第四章 酶的结构和功能 4.1 酶的活性中心 4.1.1 酶的活性中心和必需基团的概念 在酶蛋白中，只有少数特异的氨基酸残基与催化活性直接相关。这些特异的氨基酸残基可以在肽链的一级结构上相距较远，但通过肽链的折叠、盘旋，使它们在空间上接近，形成活性中心（或称活性部位）。组成活性中心的氨基酸残基有些执行结合底物的任务，有些执行催化反应的任务。我们把组成活性中心的氨基酸残基的侧链基团及一些维持整个酶分子构象所必需的侧链基团称为必需基团。 1960年，Koshland将酶分子中的氨基酸残基或其侧链基团分成4类：接触残基（直接与底物接触，参与结合或催化的残基；右图中的R1、R2、R6、R8、R9、R163、R164、R165），辅助残基（对接触残基的功能起辅助作用的残基，也位于活性中心；右图中的R4），结构残基（维持构象的残基，此为活性中心以外的必需基团；右图中的R10、R162、R169），非贡献残基（或称非必需残基，非必需只是对酶发挥活性而言，它们可能有其他作用，如识别自身物质、运输、防止降解等；右图中的R3、R5、R7）。 4.1.2 酶活性中心的拓扑学 酶的活性中心可以设想为一个口袋或是一条沟槽，形状与底物相近。不同的酶的口袋适合不同的底物。口袋中有相应的结合残基与底物上的某些基团结合，发生反应的底物上的键与催化基团靠近。亲水基团与亲水残基亲合，疏水基团与疏水残基亲合，带电荷的基团与带相反电荷的残基亲合。 例如羧肽酶A催化多肽链上羧基端氨基酸的水解。当末端氨基酸是含有较大疏水基团的氨基酸时（苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸），反应速度很快。但是当有这些较大疏水基团的氨基酸残基进入亚位点3～6时，就会减低酶对这些底物的亲和力。说明羧肽酶A对底物的识别和结合有多个位点。同时，苯丙氨酸是羧肽酶A的竞争性抑制剂。 4.2 酶活性中心化学基团的鉴定 常用的方法有化学修饰法、反应动力学法和x-光晶体衍射法。  4.2.1化学修饰法 酶分子中有许多氨基酸残基的侧链基团可以被化学修饰，如羟基、巯基、咪唑基、氨基、羧基等。如果一个基团是必需的，则被修饰后酶活性会大大下降，甚至完全失活。 4.2.1.1 使用非特异性试剂对特殊基团的标记 非特异性试剂可以修饰特定的某种基团，但不能区分活性中心内部和外部的基团。如果某种基团只存在于活性中心，而其他部位没有，就可以用非特异性试剂修饰。如木瓜蛋白酶（papain）分子中有7个半胱氨酸残基，其中的6个形成3对二硫键，只有一个以自由巯基的形式存在于活性中心（Cys22-63，Cys56-95，Cys153-200，自由Cys25；编号从N端开始往C端进行）。在这种情况下就可以用任何一种硫氢基试剂来修饰，如用碘乙酸修饰。碘乙酸对木瓜蛋白酶的活性中心无任何特殊亲和力，但由于这种特殊情况，仍然得到了巯基的修饰与酶活性的丧失相平行的结果。 另外，通过动力学实验证实，还有一个组氨酸残基的咪唑基位于木瓜蛋白酶活性中心的催化部位（木瓜蛋白酶共有212个氨基酸，有His81和His159两个His）。Husain和Lowe用1,3-二溴丙酮修饰木瓜蛋白酶，在pH5.6，1克当量的试剂完全抑制了木瓜蛋白酶的活性。对修饰后的酶进行氨基酸分析，发现少一个组氨酸。在用1,3-二溴丙酮（2-14C）的修饰实验中，发现修饰剂连接了Cys-25和His-159两个残基，因此知道了这两个基团之间的距离在5以内。这个结论通过x-光衍射分析法又进一步得到了肯定。 由于酶活性部位微环境的影响，活性中心的基团对某一非特异性试剂的反应性可能会比活性中心以外的基团的反应性高或低。如3-磷酸甘油醛脱氢酶的活性中心的Ser能优先地被14C-碘乙酸标记；牛胰核糖核酸酶活性中心的His能优先地被碘乙酸标记，其Lys-41的ε－NH2可优先地被氟二硝基苯标记。也有些酶活性中心的基团对某种非特异性试剂的反应性很低。 要充分利用高反应性的情况。 4.2.1.2 差示标记法 这种方法是非特异性试剂标记法的一个发展。它利用竞争性抑制剂或底物预先占据活性中心，使非特异性试剂只修饰活性中心以外的基团，然后透析除去保护剂（即竞争性抑制剂和底物），再用同位素标记的非特异性试剂修饰活性中心的基团。经氨基酸分析可知哪些基团位于活性中心。 胰蛋白酶催化碱性氨基酸的羧基形成的肽键水解。人们认为在胰蛋白酶的活性中心必有酸性基团存在。ψ胰蛋白酶（Lys6-Ile7之间断裂成为β胰蛋白酶；Lys6-Ile7和Lys131-Ser132两处断裂成为α胰蛋白酶；Lys6-Ile7、Lys131-Ser132和Lys176-Asp177三处断裂成为ψ胰蛋白酶）失去了水解碱性氨基酸的羧基形成的肽键的能力，而保留了一般的酯酶活性，估计Asp177的β－COOH可能与结合底物有关（与底物中的碱性氨基酸结合）。Eyl和Inagami的实验证明了上述 推测。他们用苯甲脒（benzamidine，C6H5C(=NH)NH2）作为β胰蛋白酶的竞争性抑制剂，以1-乙基-3-二甲氨丙基碳二亚胺为缩合剂（1-ethyl-3-dimethylaminopropyl carbodiimide，C2H5-N=C=N-(CH2)3-N(CH3)2），以甘氨酰胺（glycine amide）为修饰剂，以差示标记法证明了Asp177是结合底物的一个基团。酶的羧基与甘氨酰胺以酰胺键结合后几乎完全抑制了酶水解N-α-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯（N-α-benzoyl-L-arginine ethyl ester）的能力。 有时加了保护剂后使有些活性中心外的可修饰基团不能被修饰，也有时不能完全阻止对活性中心基团的修饰，这是差示标记法的缺点。 4.2.1.3 亲和标记 A．Ks型亲和标记 亲和标记是以带有高反应性基团的底物类似物与酶的活性中心结合，然后高反应性基团与酶活性中心的基团反应，形成共价结合，这称为Ks型亲和标记。如胰凝乳蛋白酶用TPCK亲和标记，胰蛋白酶用TLCK亲和标记。再如磷酸丙糖异构酶的底物是，亲和标记物为。 B．Kcat型亲和标记 Kcat型修饰剂的专一性不仅取决于修饰剂与酶结合的亲和力，而且取决于它作为酶的底物的有效性。这种修饰剂具有潜在的化学反应基团，当它被酶作用后转变成有高度化学反应性能的基团，与酶的活性中心共价结合，因此这类化合物又称为“自杀底物（suicide substrate）”。如3,5/4,6-环己烯四醇B环氧化物具有与葡萄糖吡喃环相似的结构，它对糖苷酶有很高的亲和力，分子内潜在的化学活性基团——环氧环在酶的催化作用下，发生类似底物质子化的变化而受到活化，变成对酶有高度反应活性的基团，能专一地不可逆地作用不同来源的β－葡萄糖苷酶。 C．光亲和标记 一个在无光时稳定的化合物可逆地结合到酶的活性中心，照光后受光解激活，产生高反应性基团，与酶的活性中心共价结合。常见的试剂是光解时给出高度易反应的碳烯的重氮化合物或硝烯的叠氮化合物。 在植物生理学中，用氚偶氮—IAA作光亲和标记试剂，经紫外光照射后，从番茄茎细胞质膜上分离出了IAA受体蛋白。 表、某些常用的修饰剂 氨基酸残基 修 饰 剂  Cys 汞制剂，如对氯汞苯甲酸；二硫化物，如5,5＇－二硫二（2-硝基苯甲酸）；碘乙酰胺  Lys 2,4,6-三硝基苯磺酸；磷酸吡哆醛（±还原试剂如NaBH4）  His 二乙基焦碳酸盐；光氧化  Arg 苯乙二醛；2,3-丁二酮  Tyr 四硝基甲烷；N-乙酰咪唑  Trp 碘；N-溴代丁二酰亚胺  Asp, Glu 水溶性碳二亚胺＋亲核试剂如Gly甲酯  鉴别化学修饰剂是否已经引入酶的活性中心，有下列两个标准： a．酶活性的丧失程度与修饰的程度成正比。 b．底物或可逆抑制剂可保护共价修饰剂的抑制作用。 对化学修饰实验得出的结论应非常慎重，因为可能被修饰的基团位于活性中心以外的附近，由于空间位阻使得底物无法进入活性中心，从而表现出酶失去活性。活性中心往往有多个与底物结合的基团，修饰其中的一个往往不能使酶失去活性，可能导致结合力减弱，也可能改变被结合底物的专一性。被修饰的氨基酸残基的位号可通过肽链的部分消化分析得到。 4.2.2 动力学分析法 动力学分析法是利用改变酶反应介质的pH，观察其对酶催化能力的影响。酶蛋白分子中含有许多可解离的基团，pH改变必然会影响这些基团的解离状态。当活性中心的必需基团的解离状态发生变化时，会直接影响到酶的催化能力。因此，通过pH～酶催化活性关系的研究，可能得到与催化直接相关的某些基团的pK值，进而推断这些基团的种类。 pK值的测定以后再述。 各基团的pK值有一理论值，但由于微环境的影响，实测的pK值往往与理论值有偏差，导致分析基团种类的困难，这时需要用其他方法辅助分析，如测该基团的解离热函△H，或加有机溶剂，改变溶液的电导率，作pH依存关系实验，从pK的变化来协助推断基团种类。 表、各种氨基酸残基的pK值与解离热函△H 氨基酸残基 pK值 △H（J/mol）  α－羧基 3.0 ~ 3.2 ±6,276  β－羧基（天冬氨酸） 3.0 ~ 4.2 ±6,276  γ－羧基（谷氨酸） ~ 4.4 ±6,276  酚羟基（酪氨酸） 9.8 ~ 10.4 ±25,104  SH基（半胱氨酸） 8.3 ~ 8.6 —  咪唑基（组氨酸） 5.6 ~ 7.0 28,870 ~ 31,380  α－氨基 7.6 ~ 8.4 41,840 ~ 54,392  α－氨基（胱氨酸） 6.5 ~ 8.5 —  ε－氨基（赖氨酸） 9.4 ~ 10.6 41,840 ~ 50,208  胍基（精氨酸） 11.6 ~ 12.6 50,208 ~ 54,392   4.2.3 x-光衍射分析法 通过多种方法相互印证，可得出正确的结论。 4.3 组成酶活性中心的重要化学基团 酶活性中心有7种氨基酸残基参加的频率最高，它们是Ser、His、Cys、Tyr、Asp、Glu、Lys。 同一类酶往往含有相同的活性中心基团。如胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶活性中心含有丝氨酸残基，称为丝氨酸蛋白酶；胃蛋白酶和木瓜蛋白酶活性中心含有半胱氨酸残基，称为半胱氨酸蛋白酶。在脱氢酶活性中心往往含有酪氨酸残基。这些知识可以为未知活性中心基团的酶的研究提供线索。 同位素标记活性中心基团后，用蛋白酶部分水解，得到同位素标记的肽段，分析其氨基酸顺序，可以了解活性中心附近的氨基酸顺序。 实验表明，同类酶不仅有相同的活性中心基团，而且附近的氨基酸顺序也很相似。 表、一些丝氨酸蛋白酶活性中心丝氨酸附近的肽链组成 酶 活性中心附近的氨基酸顺序  胰蛋白酶（牛） …Asp-Ser-Cys-Gln-Gly-Asp-*Ser-Gly-Gly-Pro-Val-Val-Cys-Ser-Gly-Lys…  胰凝乳蛋白酶（牛） …Ser-Ser-Cys-Met-Gly-Asp-*Ser-Gly-Gly-Pro-Leu-Val-Cys-Lys-Lys-Asn…  弹性蛋白酶（猪） …Ser-Gly-Cys-Gln-Gly-Asp-*Ser-Gly-Gly-Pro-Leu-His-Cys-Leu-Val-Asn…  凝血酶（牛） …Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-*Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-Met-Lys-Ser-Pro…  蛋白酶（S. griseus） ………Thr-Cys-Glu-Gly-Asp-*Ser-Gly-Gly-Pro-Met-Phe……  *表示有催化活性的丝氨酸残基 表、一些半胱氨酸蛋白酶活性中心的半胱氨酸残基附近的氨基酸顺序 酶 活性中心附近的氨基酸顺序  木瓜蛋白酶 …Pro-Val-Lys-Asn-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Ser-*Cys-Trp…  无花果蛋白酶 …Pro-Ile-Arg-Gln-Glu-Gly-Gln-Cys-Gly-Ser-*Cys-Trp…  菠萝蛋白酶 …Asn-Gln-Asp-Pro-Cys-Gly-Ala-*Cys-Trp…  *表示有催化活性的半胱氨酸残基 4.4 酶促化学修饰和酶活性调节 前述化学修饰是人工所为，本节介绍的是天然过程。 有些酶刚合成时是以酶原的形式存在，需要经过一个酶原激活过程；还有些酶需要经过共价修饰才能激活。 4.4.1 酶原的激活 4.4.1.1 酶原 生物体内大多数酶当它们自发地（有些在分子伴侣的指导协助下）折叠成特定的三维结构时，即获得了全部酶活力。也有一些酶刚合成出来是没有活性的前体，称为酶原。当酶原在特定的（体内）位置被水解断裂一个和一些肽键，就成为了有活性的酶。如人的胃肠道中有许多蛋白酶，包括胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、羧肽酶和弹性蛋白酶等，它们在细胞内刚合成时，是酶原形式，当分泌到胃肠道中后，受到胃肠道中蛋白酶的作用，肽键断裂，转变成活性酶。这样可以避免这些酶对分泌器官的破坏。 4.4.1.2 酶原激活的机制 表、一些蛋白酶的酶原及其性质 来源 酶 酶作用最适pH 酶原名称 激 活 因 素 结 果  胃 胃蛋白酶 2 胃蛋白酶原 H＋或胃蛋白酶 胃蛋白酶＋6个多肽碎片   凝乳酶 4 尚未知   胰 胰蛋白酶 7 胰蛋白酶原 肠激酶或胰蛋白酶 中性pH 胰蛋白酶＋1个六肽   胰凝乳蛋白酶 8 胰凝乳蛋白酶原 胰蛋白酶 胰凝乳蛋白酶＋2个二肽   羧肽酶 7.5 羧肽酶原 胰蛋白酶 羧肽酶＋几种碎片   弹性蛋白酶  弹性蛋白酶原 胰蛋白酶 弹性蛋白酶＋几种碎片  血液 凝血酶  凝血酶原 凝血因子和Ca2 凝血酶＋肽段   纤维蛋白溶酶 7.5 ~ 8.6 纤维蛋白溶酶原 致活剂 纤维蛋白溶酶  其他组织 组织蛋白酶A 5 尚未知   4.4.2 共价修饰调节 共价修饰调节中最重要的也是最主要的是磷酸化/脱磷酸化。 4.4.2.1 通过磷酸化/脱磷酸而修饰调节的酶 表、一些可受磷酸化/脱磷酸调节的酶 以磷酸化形式为活性型的酶 以脱磷酸形式为活性型的酶  糖原磷酸化酶 糖原合成酶  糖原磷酸化酶b激酶 丙酮酸激酶（L型）  果糖-1,6-二磷酸酯酶（肝） 磷酸果糖激酶（2型）  胆固醇酯酶 丙酮酸脱氢酶  HMG CoA还原酶激酶 HMG CoA还原酶  激素敏感性脂肪酶 乙酰CoA羧化酶（不同磷酸化位点作用不同）  乙酰CoA羧化酶* 脂肪酸合成酶（不肯定）  苯丙氨酸羟化酶 支链α－酮酸脱氢酶  cAMP磷酸二酯酶（受胰岛素激活）   4.4.2.2 蛋白激酶 使蛋白质磷酸化的酶称为蛋白激酶（protein kinase，PK），PK已发现了很多种，一般分为三大类：①底物专一的蛋白激酶，如磷酸化酶激酶、丙酮酸脱氢酶激酶等；②依赖于环核苷酸的蛋白激酶，如cAMP依赖性蛋白激酶（A激酶）、cGMP依赖性蛋白激酶（G激酶）；③其他蛋白激酶，如组蛋白激酶等。PK所催化的反应如下： A．A激酶 A激酶由两个催化亚基（C）和两个调节亚基（R）组成，调节亚基实际上是催化亚基的抑制剂，当有cAMP存在时，cAMP与R亚基结合，使两个C亚基游离出来而激活。 A激酶是体内最重要的蛋白激酶，它催化很多酶以及非酶蛋白的磷酸化反应。 B．G激酶 G激酶由两个亚基组成，其激活方式与A激酶不同，2分子cGMP与酶结合后就形成活性形式。 E2＋2 cGMP E2·2cGMP G激酶的反应速度仅为A激酶的百分之几，故在体内可能不起重要作用。但这两种蛋白激酶在体内的分布不同，A激酶在胞浆多，G激酶在细胞核及质膜较多。 4.4.2.3 磷酸化部位 一般一个亚基上只有一个磷酸化部位，磷酸化部位大多是Ser的羟基，少数是Thr或Tyr的羟基。 磷酸化的酶可被磷蛋白磷酸酶作用脱去磷酸。 共价修饰在酶活性的调节上（同时也在代谢途径的调节上）有重要的意义，如糖原降解（受肾上腺素和胰高血糖素激活）和糖原合成（受胰岛素激活）。共价修饰调节酶活性有3个特点：①快速；②耗能少；③有级联放大作用。 4.5 酶的空间结构与功能的关系 4.5.1 酶的二、三级结构与功能的关系 酶的二、三级结构靠二硫键（disulfide bonds, or bridge）、氢键（hydrogen bonds）、盐键（salt bonds）、疏水力（hydrophobic bonds）、范德华力（Van der Waals forces，取向力，诱导力，色散力）等维持。（covalent bonds，noncovalent bonds）。蛋白质的一级结构决定其高级结构，即一级结构包含了构成其高级结构的全部信息。然而，这个原则仅仅给出了蛋白质折叠的热力学可能性，而折叠过程和折叠途径仍然是个谜。近年来，大量的实验及理论研究表明，生物体内蛋白质的准确折叠和组装过程需要某些被称为分子伴侣（molecular chaperone）的辅助蛋白参与。分子伴侣是进化上十分保守的一些蛋白质家族，广泛存在于各种生物体内，其主要作用是与新生肽或部分折叠的蛋白质结合，加速其折叠或组装成天然构象的进程。分子伴侣的这种作用没有专一性，它可以辅助许多蛋白质的折叠，它的主要作用方式是与没有折叠或部分折叠的蛋白质的疏水表面结合，诱发正确的构象，并防止其相互聚集或错误折叠。 酶活性中心的各基团在空间构象上的相对位置对酶表现活力是至关重要的，而这个相对位置是由二、三级结构决定的，若二、三级结构受到破坏，这个相对位置也会发生变化，使酶失活。 有实验表明，只要酶活性中心各基团维持正确的相对位置，即使一级结构有轻微变化，也不影响酶活性。有人用枯草杆菌蛋白酶（subtilisin）处理RNA酶，使Ala20和Ser21之间的肽键水解，成为N端20肽的S肽和C端104肽的S蛋白，S肽中含有原活性中心的His12，S蛋白中含有原活性中心的His119。这两者单独存在时均无活性，当在pH7.0的介质中S肽和S蛋白1：1混合时，酶活性可以恢复。 用8M尿素和过量的巯基乙醇处理Rnase，可使Rnase的4个二硫键打开，并破坏氢键，使RNase成为杂乱无章的变性多肽链，完全失去活性。当用透析法除去巯基乙醇和尿素后，酶会缓慢地重新折叠成具有催化活性的天然构象，SH基也会受空气中的氧所氧化，恢复正确的二硫键，从而恢复酶活性。如果保留尿素而除去巯基乙醇，再使巯基氧化，然后除去尿素，则酶活性只有原天然酶的1%。这是因为有尿素时，酶的变性肽链形成二硫键是随机的，8个巯基形成4个二硫键共有105种组合方式（），其中只有1种是正确的（天然的），其他104种都是错误的，所以酶活性只能恢复到1%。将这种酶加上微量的巯基乙醇，可使SH基重新组合而缓慢地（约需10小时）恢复成天然活性的酶蛋白。 实验表明，只要氨基酸的一级结构不变，当变性条件除去后，酶蛋白能自动地恢复到其热力学上最稳定的构象。 4.5.2 酶的四级结构与功能的关系 酶的四级结构是指若干个亚基组成全酶，也叫寡聚酶。亚基之间有疏水力、氢键、盐键等非共价键结合。组成全酶的亚基有同种亚基，也有异种亚基。具有四级结构的酶受到聚合和解聚对活性的调节。 对于含异种亚基的寡聚酶来说，具有一套不同结构和功能的亚基的最小单位，称为原体（protomer）或单聚体（monomer）。有些由异种亚基组成的寡聚酶只含一个原体，该原体即为活性形式；有些由异种亚基组成的寡聚酶含有多个原体。当它解聚成原体时，酶失去活性。如小鸡肝乙酰CoA羧化酶由8～12个原体组成，解聚后失去活性。有些受别构调节的酶由催化亚基和调节亚基组成，当催化亚基和调节亚基解聚时，催化亚基仍有活性，只是不受调节，如大肠杆菌天冬氨酸转氨甲酰酶和A激酶。 由同种亚基组成的寡聚酶，每个亚基上就包括催化部位和调节部位。大部分此种酶聚合时有活性，解聚时失活。谷氨酸脱氢酶例外，当它成为Y型时（六聚体）有催化谷氨酸脱氢的活性；而转变成X型时（六聚体）有催化丙氨酸脱氢的活性，且X型能聚合成无活性的棒状多聚体。 4.6 酶催化作用的机制 4.6.1 酶催化机制的研究方法 A．研究与酶促反应有关的非酶催化反应； B．推理或建立一种理论，或一种假说； C．研究酶活性中心的结构，酶——底物复合物，以及酶反应的性质和动力学。 根据目前的研究结果，已提出了多种催化机制类型，即①反应物的接近效应和定向效应；②共价催化作用；③酸碱催化作用；④由诱导契合和底物应变引起的催化作用。 4.6.2 反应物的接近效应（proximity）和定向效应（orientation） 酶的底物结合部位对底物有亲和力。两种反应物在溶液中自由反应时要依赖随机碰撞，在酶促反应中，两种反应物与酶活性中心的结合起到了增大碰撞几率的作用。 反应物不仅与酶活性中心结合，而且结合的方式是特异的，使得两个反应物的反应基团或反应涉及的键在空间位置上接近，这是定向效应。由于接近效应和定向效应，使得酶催化反应与分子内催化作用相似。 设有两种反应物A和B，其反应为 另设这两个组分在同一分子中，其反应为 假设在上述两种情况下，A对B的固有反应性 是一样的，则一级反应速度常数K1比二级反应速度常数K2要大，K1/K2通常约为5～50。其原因是分子内催化已有接近效应和定向效应，分子间催化只能靠随机碰撞，碰撞的几率随反应物浓度的增加而增大。 例如含有咪唑和对硝基苯酯两种基团的化合物分子内催化水解反应与咪唑和对硝基苯酯的分子间催化水解反应相比时，其K1/K2为23.9。 实际上有许多K1/K2达到103～108，这是定向效应在起作用。 4.6.3 共价催化作用（covalent catalysis） 共价催化指的是在酶催化反应过程中，有共价键连接的酶——底物中间复合体形成。某些中间复合体已经分离出来并进行了鉴定。中间体形成后可进一步变化而形成产物，并且这种经过中间体的反应速度与观察到的酶反应总速度向符合。 共价催化作用可分为亲核催化作用和亲电催化作用两大类。 4.6.3.1 亲核催化作用（nucleophilic catalysis） 有些化合物，其原子团具有给出电子的强烈趋势，称为亲核物质。凡是一个被催化的反应需要从催化剂取得一个电子才能进行时，称为亲核催化作用。 在酶活性中心的基团中，羟基、巯基、咪唑基和氨基都有提供电子的能力，它们可以发挥亲核催化作用，在一些酰基转移反应、磷酸转移反应及其它一些需要亲核催化的反应中起作用。 A．酰基转移 咪唑催化对－硝基苯乙酸酯水解的反应时，就属于亲核催化作用。在酶促反应中，组氨酸残基的咪唑基可以起类似的作用。咪唑的pKa＝7，组氨酸残基咪唑基的pKa＝6，在生理pH下是一个碱性基团，具有较高的亲核性。 其他可能作为亲核催化基团的有天冬氨酸残基上的β－COO－、赖氨酸残基上未质子化的ε－NH2，以及酪氨酸残基上的酚羟基。 B．磷酸基转移 磷酸基转移的催化机理与酰基转移类似，形成磷酰化的共价中间物。葡萄糖磷酸变位酶、碱性磷酸酶、琥珀酸硫激酶等在催化过程中形成磷酰化的酶。 C．涉及Schiff碱的催化作用 亲核催化形成酶——底物共价中间体的另一种类型是形成Schiff碱。苯胺催化吡哆醛和氨基脲形成缩氨基脲的反应就是一例。  在酶促反应中，乙酰乙酸脱羧酶催化乙酰乙酸脱羧产生丙酮酸的反应与上例类似。Schiff碱的生成增加了底物的反应性和不稳定性，其中带正电荷的氮原子向羧基的羰基碳吸引电子（亲电催化）加速了脱羧作用的进行。生成Schiff碱的氨基往往是Lys的ε－NH2。 以磷酸吡哆醛为辅酶的酶反应都是通过形成Schiff碱进行的，如转氨酶、醛缩酶等。 4.6.3.2 亲电催化作用（electrophilic catalysis） 有些化合物，其原子团具有接受电子的强烈趋势，称为亲电物质。凡是一个被催化的反应需要向催化剂给出电子才能进行时，称为亲电催化作用。 在酶活性中心的基团中，质子化的氨基有吸引电子的能力，它们可以发挥亲电催化作用，如醛缩酶催化的反应。 在有些情况下，亲电物质不是酶活性中心的氨基酸残基，而是酶中非蛋白的辅助因子。硫胺素焦磷酸是一种辅酶，它与底物共价结合，而且能稳定一个负电荷。氮原子上的正电荷通过静电稳定作用，促进了C-2的离子化，离子化的碳是一种有效的亲核基团。这个氮原子的正电荷也能稳定与硫胺素焦磷酸共价结合的过渡态底物上的负电荷。含有硫胺素焦磷酸的转酮糖酶在催化木酮糖5-磷酸和核糖5-磷酸反应生成景天庚酮糖7-磷酸和甘油醛3-磷酸时，就发生了这种亲电催化作用。  4.6.4 酸碱催化作用（acid-base catalysis） 由质子转移剂所致的催化作用为酸碱催化作用，由催化剂向反应物提供质子为酸催化，由催化剂从反应物夺取质子为碱催化。酸碱催化机制是十分常见的一种催化机制。 酸碱催化作用分为两类，即专一酸碱（specific acid-base）催化和广义酸碱（general acid-base）催化。专一酸（碱）催化的反应速度只取决于反应溶液中H+（OH－）的浓度，而与其他广义酸（碱）的浓度无关。 如果反应速度除了与H+（OH－）的浓度有关外，还与广义酸（碱）（根据Bronsted酸碱质子理论，能给出质子的物质为酸，能接受质子的物质为碱）的浓度有关，则为广义酸碱催化。 在很多酶的活性中心存在有酸性或碱性基团，它们能在近中性的pH条件下，作为质子供体或质子受体参与广义酸碱催化作用。 4.6.4.1 Bronsted催化作用定律 在一个具有多种酸和多种碱的体系中，表观速度常数kobs等于：  式中k0为无酸碱催化时的反应速度常数，HA和B为广义酸碱。酸碱越强，作为催化剂效率越高，其k值越大。 如果将一个反应中催化速度常数的对数对相应催化基团的pKa值作图，一般可得到线性关系，这就是Bronsted关系式：   式中的α和β称为Bronsted系数，其值在0～1之间，当α或β的值接近1时，说明反应对酸或碱的强度很灵敏。当α或β的值约等于1时，实际上是专一的酸碱催化；当α或β的值接近0时，则反应速度与酸碱几乎无关。 4.6.4.2 广义酸碱催化作用的机制 广义酸碱催化与专一酸碱催化的区别是：广义酸碱催化是在形成底物过渡态时发生质子转移，专一酸碱催化是在形成底物过渡态之前就发生了质子转移。 下面以可逆地把水加到Schiff碱上去的四种可能途径来描述专一酸碱催化作用和广义酸碱催化作用的区别。  4.6.4.3 协调的广义酸碱催化作用 许多反应涉及到多个质子的转移，酶活性中心的多个基团可以参与这种多个质子转移，这就是协调的广义酸碱催化作用，从而大大加快反应的速度。 以非酶催化的四甲基葡萄糖在苯中的变旋反应可以说明这个问题： ①当酚或吡啶单独催化时，反应速度慢得几乎测不出来； ②当酚或吡啶共同催化时，反应速度很慢； ③当用2-羟基吡啶作催化剂时（即酸和碱存在与同一分子内），尽管其酸性基团的酸性和碱性基团的碱性分别比酚和吡啶弱，但2-羟基吡啶在0.05mol/L浓度时，比同浓度的酚和吡啶混合物的催化效率大50倍；在0.001mol/L时，则大7000倍。酶的活性中心的多个酸碱基团类似2-羟基吡啶这种协调的广义酸碱催化作用。 4.6.5 诱导契合（induced-fit）和底物应变（distortion）引起的催化作用 酶活性中心与底物诱导契合后，底物的构象也会发生某些变化，分子内产生“应力”，使得容易形成过渡态，从而加快反应速度。 另外酶的结合部位一般认为是疏水的，也就是一个低介电常数区，使得其中酶与底物间的离子对和偶极效应更强，降低了反应的活化能。这称为“电子畸变”。 在酶催化反应时，上述几种机理可以综合起作用。 4.7 羧肽酶A（carboxypeptidase A）催化作用的机制 4.7.1 羧肽酶A的结构 羧肽酶A是胰腺分泌的一种消化酶，它催化多肽链C末端为芳香族氨基酸或脂肪族氨基酸形成的末端肽键。羧肽酶A是由307个氨基酸组成的一条单链酶，大小约50×42×38的一个椭球体分子表面有一个沟槽，还含有一个Zn2+，Zn2+与His69、His156、Glu72及1分子水配位结合。在Zn2+附近还有一非极性的袋状结构以容纳肽链C末端氨基酸的侧链基团。 4.7.2 羧肽酶A与底物的结合 人工合成的底物——甘氨酰酪氨酸被羧肽酶A作用较慢，故选来研究该酶作用的机制。 ①底物的末端羧基以离子键与Arg145的胍基结合； ②底物的酪氨酸的疏水侧链进入酶的非极性口袋，并至少挤出口袋中的4个水分子； ③被裂解的肽键的NH与Tyr248的酚羟基之间形成H键； ④被裂解肽键的羰基氧取代水分子与Zn2+形成配位键； ⑤底物的末端NH2基通过一个水分子与Glu270的侧链羧基形成氢键，此键在天然底物时不存在。 4.7.3 诱导契合和电子应变在催化中的作用 底物与酶结合后，通过x-光衍射测定，活性中心的几个基团发生了位移，其中Arg145的胍基和Glu270的羧基都移动了2，而Tyr248的酚羟基转动了120°，位移了12。各催化基团都接近了被裂解的肽键。 催化的机理提出了两种： A．Tyr248的酚羟基供给被裂解肽键的NH一个质子（酸催化）；Zn2+吸引被裂解肽键羰基氧上的电子，造成Glu270的无质子羧基对羰基碳亲核攻击，使肽键断裂，Glu270与甘氨酸形成酸酐，然后水解，酶恢复原状。Zn2+周围的非极性环境增大了对敏感肽键的诱导，使诱导偶极矩增大，造成电子应力，使羰基碳更易受亲核攻击。 B．Tyr248的酚羟基供给被裂解肽键的NH一个质子（酸催化）；Zn2+吸引被裂解肽键羰基氧上的电子，造成Glu270激活一个水分子，产生的OH－直接攻击羰基碳，使肽键水解。