第九章 固定化生物催化剂 9.1 酶的固定化方法概述： 酶催化剂可以分为几种主要类型，包括游离酶、游离细胞（发酵）、固定化酶、固定化细胞或细胞器，它们都可以用于工业生产。与游离酶和游离细胞相比，固定化酶和固定化细胞有着特别的优越性。游离酶与底物混在一起反应，随着反应时间的延长，产物积累，反应速度会逐渐下降；只能采用分批法生产，反应结束后酶不能回收；有酶在反应混合液中，给产物的分离增加了困难。发酵需要添加许多营养物质，成本高；易染杂菌；发酵液的成分复杂，产物分离困难；易造成环境污染。固定化酶和固定化细胞操作方便；对微生物污染不敏感；容易实现连续生产和自动化生产，即使是批式生产也能回收生物催化剂反复使用；产物的分离简单；酶经固定化后稳定性增加。使用非增殖的固定化细胞仅需要维持催化反应的能量，因此效率比发酵法高。固定化细胞的生长阶段和催化反应阶段是分开进行的，可以各自选择最优化的条件，而发酵中这两步是在同一设备中同时进行的，操作条件只能是两种要求之间的折衷。 酶固定化的研究最早可以追溯到1916年，Nelson和Griffin首先发现酵母蔗糖酶能被骨碳粉末吸附，并在吸附状态下仍有酶活性。1953年，Grubhofer和Schleith为应用目的而积极开展固定化酶的研究工作，他们将聚氨苯乙烯树脂重氮化，使羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶等结合在树脂上，实现了酶的固定化。1969年千火田一郎等首先在工业生产中应用固定化氨基酰化酶生产L-氨基酸。至今已有多种固定化酶获得工业规模的应用，如固定化葡萄糖异构酶生产高果糖浆，固定化青霉素酰化酶生产6-氨基青霉烷酸，固定化微生物细胞生产L-天冬氨酸和L-苹果酸，固定化乳糖酶生产低乳糖牛奶等。 安徽医科大学用固定在聚酯片上的杂交瘤细胞，生产用于血型鉴定的单克隆抗体（可查一下1997年2月上旬的健康报）。 固定化酶的制备方法可分为三大类：a. 载体结合法；b. 交联法；c. 包埋法。 9.1.1 载体结合法： 它是将酶结合于水不溶性载体的一种固定化方法。根据结合的方式不同，又可分为物理吸附、离子结合和共价结合三种。 9.1.1.1 物理吸附： 可用于物理吸附制备固定化酶的载体很多，如活性炭、多孔玻璃、酸性白土、高岭石、氧化铝、硅胶、膨润土、羟基磷灰石、淀粉、合成树脂、陶瓷等。此外还有疏水性的载体如丁基或己基葡聚糖凝胶可以疏水性吸附酶。物理吸附法具有酶活性中心不易被破坏，酶的高级结构变化少，操作简便的优点。缺点是酶与载体的结合力弱，酶易脱落。 物理吸附法也能固定微生物细胞。 9.1.1.2 离子结合： 这是通过离子键结合于具有离子交换基团的水不溶性载体的固定化方法。作为此法的载体有各种离子交换纤维素，离子交换葡聚糖，离子交换树脂等。离子结合法的优缺点与物理吸附法相似，但比物理吸附的结合力要强。当缓冲液的pH发生变化或离子强度较高时，酶易脱落。1969年最早用于工业生产的固定化氨基酰化酶就是使用DEAE-葡聚糖凝胶固定的。 9.1.1.3 共价结合： 这是酶以共价键结合于载体的固定化方法。可与载体结合的酶的功能团有α或ε-氨基，α、β或γ-羧基，巯基，羟基，咪唑基，酚基等，但参与共价结合的氨基酸残基应当不是酶催化活性所必需的，否则往往造成固定后酶活性完全丧失。共价结合的方法可分为两类，一类是先将载体上的有关基团活化，然后与酶的有关基团偶联；另一类是用双功能分子连接载体和酶。 用于共价结合的载体有葡聚糖、琼脂糖、纤维素、胶原、蚕丝、聚丙烯酰胺、聚丙烯腈、尼龙、活性碳、硅藻土、多孔玻璃、不锈钢、磁性氧化铁、砂等。 共价结合法与物理吸附法及离子交换法相比，反应条件较激烈，操作复杂，会引起酶构象变化，酶活性丧失较多。酶活回收率一般在30％左右，有时甚至连底物的专一性也会发生变化。但酶与载体结合牢固，不易脱落；回收的酶活性稳定性较高。 9.1.2 交联法： 这是用双功能或多功能试剂使酶与酶之间交联成立体化网状结构的固定化方法。此法与共价结合法一样也是利用共价键固定酶的，所不同的是它不使用载体。作为交联剂的有形成希夫碱的戊二醛，形成肽键的异氰酸酯，产生重氮偶合反应的双重氮联苯胺等。交联法反应条件比较激烈，固定化的酶活回收率一般较低。尽可能地降低交联剂的浓度和缩短反应时间有利于固定化酶比活性的提高。 氰酸 （H-O-C≡N）, 硫氰酸 （H-S-C≡N）, 异氰酸 （H-N=C=O）, 异硫氰酸 （H-N=C=S）, 异氰酸酯 （R-N=C=O）, 异硫氰酸酯 （R-N=C=S）。 9.1.3 包埋法： 包埋法可分为网格型和微囊型两种。将酶或细胞包埋在高分子凝胶网格中的称为网格型，将酶包埋在球状半透膜中的称为微囊型。包埋法一般不需要与酶形成共价键的反应，几乎不改变酶的高级结构，酶活回收率高，因此可以用于许多酶、细胞、细胞器的固定化。但在发生化学聚合反应时包埋，酶容易失活，必须小心设计反应条件。包埋法只适合于固定那些底物和产物均为小分子的酶，对于那些作用于大分子的酶来说是不合适的，因为只有小分子底物和产物才能通过高分子凝胶的网格及半透膜扩散，而大分子底物无法与网格中或微囊中的酶或细胞接触。 9.1.3.1 网格型： 形成网格有两种方法，一种方法是把酶或细胞与能形成高分子聚合物的单体混合，然后使单体聚合成网格状凝胶，如聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、光敏树脂等，酶或细胞就被包埋在网格中。另一种方法是将溶胶状的天然高分子物质与酶或细胞混合，然后凝胶化，如淀粉、琼脂、明胶、胶原、海藻酸、角叉菜胶等。 网格型包埋是固定细胞用得最多且最有效的方法。 9.1.3.2 微囊型： 微囊通常是直径几微米到几百微米的球状体，内有含酶的溶液，微囊的膜可让小分子物质通过，但酶不能通过。小分子底物通过扩散进入囊内，经酶反应生成产物后再扩散出来。作为膜材料的有硝酸纤维素（用乙醇和乙醚混合液溶解则为火棉胶）、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、尼龙、聚酰胺、聚脲等。 脂质体：用表面活性剂和卵磷脂制成的液膜微囊。 微囊型颗粒比网格型颗粒要小得多，有利于底物和产物的扩散，但微囊制备时反应条件要求高，制备成本也高。 9.2 固定化技术： 9.2.1 载体固定法： 9.2.1.1 物理吸附： 由物理吸附法将酶固定到载体上有三种方法：a. 混合浴或振荡浴吸附法；b.反应器中直接吸附法；c. 电淀积法。在三种技术中，实验室制备固定化酶最常采用的技术是混合浴或振荡浴吸附法。它是将载体加到酶液中搅拌混合或于水浴中连续振荡，使酶均匀吸附到载体上。工业上最好采用在反应器中直接吸附的方法，先将要使用的载体装入反应器中，然后将酶加入，并进行搅动或循环通过反应器。电淀积法是将载体放在酶液中靠近一个电极处，加上电场，酶移向载体，并沉积在载体表面。 吸附效果与许多因素有关，如pH、溶剂性质、离子强度、时间、温度、酶量及吸附剂的量等。由于蛋白质和吸附剂之间的结合力（主要是氢键、范德华力和疏水作用等）比较弱，需严格控制这些条件。影响酶吸附到载体上的量的主要因素，是在固定化过程中与单位面积载体接触的酶浓度，固定化酶活性随酶浓度增加而增加，在较高酶浓度下逐渐接近于饱和值。用吸附法制备固定化酶时，温度和时间是重要参数，特别是用多孔载体时，这两个参数更加重要，因为把酶固定到这样的载体上时，扩散是重要因素。 使用物理吸附法固定的酶时，要注意采用酶不易脱落的条件。 9.2.1.2 离子结合： 离子结合的方法与物理吸附法相似，现举一个将氨基酰化酶结合到DEAE-Sephadex上的例子。 将充分溶胀的DEAE-Sephadex A-25用0.05N NaOH和水洗后，与预先调pH至7.0～7.5的氨基酰化酶酶液(酶活约25μmol/h/ml)混合， 离子交换剂与酶液的比例为1g湿重的DEAE-Sephadex A-25加60ml酶液。 混合物在低温下搅拌过夜， 然后除去上清液，依次用水和0.15mol/L醋酸钠溶液洗涤，就得到固定化酶。酶活性回收一般可达50％左右，可连续使用一个月左右。 9.2.1.3 共价结合： 共价结合的许多反应与酶的化学修饰的反应相同。 ① 重氮化：  芳香重氮基与酶分子上的酚基或咪唑基反应。酶分子中的自由氨基也可参加反应，生成 我国开发出了一种较好的固定化方法，它是在碱性条件下，用β-硫酸酯乙砜基苯胺（SESA）与纤维素（或其它多糖）载体上的羟基反应，生成对氨基苯磺酰乙基纤维素，再重氮化，然后与酶偶联。  ② 形成酰胺键： a. 酸酐衍生物：通常是用顺丁烯二酸酐共聚的酸酐衍生物与酶的氨基反应，形成酰胺键，同时产生的羧基可用加二胺化合物来封闭。  b. 酰基叠氮衍生物：用含羧基或羟基（羟基先转换成羧基）的载体，加醇成酯，再加肼成酰肼，再加亚硝酸成酰基叠氮，再与酶分子的氨基反应，生成酰胺。  c. 亚氨碳酸衍生物：溴化氰活化法。 d. 异氰酸和异硫氰酸衍生物：在碱性条件下，带有芳香氨基的载体可用光气或硫化光气加以修饰，分别生成异氰酸酯和异硫氰酸酯，然后再与酶分子上的氨基反应形成酰胺键或硫代酰胺键。若载体上带有酰基叠氮基团，可在酸性条件下转变成异氰酸酯，再与酶反应。  e. 酰氯衍生物：将含有羧基的载体如Amberite IRC-50在亚硫酰氯溶液中回流，生成酰氯，可在低温下与酶反应生成稳定的固定化酶。  f. 环碳酸衍生物：含有羟基的载体如多糖和聚烯丙基醇，在pH7～8含有二氯六环和三乙醇胺的无水二甲亚砜溶液中，与氯甲酸乙酯反应生成环碳酸衍生物。它以环亚氨碳酸同样的方式与酶的伯氨基反应。和环亚氨碳酸法相比，这种方法费用低，操作简单，也不用有毒化学试剂。  g. 碳二亚胺法：用碳二亚胺（R-N=C=N-R'）活化载体或酶分子上的羧基，然后与酶分子或载体上的氨基缩合生成酰胺键。 ③ 烷基化和芳基化： a. 活性卤素：用甲基丙烯酸和甲基丙烯酸-5-氟-2,4-二硝基酰替苯胺聚合成的载体上含有活性氟，可与酶分子上的氨基反应。或给含羟基的载体结合上一含卤素的基团，然后与酶分子的氨基反应。后一种方法的主要缺点是酶和载体之间的酯键有时不够稳定。  b. 环氧氯丙烷：有羟基的载体在三氟化硼乙醚存在下与环氧氯丙烷反应，然后活性氯与酶分子的氨基反应。  c. 三氯均嗪法：先将三氯均嗪与载体上的羟基结合，再与酶分子的氨基结合。 d. Ugi反应：四种功能团（羧基、氨基、醛基、异氰基）同时反应生成N-取代酰胺。 e. 生成希夫碱后还原：见第三章。 ④ 脒基化反应： 含有氰基的载体在乙醇中用干燥氯化氢活化，生成容易被亲核基团作用的亚胺酯衍生物，再与酶分子的氨基反应生成脒化物。 脒化反应也可以发生在溴化氰活化的含氨基载体和酶分子的氨基之间，从而在酶与载体间生成胍基键。 ⑤ 无机载体表面硅烷化： 无机载体的化学性质不够活泼，进行共价偶联比较困难。可用硅烷化的方法来解决。如多孔玻璃或磁性氧化铁表面用3-氨丙基三乙氧硅烷进行硅烷化，可引入氨基。 玻璃表面也可用溴化氰活化，生成环亚氨碳酸衍生物。 ⑥ 金属键合／螯合： 过渡金属常能形成配位化合物，载体和酶分子上的一些基团可以成为配体，通过形成配位键，过渡金属原子可在载体和酶之间起连接作用由于钛和锆的氧化物没有毒性，所以常用钛和锆的氯化物活化载体，或者用它们在碱性条件下生成的水解产物沉淀作为载体，来固定酶。此法所用的载体可以是纤维素、玻璃、尼龙、硅胶、葡聚糖、白明胶、角闪石、磁性氧化铁等。现举一个用TiCl4活化无机载体并与酶结合的例子： a．取10g无机载体（多孔铝、不锈钢、镍-镍氧化物）放入反应瓶。 b．把反应瓶一部分浸入冰浴，再加62.5ml冷水混合。 c．缓慢加入6.3ml纯的TiCl4，并强力搅拌。 d．把反应瓶从冰浴中取出，加热到80℃并保温1小时。 e．用自来水把载体上的水合钛氧化层彻底洗涤。 f．干燥洗净的有水合钛氧化层的载体，110℃下干燥过夜。 g．将含1g蛋白质的酶液加入已活化的载体，在0～5℃接触18小时。 h．除去上清液，用无离子水洗固定化酶4～6次。 9.2.2 交联法： 酶分子间交联最通用的试剂是戊二醛，最初认为其机理是试剂的醛基与酶分子的氨基形成希夫碱，但交联的键对pH和温度极其稳定，看来不是因为形成了希夫碱，因为C＝N键的一侧须有一个芳环此键才能稳定。有人提出，交联反应包括了酶的氨基与常用商品戊二醛溶液中存在的α,β-不饱和寡聚体的双键的反应。用重蒸过的戊二醛新配制的溶液与酶的反应性远远低与商品戊二醛溶液，证实了这种观点。不溶复合物的形成严格地依赖于酶和戊二醛的相对浓度以及溶液的pH和离子强度。蛋白质的最适浓度是50mg/ml和200mg/ml，戊二醛的最适浓度是 0.3％和0.6％。当戊二醛与酶的比例为10％（w/w）时，会产生均匀的不溶产品。交联反应的时间、pH、离子强度要随酶的不同而异。 9.2.3 包埋法： 9.2.3.1 网格包埋法： ① 聚丙烯酰胺凝胶包埋： 将酶液或细胞悬液、丙烯酰胺（CH2=CH-CO-NH2）、N,N'-甲叉双丙烯酰胺（CH2=CH-CO-NH-CH2-HN-CO-CH=CH2）、N,N,N',N'-四甲基乙二胺（TEMED）或二甲氨基丙腈（DMAPN）[加速剂]、过硫酸铵[(NH4)2S2O8]或核黄素[引发剂]、缓冲液（常用Tris-HCl缓冲液）按一定比例混合，在无氧条件下聚合（若用核黄素作引发剂需照光）成凝胶（双键打开连接），再用过筛或通过注射针头挤出使凝胶破碎成小颗粒，洗涤至洗涤液中无酶活性后即成。此法的缺点是聚合反应时酶容易失活。 ② 海藻酸钙凝胶包埋： 海藻酸是从褐藻中提取出来的一种多糖，它是以1,4键连接的β-甘露糖醛酸和α-L-古洛糖醛酸不同排列的长链。在单价阳离子存在下，低浓度的海藻酸以溶液形式存在；在二价阳离子，特别是钙存在时，溶液发生凝胶化。此法适合包埋细胞。 将海藻酸溶液（4％,w/v）与细胞泥混合，用注射器通过孔径1mm的针头从20cm高处把混合液滴入0.2mol/L CaCl2溶液中，让凝胶颗粒在CaCl2溶液中固化20min即成。 此法方法简单，条件温和，操作在室温下进行； 但海藻酸凝胶在含多价阴离子（磷酸盐、柠檬酸盐等）以及高浓度电解质（K＋、Na＋）溶液中不稳定，Ca2＋易脱落，凝胶变软，甚至溶解。有人用乙烯多胺、戊二醛等制成交联海藻酸钙，可以弥补这个缺陷。 ③ κ-角叉菜胶包埋： κ-角叉菜胶是从红藻中分离得到的一种多糖，由β-半乳糖硫酸酯和3,6-失水-α-半乳糖以1,4键连接而成。角叉菜胶除κ型外，还有θ、ι、λ、μ、ν、ξ等型，其不同点在于硫酸酯含量、结合部位以及3,6-失水-α-半乳糖的含量不同。在实际应用时是使用凝胶性能好，且能大量制造的κ型。 将κ-角叉菜胶溶于60℃生理盐水（0.9％NaCl）中，使其浓度为4％，然后降温至40℃保持其为溶液状态。在40℃下将κ-角叉菜胶溶液与细胞泥或酶混合，用注射器将混合液滴入2％KCl溶液中，让其固化20min。 κ-角叉菜胶凝固后，再用戊二醛与己二胺或戊二醛与赖氨酸交联处理，强度和稳定性更好。 ④ 琼脂包埋： 此法可包埋细胞。热溶冷凝。 ⑤ 胶原和明胶包埋： 胶原是一种蛋白质，是胶原纤维的组成成分，在动物的皮肤、骨头、腱中含量很高。胶原有纤维性，容易制成膜，将酶加到胶原悬浮液中，铺膜，干燥，就可以制成固定化酶膜。 明胶是胶原的部分水解产物，溶于水。明胶通过戊二醛交联可成为一种不溶性固定化载体。酶或细胞也能通过戊二醛与明胶网架结合，组成一种复合体，而不是单纯的包埋。此法的优点是载体强度好，无毒害，价格低，取材容易，包埋的酶或细胞不易脱落；缺点是戊二醛交联时酶容易失活。 9.2.3.2 微囊包埋法： ① 界面沉淀法： 这是利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度极低而形成膜将酶包埋的方法。一般是先将含保护剂的酶液在与水不互溶的有机相中乳化，在油溶性的表面活性剂存在下形成油包水的微滴，微滴的大小由搅拌的速度和时间决定。再将溶于有机溶剂的高聚物加入乳化液中，然后加入一种不溶解高聚物的有机溶剂，使高聚物在油水界面上沉淀、析出、形成膜，将酶包埋。此法条件温和，酶失活少，但要完全除去膜上残留的有机溶剂很麻烦。 酶保护剂常用的有牛血清白蛋白（BSA）、血红蛋白、聚乙烯亚胺（PEI）等；有机相一般是醚、环己烷、甲苯等；高聚物是硝酸纤维素、乙酸纤维素、异丁烯橡胶等；表面活性剂可以用Span 85。 下面是用异丁烯橡胶微囊包埋过氧化氢酶的方法： A．准备下列四种混合物： a．2.6g乳化剂Span 85，25ml环己烷； b．1ml 50mmol/L的磷酸缓冲液，pH7.0，含过氧化氢酶650单位； c．0.1g异丁烯橡胶，50ml环己烷，搅拌1～2小时使其完全溶解； d．15ml环己烷，10ml菜油。 B．把混合液a加入到混合液b中，不断搅拌； C．再加入混合液c，不断搅拌； D．边搅拌边加入混合液d ； E．抽真空至26mmHg柱，在连续搅拌下环己烷蒸发，蒸发不能太快； F．离心含有微囊的油相，倾去上部油层，加入15mlL磷酸缓冲液，再悬浮颗粒，离心除去上清液；重复若干次； G．悬浮微囊于含有吐温20的缓冲液中。 ② 界面聚合法： 这是将亲水性单体和疏水性单体利用界面聚合的原理包埋酶的方法。例如，将含10％血红蛋白的酶液与1,6-己二胺的水溶液混合，立即在含1％Span 85的氯仿-环己烷中分散乳化，加入溶于有机相的癸二酰氯后，在油水界面上发生聚合反应，形成尼龙膜，将酶包埋。 除尼龙膜外，还有聚酰胺、聚脲等形成的微囊。此法制备的微囊大小能随乳化剂的浓度以及乳化时的搅拌速度而自由控制，制备过程所需时间非常短。但在包埋时由于发生化学反应而容易引起酶失活。 ③ 脂质体： 脂质体是由磷脂类或其它脂类所组成的一种微粒。磷脂在水中搅拌以后能自动排列成双分子层，或者多层次的双分子层，形成内部含水的球形颗粒。含酶的脂质体常用于治疗缺酶病。 制备脂质体的方法很简单。取40μmol卵磷脂、11.4μmol胆固醇、5.7μmol二乙酰磷酸，用氯仿或其它有机溶剂配成2～3ml溶液，加到一干燥的50ml圆底烧瓶中，在旋转蒸发器内37℃蒸去溶剂，溶质在瓶底形成一薄层。取下烧瓶立即加入1～2ml酶液及几粒玻璃小球，轻轻摇晃，即得乳状脂质体的悬浮液，离心除去溶液，用缓冲液洗脂质体几次，最后将脂质体放在1％氯化钠溶液中保存。 9.2.4 辅酶的固定： 有些酶需要辅酶才能催化反应，如一些脱氢酶和激酶分别需要NAD(P)＋和ATP。 由于辅酶价格昂贵，只有反复使用才有实用价值。通常是在主要酶反应中辅酶发生变化，而在一偶联的再生反应中辅酶又恢复原状，从而达到反复使用的目的。若将辅酶固定到不溶性载体上就起不到辅酶的作用，因为它不能在两个酶反应中来回运动。现在的方法是将辅酶固定到水溶性高分子化合物上，然后和两种酶一起包埋到微囊中，这样辅酶可以在微囊中起作用，又不会从微囊中扩散出来。这种方法要求两种酶反应的反应条件相似（如pH、温度等），若主反应和再生反应的反应条件差别较大，则须分开进行。 ATP的再生反应可以用乙酸激酶、氨基甲酸激酶、肌酸激酶等催化，如乙酸激酶催化的反应为： NAD的再生反应可以用乳酸脱氢酶，NADP的再生反应可以用葡萄糖脱氢酶。 用于固定辅酶的水溶性高分子可用右旋糖酐、聚赖氨酸、聚乙亚胺等。