第八章 酶的别构效应 本章中将讨论一些不符合米氏方程的酶动力学，即非双曲线动力学。有些影响酶活性的效应剂（包括激活剂和抑制剂）作用于酶活性部位以外的部位，通过酶分子构象的改变来调节酶的活性。这种效应叫做别构效应（allosteric effects），这种效应剂叫做别构效应剂，受别构效应剂影响的酶叫别构酶（allosteric enzyme）。 8.1 别构酶与代谢调节 8.1.1 别构效应在代谢调节中的意义 生物体内的物质代谢都是在酶的直接作用下进行的，要使物质代谢协调有序地进行，酶活性必须根据情况适时地改变。利用别构效应调节酶活性是各种酶活性调节方式中最迅速的一种，大多数代谢物的反馈抑制就属于别构调节，也有一些代谢物可对代谢途径中的酶起别构激活作用。 8.1.1.1 别构抑制作用 反馈抑制可分为五种类型： 线性通路中的反馈抑制 一条途径的最终产物抑制途径中最初的酶活性。  趋同通路中的反馈抑制 为了有效地合成D，要求B和C的浓度大致相等。当C浓度大时，对产生B的途径的最初的酶有激活作用；当B浓度大时，对产生B的途径的最初的酶有抑制作用。 C．趋散通路中的反馈抑制 EC和ED为两种同工酶，分别受C和D的反馈抑制。当C太多时，不仅抑制从B到C的第一个酶，而且抑制从A到B的第一个反应两种同工酶中的一种，使得B合成的速率下降。B的合成不能完全停止，因为合成D还需要B。当D太多时情况相似。 D．顺序反馈抑制 一条途径中有多个反馈抑制步骤。 E．协调反馈抑制 需要多种代谢物共同作用才能发挥反馈抑制作用。 8.1.1.2 别构激活作用 当一种代谢物积累后，激活某些酶，从而加强别的代谢途径。如有氧呼吸旺盛时，ATP大量合成，AMP和ADP减少，由于AMP和ADP是异柠檬酸脱氢酶的激活剂，因此异柠檬酸和柠檬酸浓度增高，柠檬酸能激活乙酰CoA羧化酶和己糖激酶，同时抑制PFK（磷酸果糖激酶）。激活乙酰CoA羧化酶可增强脂肪酸的合成，激活己糖激酶且抑制PFK，可使G-6-P更多地进入磷酸戊糖途径，合成更多的NADPH，供脂肪酸合成使用。 8.2 别构酶的基本概念 8.2.1 一个典型的别构酶——天冬氨酸转氨甲酰酶 天冬氨酸转氨甲酰酶（aspartate transcarbamoylase, ATC）是嘧啶核苷酸生物合成途径的第一个酶（→ → → UTP → CTP）。ATC的活性受到CTP的强烈抑制，又受到ATP的高效激活（见下表）。在对照、加ATP、加CTP三种情况的[S]对V图中可以看出，对照呈S形曲线而不是双曲线；加ATP减小了反应的表观Km值，使曲线向双曲线靠近；加CTP增大了反应的表观Km值，使曲线的S形更加明显。加ATP和CTP并不影响Vm。 效应剂 抑制%  嘧啶族 胞嘧啶 0   胞嘧啶核苷 24   胞苷一磷酸（CMP） 38   胞苷二磷酸（CDP） 68   胞苷三磷酸（CTP） 86   尿苷三磷酸（UTP） 8  嘌呤族 鸟苷三磷酸（GTP） 35   腺苷三磷酸（ATP） －180（激活）  表 效应剂对天冬氨酸转氨甲酰酶活性的作用 为了解释这种现象，研究者设想在酶分子中有两个分开的部位，一个部位与底物结合并催化反应，另一个部位是ATP或CTP等效应剂的结合位点。利用选择性修饰法修饰后一个部位后，ATC的活性并不丧失，但对CTP抑制的敏感性下降，这种现象称为脱敏作用。选择性修饰实验证实了两个部位的设想。现在我们知道，ATC由12条多肽链组成，2个α3亚基，3个β2亚基。 根据对ATC的研究，得出了5点结论： 1．酶分子上有两个结合部位，结合底物并催化反应的部位叫活性部位，结合效应剂的部位叫别构部位或调节部位。 2．这两个部位能同时分别被底物和效应剂占据。 3．调节部位可与多种效应剂结合，并产生不同的效应。 4．效应剂的结合影响酶分子的构象，从而影响酶的着底物的结合能力和催化能力。 5．调节部位的效应是构成别构抑制或别构激活的基础，而后两者又是代谢调节的有效方式之一。 8.2.2 别构酶的协同效应 协同效应（cooperative effects）也是多亚基别构酶的一个特征。我们把能与酶结合的底物、激活剂和抑制剂统称为配体，所谓协同效应是指当一个配体与酶结合以后，可以促进或抑制另一个配体与酶的结合。 8.2.2.1 协同效应的分类 A．同种效应和异种效应 同种效应（homotropic effects）指的是一分子配体与酶结合后影响另一分子同种配体与酶的结合；异种效应（heterotropic effects）指的是一分子配体与酶结合后影响另一分子异种配体与酶的结合。 B．正协同和负协同 一分子配体与酶结合后促进另一分子配体与酶结合叫正协同（positive cooperation），抑制另一分子配体与酶结合叫负协同（negative cooperation）。 同种效应一般是正协同；异种效应有正协同，也有负协同。 8.2.2.2 协同效应的鉴别方法 通过动力学作图，可以鉴别正协同、负协同和无协同。 8.2.2.3 协同指数和协同系数 协同指数（cooperative index，CI）是指酶的底物结合位点被底物饱和90%和饱和10%  （即V = 0.9Vm和V = 0.1Vm）时的底物浓度之比，故协同指数又称饱和比值（Ratio saturation，Rs）。 对于一个可结合n个底物分子的酶，其反应式可用下式表示：  按米氏方程的推导过程可得…………①，式中。这里假设n个底物是同时结合上去的。 当V = 0.9Vm时，[S]0.9 =；当V = 0.1Vm时，[S]0.1 =。 CI = Rs = = 因此，当n＝1时，CI＝81，和以前讲过的单底物单产物反应的米氏方程相同，无协同效应。当n >1时，CI < 81，为正协同，表示V对[S]改变的灵敏度增加，且n越大正协同效应越大；当n <1时，CI > 81，为负协同，表示V对[S]改变的灵敏度减小，且n越小负协同效应越大。n值即为协同系数。 从理论上推导上式时，n是与酶结合的底物分子数，但实际上测出的n值（测定方法见后）有小于1的情况。上面说的n >1、n＝1、n <1指的是实际测定值，这是因为推导上式时的前提就不正确，n个底物并不是同时结合上去和同时解离下来的。 别构激活剂常可减少正协同效应（底物和底物之间的正协同）的n值，使正协同效应减弱，在V对[S]作图中，可使S形曲线趋向双曲线。相反，别构抑制剂常可增加正协同效应的n值，使正协同效应增强，使S形曲线弯曲更加明显。 8.2.2.4 半位反应性 兔肌和细菌的3-磷酸甘油醛脱氢酶由4个同种亚基组成，每个亚基上有1个NAD+结合位点，但实验结果发现该酶往往只能结合2个NAD+分子，这就是半位反应性。半位反应性实际上是一种极端的负协同效应，当第一、二个NAD+与酶结合后，第三个结合位点与NAD+的亲和力已降得很低，实际上已不能与NAD+结合。 8.2.2.5 协同效应的生理意义 异种协同效应分为别构激活（异种正协同）和别构抑制（异种负协同）效应。它们的意义已在7.1.1中讨论过。 底物引起的同种协同效应的生理意义已有一些推测。正协同效应提供了一个V对[S]的敏感区域，即S形曲线中的“陡段”，当细胞内底物浓度处于这个“陡段”时，[S]的轻微变化可使V发生很大的变化，有稳定[S]的作用。当细胞内底物浓度处于低[S]的平缓段时，[S]的变化不会使V有太大的变化，有稳定V的作用。别构激活剂和别构抑制剂可使“陡段”左移和右移。 底物引起的负协同效应在更大的[S]范围里使V稳定，如3-磷酸甘油醛脱氢酶在低浓度时，能顺利地进行糖酵解，而当其他反应影响使NAD+浓度增加时，即使大幅度地增加NAD+（100倍以内），都可因其半位反应性而不增加酶反应速度。 8.2.3 别构酶的其他动力学术语 A．S 0。5 前面①式中的K S＇= [S]n时，。由于别构酶不符合米氏动力学，我们将时的底物浓度称为表观Km或S 0。5 。 B．K型效应剂和V型效应剂 在别构效应剂中，只影响Km（或者说S 0。5）的效应剂称为K型效应剂，它们与竞争性抑制剂的效应相似；只影响Vm的效应剂称为V型效应剂，它们与非竞争性抑制剂的效应相似；当竞争性效应剂只会使Km增大，而K型效应剂根据其是激活还是抑制，分别使S 0。5降低和升高。非竞争性抑制剂只会使Vm下降，而V型效应剂根据其是激活还是抑制，分别使Vm升高和降低。K—V型效应剂与混合型抑制剂相似，既影响S 0。5又影响Vm 。 8.2.4 别构酶的通性 由多个亚基组成，亚基可以是同种或异种。 有调节部位和催化部位。 可结合多个配体。 配体的结合有协同效应，一分子配体与酶结合后使酶的构象改变，从而影响下一分子配体的结合。 根据CI值或n值可鉴别协同效应的类型。 其V对[S]的曲线不是双曲线，而是S形曲线（正协同）或“表观双曲线”（负协同）。 8.3 别构机制的模式 8.3.1 Hill模式 Hill模式是Hill在1909年提出来的，当时是试图解释O2与血红蛋白结合的S形曲线的，后来用于别构酶反应中。以下是求n值的方法：  式中 …………② 设酶被底物饱和的分数为，则………………③ 由②得 ………………④ 将④代入③得 ， ， ， ， ………⑤ ∵ ，代入⑤式得  。 以对作图，可得一直线，其斜率为n，纵轴截距为，横轴截距为lg S 0。5 。 S 0。5越小，则酶对底物的亲和力越大（当>>时）。 Hill模式忽略了ES，ES2，…ESn-1等形式的存在，由于协同效应和前述忽略不饱和结合形式的影响，根据Hill作图计算出来的n值往往小于酶对底物的结合位点数，Hb（hemoglobin，血红蛋白）上有4个O2结合位点，但计算的结果是n＝2.6～2.8。在负协同效应中，每分子酶也结合n个底物，但计算的结果却是n <1。所以Hill系数只能作为鉴别协同性的指标。 当[S]过高或者过低时（[S] > [S]0.9或 [S] < [S]0.1），n常等于1，故在一个广泛的[S]范围内作图时，得到的是折线。 8.3.2 Adair模式 Adair模式允许有稳定的未被底物饱和的E—S复合物存在。对于一个有4个底物结合位点的酶，有  其中K1、K2、K3、K4实际上是微观或内在解离常数（microscopic or intrinsic dissociation constants），如果4分子底物是分别结合在四聚体酶的4个亚基上，则4个表观解离常数（apparent dissociation constants）为：，，，。 取上面第二式证明如下：  ， ， ，证毕。 ……………………⑥ ， ， ， ， ，  ，  将5种酶形式的表达式代入⑥式得 ， 分子分母同乘以得 …………………⑦ 如果酶分子中4个底物结合位点是相同的，并且它们之间没有相互作用，无协同性，则内在解离常数K1= K2= K3= K4，可用Ks统一表示它们，因此，，，，代入⑦式得  分子分母同除以得      ∵ ， ∴ ， ，与米氏方程相同。 如果每一底物结合位点的内在解离常数不同时，就会出现协同性。K1> K2> K3> K4是正协同性，K1< K2< K3< K4是负协同性。 ∵ ，，∴ >时>，即>，余相似，>，>，在这些条件下就会导致正协同性。同理可得出负协同性的关系式。 8.3.3 MWC模式 1965年，Monod，Wyman和Changeux最早提出了一个根据酶的构象变化来说明协同效应的分子模式，MWC模式即以他们3人的姓缩写命名。根据此模式的特点，又称为齐变模式（concerted model）。此模式规定了以下几点： a．别构酶是寡聚酶，由同种亚基组成，这些亚基称为原体（protomer），它们在寡聚体中占有均等的地位。 b．一个原体对一种配体只有一个结合位点。 c．原体有两种构象状态，分别为R型（relaxed，松弛态）和T型（tensed，紧张态），这两种状态在与底物的亲和力、对别构效应剂的反应、催化活力方面可以不同，同一种状态在这些方面是相同的。 d．在一个寡聚体中，所有的原体均处于同一种构象。各原体构象的转变是同步的，在一个寡聚体中，不存在R型和T型的杂合体。 e．R型和T型之间有一个转换平衡。 8.3.3.1 底物同种协同效应（以4聚体为例）  推导略 ，式中n等于一个寡聚体中的原体数，在上例中n＝4。 设，，则。  对上式的讨论： 当L无穷小时，体系中只有R型，。 当L无穷大时，体系中只有T型，。 当时，（两种内在解离常数相等），。 因为R型对底物的亲和力恒大于T型，所以值不可能大于1，C可在0～1之间取值。当C = 1时无协同效应；当C = 0时正协同效应最大。C越小正协同效应越大。 L越大正协同效应越大。  表 某些别构酶（别构蛋白）的别构常数 别构蛋白 配体 结合位点数 Hill系数 L C  血红蛋白 O2 4 2.8 3×105 0.01  酵母丙酮酸激酶 磷酸烯醇式丙酮酸 4 2.8 9×103 0.01  酵母3-P-甘油醛脱氢酶 NAD+ 4 2.3 60 0.04  8.3.3.2 异种协同效应 MWC模式也可以解释异种协同作用。 假设底物优先与R型结合，别构激活剂A也优先与R型结合，则A的存在可使R和T之间的平衡偏向R型，即L值降低，提供更多的R型供底物结合用，使Ys上升，表现出激活效应，同时底物正协同效应减弱。如果A与R型的结合不改变R型的催化效应，也不改变KR，则A为K型激活剂。 相反，K型抑制剂I优先与T型结合，使L值上升，T型增加，Ys降低，表现出抑制作用，同时底物正协同效应增强。 如果KR = KT，但R型有较高的催化效率，则与R型结合的A成为V型激活剂，与T型结合的I成为V型抑制剂。 MWC模式没有能够解释负协同效应。 8.3.4 KNF模式 1966年，Koshland，Nemethy和Filmer对Adair模式进行了扩展，提出了KNF模式，根据此模式的特点，又被称为序变模式（sequential model）。其要点如下： 在底物或效应剂不存在时，酶的各个原体以同一种构象存在。 当底物与一个原体结合后，可引起此原体构象的变化，同时使邻近的原体改变对底物的亲和力；第二分子底物与第二个原体结合后，使第二个原体构象发生改变，同时又影响了剩余原体对底物的亲和力。  K1>K2>K3>K4（内在解离常数）为正协同效应；K1<K2<K3<K4为负协同效应。 8.4 引起非双曲线动力学的其他现象 8.4.1 酶的记忆现象 有些单体酶能表现出S形曲线，但又不是因为别构效应引起的。1967年Rabin提出酶——底物复合物能进行异构作用的机制来解释S形曲线。  在上式中，ES必须先缓慢地异构成FS，然后快速地分解（break down）成F和P，F能够回复到E，也可以与S结合形成FS。在低浓度S时，酶主要以E和ES形式存在，产物形成速度被缓慢的异构化作用所限制。由于[S]低，F有较多的比例回复到了E，只有少量的F直接与S结合成FS。当[S]高时，又较多的F直接与S结合成FS，由于直接生成FS，避免了这个限速步骤，所以大幅度地加快了反应速度，从而表现出S形曲线。别构激活剂与E结合后可以提高异构化速率，别构抑制剂则降低异构化速率。别构效应剂通过影响k4及k1＇也会影响S形曲线的性状。 FS释放出P后仍保持F构象可以认为是一种“记忆”现象。有记忆现象的酶称为记忆酶。记忆酶有单底物单产物的，也有双底物双产物的。动物肝脏中的葡萄糖激酶和大麦胚中的己糖激酶都是典型的记忆酶。 8.4.2 可引起正协同作用动力学曲线假象的因素 酶不稳定，但高浓度底物能稳定酶。 底物和激活剂形成复合物，如ATP-Mg2+，当ATP与Mg2+ 以1:1混合后以不同的量加到反应体系中，则加的量增加1倍，ATP-Mg2+ 增加不止一倍。 酶含有可与底物可逆结合的杂质，与杂质结合的底物不能作酶的底物。 随机机制的双底物反应：  如果E→EA→EAB途径快于E→EB→EAB途径，则当A或B有一种饱和时，V对另一种底物浓度的关系约为双曲线。但如果是B低于饱和浓度（A不行），则V对[A]的关系为S形曲线，因为在[A]很低时，E主要与高浓度的B结合，使反应主要走E→EB→EAB这条慢途径，整个反应速度较慢；随着[A]的增加，快途占的比例越来越大，使反应速度迅速增加，从而表现出S形曲线。 酶对底物有极高的亲和力： 如果酶与底物结合非常紧密，为了测定动力学参数，往往要使用较低的底物浓度，即[S]不特大于[E]。在这种条件下，，不能约等于，其双倒数方程为：  双倒数作图会表现出假的正协同现象。如果酶反应速度很慢，需要使用较高浓度的酶时，也会造成这种现象。 8.4.3 可引起负协同作用动力学曲线假象的因素 a．非酶催化反应的干扰： 如果在酶催化反应的同时，还有一种非酶催化反应存在，其速率也与[S]成正相关，则在[S]大到一定程度，酶反应速度已达到Vm，而非酶催化反应仍可随着[S]增加而反应速度增加。当[S]趋向于无穷大时，V也趋向于无穷大。因此双倒数作图是一条向下弯曲的通过原点的曲线，呈现出假的负协同曲线。 b．两个酶催化同一反应： 如果体系中有两个Km值不同的酶催化同一反应（两个同工酶或一部分酶被修饰后未完全失活，但改变了其Km），则观察到的V可由这两个酶反应的速度之和来表示。  其双倒数方程为：  当合适时，可得出负协同曲线的假象。 当，，时，可得右图。