子强度又可将这些吸附的蛋白质洗脱下来。在一定的上样和洗脱条件下，不同的蛋白质分子所带的净电荷和电荷密度不同，分子大小也不同，它们与离子交换剂的结合力不同，结合力较弱的先洗脱下来，结合力较强的后洗脱下来，从而达到分离的目的。洗脱的方式有单一溶液洗脱、阶段洗脱和浓度梯度洗脱等。可改变洗脱液的pH，也可改变洗脱液的离子强度，或者二者同时改变。在一般情况下，碱性蛋白质（等电点大于pH7.0）在pH小于等电点时带正电荷，被阳离子交换剂吸附；酸性蛋白质（等电点小于pH7.0）在pH大于等电点时带负电荷，被阴离子交换剂吸附。 离子交换剂的衬质（也称载体）常见的有树脂（resin）、纤维素（cellulose）、葡聚糖凝胶（Sephadex）、琼脂糖凝胶（Sepharose）、丙烯酸共聚物（Trisacryl）等。其中离子交换树脂物理性能稳定，蛋白质吸附容量高，装柱时沉降迅速，洗脱时允许高流速，但它的高吸附力用于蛋白质纯化时却往往是缺点，因为蛋白质可能经受不住从树脂上洗脱下来所必需的激烈条件，所以不常用于蛋白质的纯化。离子交换纤维素价格低廉，交换容量较低，一般为离子交换树脂交换容量的，洗脱条件温和，是常用的离子交换剂。离子交换Sephadex凝胶是在Sephadex G-25或Sephadex G-50上引入DEAE或CM基团制备成的。以Sephadex G-50为衬质的离子交换凝胶具有高蛋白容量，但它们较软，而且在缓冲液pH或离子强度改变时会收缩或膨胀，不宜用于柱层析。把DEAE或CM基团引入交联琼脂糖或丙烯酸共聚物可得到离子交换Sepharose和Trisacryl。这两种类型的离子交换剂是由小而均匀的、能确保高流速的珠形颗粒组成，具有高蛋白容量。它们在一般层析压力下不变形，更重要的是它们在离子强度改变时及极端pH下都不会收缩或膨胀，因此可在柱中再生。再生的方法是： 阳离子交换剂 0.5N HCl→0.5N NaOH→0.5N HCl→水→平衡 阴离子交换剂 0.5N NaOH→0.5N HCl→0.5N NaOH→水→平衡 3.3.4.3 凝胶过滤层析 凝胶层析也称凝胶过滤、分子筛层析、排阻层析。凝胶层析的原理可以用3-氯-1,2-环氧丙烷交联的Sephadex凝胶来说明。所用的葡聚糖是由肠膜明串珠菌产生的产物，葡萄糖残基主要以α-1,6-糖苷键联结。交联程度受所用的3-氯-1,2-环氧丙烷含量控制，从而决定了凝胶基质的水合（复得水）程度及凝胶的孔隙度。每单位干重凝胶复得的水越多，其孔隙度也越大，它所能分级分离的分子也越大。葡聚糖／交联剂之比越大，孔隙度也越大，反之孔隙度小。若将一混合物上样到柱的上端，洗脱时，大分子量的分子因不能进入凝胶颗粒内部的孔隙而最先流出，而小分子量的分子因能进入凝胶颗粒内部，延长了行进的路线而后流出。不能进入凝胶颗粒内部的最小分子的分子量称为该凝胶的排阻限度。在能进入凝胶颗粒内部的分子当中，分子量较大的先流出，分子量较小的后流出，这样就能将不同分子量大小的物质分开。将洗脱液分部收集，找出酶活性峰所在的管，即可得到纯化的酶。用洗脱液一直洗即可使柱再生。 凝胶层析过程是溶质分子在流动的溶剂相和多孔胶粒构成的固定相的内部孔隙间进行扩散分配的过程。分配系数Kav可简单地从以下公式得出：Kav＝(Ve－Vo)/(Vt－Vo)，式中Ve＝从柱上洗脱下溶质需溶剂的体积，Vo＝外水体积，Vt＝柱床的总体积。 经验表明，Kav值与分子量的对数成反比。凝胶层析除可用于分离分子量不同的蛋白质分子外，还可用来测定蛋白质分子的分子量。先用若干种已知分子量的蛋白质分别测出其Kav值，以分子量的对数为纵坐标，以Kav值（或简单地以洗脱体积）为横坐标，作出标准曲线，再测出未知分子量蛋白质的Kav值（或洗脱体积），在曲线上可查出其分子量的对数。 Sephadex有不同的型号，如Sephadex G-100，Sephadex G-25等。Sephacryl是交联的烯丙基葡聚糖和N,N＇－甲叉双丙烯酰胺共聚物，如Sephacryl S-100, S-200, S-300, S-400, S-500, S-1000等，后面的数字越大则孔隙度越大。 近年来，除了上述Sephadex和Sephacryl外，还有许多种材料用作凝胶层析的基质，如聚丙烯酰胺（Bio Gel P系列）、琼脂糖（Sepharose 2B，4B，6B和Bio Gel A系列）、交联琼脂糖（Sepharose CL-2B，CL-4B，CL-6B）、聚苯乙烯、琼脂糖—聚丙烯酰胺混合物、多孔玻璃和聚甲基丙烯酸甲酯等。（同样是数字越大孔隙度越大）。一般来说，新产品的性能比老产品好。 3.3.4.4 疏水层析： Shaltiel等人在1972年发现溴化氰活化的琼脂糖凝胶被碳链长短不同的烃类衍生物取代后，可选择性地吸附某些酶。进一步的研究表明，这种选择性的吸附作用是琼脂糖凝胶介质与酶之间的疏水力作用的结果。酶分子的表面既有亲水性的基团或区域，也有非极性的疏水基团(如亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸)或区域。疏水基团或区域可在酶分子的表面，也可处于亲水区域包围之中，形成疏水性的小孔或袋。在一定的条件下，琼脂糖凝胶上的疏水基团可以和酶分子表面或孔袋中的疏水基团发生疏水相互作用，使酶分子吸附到凝胶上。用能减弱疏水相互作用的洗脱液洗脱，就能把疏水相互作用强弱不等的物质依次洗脱下来。用尿素或乙醇、丁醇洗即可再生。 目前常用的三种疏水层析介质是Butyl-Sepharose CL-4B、Phenyl-Sepharose CL-4B和Octyl-Sepharose CL-4B。三者中，Butyl-Sepharose CL-4B的疏水作用力最弱，Octyl-Sepharose CL-4B的疏水作用力最强。一般在不了解目标酶的疏水性能时，先试用疏水作用力较小的介质。疏水作用对于温度的影响是十分敏感的，温度高时疏水作用力增加，反之则减少。溶质的性质也可影响疏水作用力，引起盐析作用的物质如NaCl、NaSO等可增加疏水作用力，而引起盐溶作用的物质如盐酸胍、硫氰化钾、氯化四乙铵、尿素等则使疏水作用力减少。不同离子对疏水相互作用的影响见下表： 表 2.1 不同离子对疏水相互作用的影响 盐析效应增强 ← 盐溶效应增强 → 阳离子 NH＋ ， Rb＋ ， K＋ ， Na＋ ， Cs＋ ， L＋ ， Mg2＋ ， Ca2＋ ， Ba2＋ 阴离子 PO43－ ，SO42－ ，CH2COO－，Cl－，Br－，NO－ ，ClO－ ，I－ ，SCN－ 酶液在高盐浓度（如含有1～3 mol／L (NH4)2 SO4的缓冲液）时上样，然后用降低盐浓度的缓冲液、水或非极性溶剂如乙二醇等洗脱。疏水层析有三个优点：a. 由于在高盐浓度时吸附，硫酸铵沉淀后的样品不用脱盐可直接上样；b. 洗脱条件温和，酶活回收率高；c. 洗脱液盐浓度低，便于和后续纯化步骤相衔接。 3.3.4.5 亲和层析： 1．原理 上述分离方法都是利用不同蛋白质分子的理化性质不同而将它们分离的，对每一种方法来说，都有若干种分子因其在该方面的理化性质相近而无法分开，但多种方法结合使用，可得到较纯的产品。亲和层析是利用蛋白质分子的生物特异性进行分离，因不同分子的生物特异性差别较大，所以分离效率高。酶与底物、酶与辅酶、酶与抑制剂、激素与受体、抗原与抗体之间都有特异的结合能力，将一方（称其为配基）偶联到载体上，即可特异性地与对应的另一方结合。 亲和层析的设计原理和过程可大致分为三步。一是选择合适的配基与不溶性的载体偶联，形成具有特异亲和性的分离介质；二是在适当的条件下，亲和介质选择性地吸附酶或其它生物活性分子，杂质与介质间没有亲和作用，故不能吸附而被洗涤去除；三是选择适当的条件使被吸附在亲和介质上的酶或其它生物活性分子洗脱下柱。 2．载体（衬质） 载体应具有以下基本特性： a. 与蛋白质的反应弱，以避免非专一性吸附。 b. 偶联上配基后应具有良好的溶剂流速。 c. 含有可修饰的化学基团，偶联上配基后载体的结构不受破坏。 d. 可修饰的化学基团含量丰富，偶联后具有高吸附容量。 e. 在偶联和洗脱的各种条件下，机械和化学性质稳定。 f. 具有疏松的孔和亲水的网络结构，可使大分子自由通过，最好是球形、大小均匀、刚性的。 珠粒状的琼脂糖凝胶（Sepharose）是在亲和层析中应用最广的载体。交联琼脂糖凝胶（Sepharose CL-4B）较其母体有更佳的理化稳定性，若在使用时需要更为激烈的条件，可考虑选用交联琼脂糖凝胶作为载体。但是，交联会导致供偶联配基的位点减少，吸附容量也会相应减少。 3．配基 配基选择是否合适是关系到亲和层析成败的决定因素。可以作为配基的物质很多，可为较小的有机分子，也可为天然的生物活性分子。根据配基的性质，可将其分为两大类： a. 特异配基（special ligand） 一般说来，酶和专一性抑制剂、抗原和抗体、激素和受体中的一方均为特异配基。以此类配基构成的亲和层析介质的选择特异性最高，分离效果也最好。缺点是此类配基多系不稳定的生物活性物质，在偶联时活性损失大，价格昂贵，成本高。 b. 通用配基（general ligand） 以此类配基制备的亲和层析介质可用于一类物质的分离。如用NADH作配基可以吸附脱氢酶类，用ATP作配基可以吸附激酶类，用外源凝集素作配基可以吸附糖蛋白类。用通用配基制成的亲和层析介质的选择性低于用特异配基制成的亲和层析介质，但前者的应用范围较广，其中不少已有商品供应，故应用方便，价格也略较后者便宜。 理想的配基在溶液中与酶结合后的解离常数应为10-8 ～10-4 mol /L。当解离常数大于10-4 mol /L时亲和性太低，不能有效地吸附酶，如酶与某些弱抑制剂之间的亲和性即属此情况。反之，当解离常数低于10-8 mol /L时亲和性太强，导致洗脱十分困难，如激素与受体间的亲和性即属这种情况。另外，配基的结构中应有多个功能基团，以保证在与载体偶联后不影响它和酶特异性结合的部位。 4．手臂 用小分子配基直接偶联到载体上制备亲和层析介质时，尽管配基和酶之间的亲和力在适当的范围内，但其吸附容量往往很低。这是因为酶的活性中心常常深陷在内部，由于载体的空间障碍影响，配基与酶的活性中心无法接近。为改变这种情况，可在载体与配基之间插入一个手臂（一段链状结构）以消除空间障碍，此手臂不可太短也不可太长，太短不能起到消除空间障碍的作用，太长则往往使非特异性的作用如疏水作用增加。 5．偶联方法： 最常用的偶联方法是溴化氰法。在碱性条件下使溴化氰与多糖载体上的两个相邻羟基反应，产生少量不活泼的氨基甲酸衍生物和大量活化的亚氨碳酸酯衍生物，亚氨碳酸酯基团再与被偶联分子上的氨基反应，产生三种结合产物，其中异脲型为主要产物。 溴化氰是剧毒物质，实验室操作时要特别小心。现已有溴化氰活化的Sepharose CL-4B供应。 不同基团之间的化学连接方法后面将有介绍。 3.3.4.6 染料配基层析 自70年代起，人们陆续发现单氯、二氯三嗪类活性染料如Cibacron Blue F3G-A可以和一系列生物活性物质起作用，此作用类似于生物活性物质与其天然配基间的作用。实际上这些染料与生物活性物质之间并不存在任何生物学关系，因此称它们为假配基（pseudo-ligand）或染料配基（dye-ligand），由此发展起来的层析技术称为假亲和层析（pseudo affinity chromatography）或染料配基层析（dye-ligand chromatography）。 染料配基层析的优点是： a. 作为配基的染料是化学合成的，来源方便，价格也便宜。 b. 由于染料结构中有活性氯存在，故载体不需活化即可直接与染料配基偶联，操作较简单。 c. 染料配基层析介质与生物活性物质间的结合力较强，吸附容量较大。 d. 分离效果较好，收率一般也较高。 由于染料配基层析有上述优点，发展十分迅速。应用染料配基层析可提纯脱氢酶类、水解酶类、乙酰基转移酶类、激酶类、磷酸核糖转移酶类、转氨酶类、磷酸化酶类、磷酸二酯酶类、脱羧酶类、合成酶类及人血清白蛋白、血凝因子、血清脂蛋白等，可见它的应用是十分广泛的。另一方面由于染料配基层析有较好的分离效果，应用该技术纯化的最终产品的质量可望符合各方面的要求，特别是医药和基因操作技术的要求。因此，染料配基层析是一种新型的、有广泛用途的分离提纯技术。目前市场上有多种规格的染料配基层析介质供应。 染料配基的化学结构和性质不仅关系到它与载体偶联的能力，而且还直接影响它与生物活性物质的作用。常用的染料配基有以Cibacron Blue F3G-A为代表的蒽醌类活性染料及以Procion Red H3-B为代表的萘类活性染料（图2.3）。这两类染料中均有三嗪环的结构，环上的氯十分活跃，可十分容易地与载体上的羟基或氨基发生亲核反应（nucleophilic reaction），因此染料配基与载体的偶联反应是在十分温和的碱性条件下进行的。  当酶或其它生物活性物质被染料配基层析介质吸附时，它们之间的作用可能有三种情况。a. 完全是特异性的亲和作用；b. 特异性的作用与非特异性的作用（如静电吸引、离子交换等）综合作用的结果；c. 完全是非特异性的作用。Cibacron Blue F3G-A对于大多数与NAD＋和NADP＋有关的脱氢酶类及与ATP有关的激酶类的特异性结合作用是染料配基层析中的一种特殊现象。染料结构中的蒽醌部分被认为是某些生物活性物质相应的核苷酸部分的竞争性抑制剂，即类似于腺嘌呤部位的结构。 酶吸附和洗脱的条件与缓冲液的种类、离子强度、pH、金属离子、特异配基等有关，应通过试验找出最佳的吸附和洗脱条件，以获得最高的纯化倍数和收率。在具体应用时应注意以下几个方面： a. pH：在应用染料配基层析时，系统中的pH极为重要，因为染料配基与酶之间除特异性的亲和作用外，还有非特异性的离子交换作用。在pH低于大多数酶的等电点时，非特异性的吸附增加。如在pH5.0时96％的血浆蛋白被Blue A凝胶吸附，而在pH9.0时仅白蛋白和脂蛋白被吸附。有时降低pH可增加染料—酶复合物的结合力和稳定性（表2.2），有时降低pH可使洗脱解析加快。实际应用中应根据具体情况选择合适的pH。 表2.2 pH对鼠肌肉丙酮酸激酶与Procion Red HE3B-Sepharose结合力的影响 pH 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0  每毫升凝胶结合丙酮酸激酶的活性 （单位） 44.2 23.1 19.7 6.7 0.4   b. 金属离子：少量的二价阳离子，尤其是Mg2+，可明显地影响染料配基与某些酶的结合力。如应用Matrex gel Red A 柱层析纯化兔肌丙酮酸激酶、酵母己糖激酶、磷酸甘油激酶或兔肌激酶时，若缓冲液中含有10mmol/L MgCl2，除兔肌激酶外其它三种酶与介质间的结合力明显增加。其它的二价阳离子如Ca2+、Mn2+ 等及某些一价阳离子如K+、Na+ 等也有类似的作用。故可用金属离子调节和改变染料配基层析的选择性。在洗脱时若由于金属离子的存在而吸附过强时，可在洗脱液中加入低浓度的EDTA消除此影响。 c. 洗脱条件：可用含适当浓度氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化铵、硫酸铵、甘油、乙二醇、尿素、硫氰酸钠或Triton X-100的缓冲液进行非特异性的洗脱，也可用含有底物、辅酶，或另外一些特异性的可溶性配基如NAD(P)+、NAD(P)H、ATP、ADP、CoA、FMN、Blue A、Red A等作特异性的洗脱。特异性洗脱可使染料配基层析的分离效果进一步提高。 3.3.4.7 双水相抽提 以往通常用离心或过滤的方法使酶从发酵液或菌体匀浆液中分离。但在中试或扩大生产时，或因要求相当大容量的高速冷冻离心机（离心力＞10,000g），或因粘稠而又微细的物质堵塞滤器而致失败。70年代初发展起来的双水相抽提技术不仅在一定程度上可解决此棘手问题，且可使酶与多糖、核酸等可溶性杂质分离，具有一定的提纯效果，有相当的实用价值。 1．原理 抽提在制药、化工等行业是一种普遍应用和行之有效的分离提纯技术。这种抽提的相系统多系有机溶剂组成，由于大多数酶在有机溶剂中不仅溶解性能差，而且易变性失活，因此未能广泛地用于酶的抽提。早在1896年Beijerinck就发现了亲水性聚合物（hydrophi-lic polymer）水溶液的不相溶性（incompatibility），今日的双水相抽提技术即基于此。当水溶液中含有一种或一种以上的亲水性聚合物时，若聚合物的浓度达到一定的阈值以上，就会形成不相混溶的、可分离的两相，这两相都是水溶液。亲水性聚合物对多数的酶有稳定作用，因此为酶提供了一个易溶而又不易破坏的抽提环境。细胞碎片、多糖、酯、核酸以及酶的性质不同，在两相中分配的情况也不相同，在多数情况下酶可与这些杂质迅速而有效地分离。 原则上多数的（但不是所有的）亲水性的天然或合成的聚合物水溶液在一定的条件下相混均可形成分离的双水相，如聚乙二醇（polyethylene glycol）与右旋糖酐（dextran），或聚乙二醇与磷酸钾盐水溶液相混时均可形成分离的双水相。相的组成及其形成分离相时聚合物的浓度间的关系可用相图表示。 双水相抽提的相图是一条双曲线，在双曲线的上方溶液可形成分离的两相，在下方则为均相。T点对应的坐标表示上相的组成，B点对应的坐标表示下相的组成。T1、T2、T3 ……及B1、B2、B3 ……称为节点，连接节点的直线称为节线，在同一节线上任何一点的上相及下相的组成相同，但相体积是不同的。C为临界点，在C点上相和下相的组成和体积都相同，加入极少量的水即可导致分离的两相转变成均相。当体系的总组成为P点时，体系分为两相，上相组成为T1，下相组成为B1。当P点在T1B1节线上移动时，上下两相的组成不变，但二者的体积发生变化。 相图是选择形成分离两相时所含多聚物或盐的量的依据。有些相图可从资料中查得，也可通过试验获得所需的相图。除多聚物或盐的浓度可影响双相的形成外，多聚物的分子量、温度、放置时间及体系中存在的低分子物质等均可影响双相的形成。 我们将单位体积上相中酶的活性与单位体积下相中酶的活性之比K称为分配系数：K= CT／CB，式中CT为单位体积上相中酶的活性，CB为单位体积下相中酶的活性。多聚物或磷酸盐的量、pH值、离子强度及被抽提物的量均可影响分配系数。蛋白质的分配系数通常在0.1～10之间。分配系数的大小及上下相体积之比与分离效果有关，分配系数远大于1且上相体积较大时分离效果较好，收率较高。收率可按下式计算： ，  Ionic Strength  式中YT和YB分别表示酶在上相和下相中的收率，VT和VB分别为上相和下相的体积。 2．应用特点 常用的双水相抽提系统有两种类型。第一类相系统由聚乙二醇和右旋糖酐组成，形成两相后上相为聚乙二醇富相（PEG-rich phase），下相为右旋糖酐富相（dextran-rich phase）。第二类相系统由聚乙二醇和盐（常用的为磷酸钾或硫酸铵）组成，上相仍为聚乙二醇富相，下相为盐富相。无论哪种类型，各相均含有70％以上的水分，故为酶的溶解与抽提提供了适宜的环境。 所需设备比较简单，仅需一个可使粗提液与两相系统充分混合及放置的贮罐和低速离心机或使两相迅速分离的分离器。 操作方便，条件温和。在双水相抽提中，由于聚乙二醇、右旋糖酐这类多聚物可作为酶活性的稳定剂，即使在常温下操作酶活性也不易损失。若相系统选择合适，收率一般可在80～90％。此法不仅能使酶和细胞碎片、多糖、酯、核酸等杂质迅速分开，而且有一定的提纯效果，提纯倍数可为2～20倍。 由于双水相抽提技术有上述特点，因此应用发展很快，文献报道的已有二三十种微生物来源的酶应用此技术进行纯化。国内应用成功的例子也不少，如上海医药工业研究院生化室不仅应用双水相抽提技术分离微生物来源的甘油激酶，而且还在分离动物脏器组织来源的α－磷酸甘油脱氢酶及心肌黄酶的研究中取得了成功。 双水相抽提技术在开始时仅用于粗提液的处理，现已发展到用于后处理工艺的精制阶段，即经几次连续的双水相抽提使产品获得相当高的纯度。如由保依地尼假丝酵母发酵产生的甲酸脱氢酶经四次连续抽提得到总收率为70％，纯度大于70％的产品。此产品的质量符合NADH辅酶再生酶膜反应器用酶的需要，同时由于工艺简单，原材料成本低，产品价格大幅度地降低。 3.3.4.8 电泳法 蛋白质分子在一定pH的溶液中带有一定的净正电荷或净负电荷，在电场中分别向负极和正极方向移动。电泳分为自由界面电泳、凝胶电泳、等电聚焦、双向电泳等。 1．自由界面电泳 不用支持物，带电分子在自由溶液中移动，混合物中的不同组分电泳后分布在对应的运动区域内。此法分离效果好，常用来研究混合物的组成成分，但一般不用来分离蛋白质。 2．凝胶电泳 有支持物，如淀粉、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、琼脂等。用于分析、小量纯化和纯度鉴定。SDS-PAGE（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis）还可以用来测定蛋白质的分子量。 有SDS，无SDS，均匀胶，梯度胶。 3．等电聚焦 在凝胶中加两性电解质（ampholine，也叫ampholyte），一般为pH3.5～10。现在发展出immobiline drystrip。 4．双向电泳 第一向等电聚焦，第二向SDS-PAGE或Native-PAGE。可分辨出5000多个点。 按电泳槽分，有圆盘电泳，垂直板电泳，水平槽电泳，毛细管电泳等。 对电泳结果可用电脑软件分析，既可定性又可定量。 3.3.4.9 冰冻干燥 在一密闭容器中对结冰的酶液抽真空，可使水分升华并抽走，达到浓缩或干燥的目的。冰冻干燥的产品使用时加入溶剂（缓冲液）后能迅速溶解。在冰冻干燥前酶液一般应先脱盐，否则会因形成低共熔混合物，导致干燥不完全、大量发泡和蛋白质变性。 3.3.4.10 结晶法 把酶提纯到一定纯度后（通常认为应达到50%以上），可以使其结晶。虽然结晶的酶不一定能成为均一的证据，但伴随结晶的形成，酶的纯度经常有一定程度的提高。从上述意义讲，酶的结晶既是酶提纯的结果，也是纯化酶的手段。此外，为研究蛋白质空间结构提高x射线衍射样品，也是酶结晶的重要目标之一。 蛋白质分子多数处于含水的环境中，蛋白质分子与水分子结合形成稳定的水合物。当蛋白质的浓度非常高的时候，溶液中就没有足够的水能够与蛋白质形成水合物，在蛋白质分子之间也没有足够的水分子可以把它们充分隔开，于是蛋白质就以无定形沉淀或结晶的形式从溶液中析出。 形成无定形沉淀的原因在于局部能量降到最低，致使分子凝聚过程发生过快之故。当然在能障不大的情况下，从无定形沉淀可以慢慢长成晶体。一般来讲，应当非常小心而缓慢地使蛋白质溶液达到过饱和点，此时蛋白质分子不能被充分水合，但蛋白质分子有充分的机会将其自身有序地排列到晶格中，从而形成满意的蛋白质结晶。 许多能引起蛋白质溶解度改变的方法都可用于酶的结晶。已知蛋白质的溶解度受电解质的性质和浓度、pH及温度等因素的广泛影响。作为结晶的条件，这些环境因素都应予以充分考虑。 1．有机溶剂结晶法 有些有机溶剂能引起蛋白质形成结晶，常用的有机溶剂有甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇、丙酮、乙腈、2-甲基—2,4-戊二醇、1,3-丙二醇、2,5-已二醇、α-丁内酯、二甲亚砜、二噁烷等。其结晶原理可以从以下两个方面理解：①当有机溶剂加到蛋白质水溶液中以后，与水结合，从蛋白质分子周围“夺走”大量水分子，这样就大大降低了这个系统充分溶解这些大分子的能力。②当把有机溶剂加到蛋白质的水溶液中之后，明显降低了溶剂的介电常数，致使蛋白质分子失去了赖以维持溶液稳定性的静电保护层。 2．盐析法 盐析法广泛应用于酶的结晶。其原理是在适当pH、温度等条件下，保持酶的稳定，缓慢改变盐浓度，使酶溶液达到过饱和点，析出结晶。盐析法结晶时使用的盐有硫酸铵、硫酸钠、乙酸铵、硫酸镁、氯化钙、硝酸铵、甲酸钠等。其中最常用的是硫酸铵。 利用硫酸铵盐析法进行结晶时，可以采用两种方法，一是将硫酸铵或其浓溶液加到酶液中，至酶液微呈浑浊，然后在低温下放置，析出酶结晶。另一种方法是采用抽提的方法，先将酶蛋白用100%饱和度的硫酸铵溶液沉淀下来，再在0℃用逐步降低浓度的硫酸铵溶液抽提，然后在4℃冰箱和7℃室温中交替放置结晶。这是利用酶蛋白在同一硫酸铵饱和度下，在低温时酶蛋白的溶解度高，逐步升高温度时酶蛋白溶解度降低的性质，使之析出结晶。 3.3.5 提纯方法的选择和顺序 价格（成本）低廉的先用，效率高的先用，利用不同的性质差别（尽量不重复利用同一性质），稀释的步骤和浓缩的步骤交替进行，注意对样品中盐浓度的浓稀要求，减少脱盐步骤。 3.3.6 纯度标准 电泳单带，柱层析单峰，N-末端和C-末端氨基酸检测单一，继续纯化比活性不增加。要有三种以上方法证明均一才能认为是均一。 用于不同的研究需要不同纯度的酶制剂，不都要求均一。 3.3.7 酶贮存中的稳定性 干燥的酶在4℃下很稳定。酶溶液中可加甘油、DTT、BSA等保护剂。有最适保存pH（与最适反应pH可以不同）。蛋白质浓度大较稳定。避免反复冻融。