酶学讲义：酶学第六章多种因素对酶反应速度的影响

第六章 pH、温度、抑制剂和活化剂对酶反应速度的影响 6.1 pH对酶反应速度的影响 6.1.1 酶反应的最适pH 如果在不同pH条件下测定酶反应速度，可得到左图中的曲线A,最适pH为6.8。如果将酶在不同pH条件下预保温，然后在pH6.8下测酶反应速度，得到曲线B，说明pH5～8（除了pH6.8附近）使酶可逆失活，当pH回到6.8时，酶活性可完全恢复；当pH 〉8或pH〈5时，酶发生了不可逆失活。 酶 底物 等电点 最适反应pH  α－淀粉酶（猪胰） 淀粉 5.2～5.6 6.9  β－淀粉酶（麦芽） 淀粉 6.0 5.2  蔗糖酶 蔗糖 5.0 4.5  乙酰胆碱酯酶 乙酰胆碱 5.0 8.4  核糖核酸酶（牛胰） 核糖核酸 7.8 7.8  胃蛋白酶 各种蛋白质 3.8 1.5～2.5  胰蛋白酶 各种蛋白质 7.8 7.5  胰凝乳蛋白酶 各种蛋白质 8.1～8.6 8～9  木瓜蛋白酶 各种蛋白质 9.0 5.0～5.5  菠萝蛋白酶 各种蛋白质 9.5～10.0 6.0～6.5  脲酶 尿素 5.0～5.1 6.4～7.6  脱羧酶（酵母） 丙酮酸 5.1 6.0  过氧化氢酶（也叫触酶，牛肝） H2O2 5.6 5.7  醛缩酶（兔肌） 果糖二磷酸 6.0 7.5～8.5  己糖激酶（酵母） 葡萄糖，ATP 4.5～4.8 8～9  黄嘌呤氧化酶（牛乳） 黄嘌呤 6.7 8.5～9.0  一些酶的最适pH和等电点 注意最适pH与等电点的差别。与等电点相比，最适pH偏酸的说明要在带正电荷的情况下工作，最适pH偏碱的说明要在带负电荷的情况下工作。 6.1.2 最适pH的解释 酶分子中含有多种可解离的基团，如－COOH、－NH2、－SH、－OH、咪唑基、胍基等。在最适pH时，各基团的解离状态处于使构象正常及活性中心处于结合底物和催化反应的最佳状态。当pH偏离最适pH时，活性中心基团的解离状态发生变化，使酶与底物的结合能力（亲和力）下降，催化能力也下降，致使酶活性下降，即保持正确解离状态的酶分子比例下降。若pH偏离得太多，导致构象发生不可逆变化，就会使酶变性失活。如溶菌酶活性中心的两个氨基酸只有处于Asp52－COO－和Glu35－COOH状态下才具有活性。 底物的解离状态也受pH的影响，从而影响到底物与酶的结合及被催化反应。 6.1.3 酶的酸碱稳定性 一般来说，酶反应的最适pH也是使酶最稳定的pH，偏离的pH会使酶分子的构象发生变化，构象变化的程度与pH偏离的程度及偏离pH处理的时间有关。若pH偏离不多，或处理时间较短，回复到最稳定pH后，酶活性可得到恢复，这种恢复也是随着时间的推移逐渐发生的。若pH偏离较多或处理的时间较长，则酶发生不可逆失活。 6.1.4 pH影响酶反应速度的动力学 下面讨论几种不同的解离体系的动力学，并假定在实验涉及到的pH范围内，酶的构象不发生变化。 6.1.4.1 游离酶和ES复合物二者的解离体系 A．解离模式 假定各可逆过程均迅速达到平衡，ESH→EH＋P为限速反应。 B．速度方程的推导 用迅速平衡法处理：
………①
………②
………③
………④
………⑤ 由②⑤得
； 由⑤得
； 由①⑤得
； 由④得
； 由③得
； ∵ V = k2[EHS]， [E]0 = [E－]＋[EH]＋[EH2+]＋[ES－]＋[EHS]＋[EH2+S]， ∴
将式⑥代入上式得
分子分母同乘以[S]得
分子分母同除以
得
……………⑦ 式中k2 [E]0 = Vm 。将上式取双倒数形式得
…………⑧ C．讨论 [H+]既影响VmH+，又影响KmH+。当[H+ ]很高或很低时，式子可简化，得KmH+ 的简化式，但意义不大。 D．作图法求常数 a．斜率及截距的再作图法： 当Ke1≥100 Ke2，Kes1≥100 Kes2时，可用本法求Ke1、Ke2、Kes1、Kes2、Ks’、Vm等常数。 式⑧中的斜率和截距整理得 斜率＝
截距＝
根据式⑧，在不同的pH下作直线，每一个pH可以得到一个斜率和一个截距。 当[H+]较高时，上面两式中的
项可以忽略不计，剩下的部分为直线方程。以斜率对[H+]作图得左上图，以截距对[H+]作图得右上图。 当[H+]很低时，上面两式中的[H+]项可以忽略不计，以斜率对
作图得左下图，以截距对
作图得右下图。
从这4个图中，可得出各个常数。但如果Ke1和Ke2相近，或Kes1和Kes2相近，或pH居中，则不能忽略任何一项。 b．Dixon-Webb对数作图法 此方法要求pKe1和pKe2及pKes1和pKes2的差距≥3.5个pH单位。以
对pH作图可求得pKes1和pKes2，以
对pH作图可求得pKe1和pKe2 。 根据式⑦，
，
当处于低pH条件时，[H+]很大，
可以忽略不计，因
很大，1也可以省略，故上式可写成
，
，
以
对pH作图，得一直线，直线的斜率为1。 在高pH时，[H+]很小，
和1都可以忽略不计，上式可写成
，
，
以
对pH作图得一直线，直线的斜率为－1。 在最适pH下，VmH+达到最大， VmH+＝Vm，
。 以
对pH作图得一水平直线，水平直线与斜率为1的直线的交点的横坐标为pKes1，水平直线与斜率为－1的直线的交点的横坐标为pKes2 。 根据式⑦，


当处于低pH时，[H+]很大，1和
可以忽略不计，故上式可写成

，
，
以
对pH作图得一直线，斜率为1。 在高pH时，[H+]很小，1和
可以忽略不计，故上式可写成

，
，
以
对pH作图得一直线，斜率为－1。 在最适pH下， VmH+＝Vm， K mH+= Ks’（Ks’＝Km），

，

， 以
对pH作图，得一水平直线。此水平直线与斜率为1的直线的交点的横坐标为pKe1，此水平直线与斜率为－1的直线的交点横坐标为pKe2。 此图与上图相似。 6.1.4.2 游离酶的解离体系 解离模式 B．速度方程
，
；
，
；
，
； [E]0 = [E－] + [EH] + [EH2+] + [EHS]， V = K2 [EHS] 。 根据上述式子得
，
。 C．讨论 a．pH只影响Km值，而不影响Vm 。当[S] 〉〉KmH+时，V = Vm 。 b．在低pH下，[H+]很大，式中的
可以忽略不计，于是
，此式与竞争性抑制作用的速度方程相似，因此在低pH范围内，H+是一种竞争性抑制剂。 竞争性抑制作用也是只改变Km ，不改变Vm 。 c．随着[H+]的变化，KmH+可达一极小值。将KmH+表达式对[H+]微分得



，当
时，KmH+为极小值。
，
，
，
，
。 当KmH+为极小值时，V最大，上式的pH为最适pH 。 D．作图法求常数 与前一种体系的方法相似，按KmH+的表达式作图。 6.1.4.3 酶——底物复合物的解离体系 解离模式 B．速度方程 （推导过程略）
或
C．讨论 a． [H+]既影响VmH+，又影响KmH+ 。 b．当[H+]很大时，式中的
可以忽略不计，速度方程可写成
，此式与反竞争性作用的速度方程相似，这时[H+]起着反竞争性抑制剂的作用。 D．作图法求常数 按第一种体系的方法作图求常数。 6.2 温度对酶反应速度的影响 化学反应以分子运动为基础，分子的动能与温度的高低直接相关，所以温度的变化会影响酶反应速度。 6.2.1 酶反应的最适温度 在不同温度下测酶反应速度，可得出最适温度。但最适温度不是酶的特征常数，当温度升高时，除了V提高外，酶失活的速度也加快。所以短时间测定时，最适温度较高，长时间测定时，最适温度较低。 6.2.2 酶的热稳定性 大多数蛋白质在50～70℃出现可逆变性（但也与处理时间有关），70～80℃出现不可逆变性。 酶的耐热性质有遗传上的差异。RNase耐高温（＞100℃）。 可逆变性和不可逆变性是各种次级键被破坏的程度决定的。 酶的冷失活可能是亚基间的解聚或错位引起的。 6.2.3 升温使酶反应速度增加 酶反应与非酶反应相比，能降低活化能Ea 。 根据Arrhenius公式，化学反应速度常数与温度的关系可表示为：
，式中A为频率因子，它表示单位时间单位体积内分子的碰撞次数；Ea为活化能；k为反应速度常数。 对Arrhenius公式两边取对数得：
，
，
在温度T1时，
； 在温度T2时，
； 下式减上式得

， 式中的R = 8.314 J/mol/K 。 根据此式，若已知一个温度下的反应速度常数及活化能Ea，就可以求另一温度下的反应速度常数。若T2比T1高10℃，则
称为Q10（温度系数）。Q10大说明温度对酶反应速度的影响大，Q10小说明温度对酶反应速度的影响小。对于恒温动物来说，大部分酶的Q10约为2。 6.2.4根据温度效应求热力学常数 A．求活化能（Arrhenius作图法）
，
，
， ∵
， ∴

，

在不同温度下测（同一酶量的）Vm，以
对
作图，得一直线，直线的斜率＝
，Ea＝－2.303×8.314×斜率。 若是复合的反应过程，直线可能会变折线，这说明限速步骤在转折点发生了改变，不同的线段代表了不同的限速步骤，各自有不同的Ea。图C中左侧的正斜率线段是温度太高酶变性所致。
B．求解离基团的标准焓（Van’t Hoff作图法） 根据Van’t Hoff公式：
，式中K为基团的解离常数。
， 积分此式得

，
，

，
。 测不同温度下某基团的解离常数K，按上式以pK对
作图，得一直线，直线的斜率为
，
2.303×8.314×斜率。 6.3 酶的抑制作用和抑制作用动力学 由于某种物质与酶相互作用使酶活性下降叫酶的抑制作用，这种物质就是抑制剂。而由其他因素如加热造成的酶活性下降或丧失叫钝化作用。 6.3.1 酶活性抑制的两大类型 A．可逆抑制作用（reversible inhibition） 抑制剂与酶以非共价键结合，用透析、超滤或凝胶过滤等方法可以除去抑制剂，恢复酶活性。 B．不可逆抑制作用（irreversible inhibition） 抑制剂与酶以共价键结合，用上述物理方法不能除去抑制剂和恢复酶活性。 不可逆抑制剂分为专一性和非专一性两类。专一性不可逆抑制剂仅和活性中心的基团反应，非专一性不可逆抑制剂可以和酶分子各部位的基团反应，甚至可以和几种不同的基团反应。 6.3.2 可逆和不可逆抑制作用的判断 除了用物理方法可除去抑制剂恢复酶活性的鉴别方法外，还可以用动力学方法鉴别。 A．定量的抑制剂与一定量的酶溶液一起预保温，隔一段时间后，从中取出不同量的酶——抑制剂混合液，测其最大反应速度Vm，用Vm对所取混合液量作图。图中曲线1为对照。曲线2为不可逆抑制剂，因有一部分酶被抑制了，所以有活性的酶浓度下降，直线的斜率下降。曲线3为可逆抑制剂，取少量混合液时，在反应体积一定的条件下，混合液的稀释程度较大，酶被抑制的比例减少，相对活性较高；取较多混合液时，混合液的稀释程度较小，酶被抑制的比例较高，相对活性较低。 B．在反应系统中加入一定量的抑制剂，然后加不同的酶量测最大反应速度Vm。以Vm对酶量作图。图中曲线1为对照。曲线2为不可逆抑制剂，当酶量超过不可逆抑制剂的当量时，才开始出现酶活性，以后增加的酶不受不可逆抑制剂的影响，保持与对照相同的斜率。曲线3为可逆抑制剂。
， ∵
， ∴
，
，
，
，
无抑制剂时，
； 有抑制剂时，
。 由于在有抑制剂时，
小于1，所以Vm对酶量（[E]0）作图时，得一斜率较小的直线。 6.3.3 不可逆抑制作用 6.3.3.1 非专一性不可逆抑制剂的作用 下列几类试剂能够和酶蛋白中的一些侧链基团反应，形成共价修饰物： 酰化剂、烷化剂、含有活泼双键的试剂、亲电子试剂、氧化剂、还原剂等。 常见的非专一性不可逆抑制剂及被它们修饰的基团见下表： （表略） 非专一性不可逆抑制剂能与活性中心内外的基团反应，利用邹承鲁提出的尝试作图法，可以判断出（某种）必需基团的数目：在测定不可逆抑制剂作用过程中酶活性的剩余分数
的同时，测定被修饰基团的剩余分数
，根据
，按
＝1，2，3，……分别以
对
作图，成直线关系的
值即是必需的该种基团的数目。 6.3.3.2 专一性的不可逆抑制剂的作用 专一性的不可逆抑制剂分为Ks型和Kcat型两类。 A．Ks型不可逆抑制剂 此类抑制剂与底物结构相似，能与酶的底物结合部位结合，同时此类抑制剂上带有一个活性基团，可以和附近的相应基团反应，形成共价键。它们有结合专一性，但没有反应专一性，即也能与活性中心以外的基团反应。如果抑制剂与活性中心结合的亲和力大，与活性中心外结合的亲和力小，解离常数相差三个数量级以上，这时可以忽略对活性中心以外基团的修饰，有较大的应用价值。 修饰是否发生在活性中心，可用以下三种方法判断： 修饰程度与酶活性的下降是化学计量的，完全修饰后酶活性完全丧失。 底物、竞争性抑制剂有保护作用。 采用简便的方法使酶发生可逆失活，失活后不被修饰。 下结论时要综合分析，有时三个条件都满足了，仍有结论错误的可能。 B．Kcat型不可逆抑制剂 此类抑制剂既能与活性中心结合，又能被活性中心催化反应，反应后在抑制剂分子上产生活性基团，此活性基团再与活性中心的必需基团反应，产生共价修饰。这类抑制剂的专一性很高，有人称之为自杀性底物。 6.3.4 可逆抑制作用动力学 可逆抑制分为竞争性抑制、非竞争性抑制、反竞争性抑制和混合型抑制几种类型。 6.3.4.1 竞争性抑制作用（competitive inhibition） A．竞争性抑制模式 B．动力学方程推导 a．快速平衡法：
，
；
，
；


，


，
，
，

，
＝
。 b．稳态法： 有3种酶存在形式（[E]、[ES]、[EI]），就要写出两个微商等于零的方程式。
…………………①
………………………………………② 由式②得
，
，
……………③
……………………④ 由①得
，
，
， 将③式代入得
，

=
………………………⑤
， 将④⑤两式代入得

=
，
＝
。 c．King-Altman法：

，
，
，
，
＝
，
＝
C．讨论 竞争性抑制作用不改变最大反应速度，而是改变Km＇（表观Km），[I]越大则Km＇越大。 一个竞争性抑制剂对酶反应速度的抑制程度，当[S]固定时随着[I]的增加而加大，当[I]固定时随着[S]的增加而减小。 当[S]固定时，达到两种抑制分数所需的[I]浓度比为一常数，如
，
。 D．竞争性抑制作图法 双倒数作图法：在固定[I]时，
对
作图可得一直线，其纵轴截距为
，横轴截距为
；随着[I]的增大，直线的斜率增大，表观Km值Km＇也增大，但最大反应速度Vm不变。
=
。 b．Hanes-Woolf作图法：将双倒数式两边同乘以[S]得
=
， 在不同的[I]浓度下，直线的斜率不变，纵轴截距随[I]的增大而增大，出现一组平行线。
E．求竞争性抑制作用中的Ki值 双倒数式的斜率对[I]再作图： 根据双倒数方程
，在不同[I]下作多条直线，得到多个斜率。 斜率＝
， 斜率＝
。 以双倒数图的斜率对[I]作图，可得一直线，直线的横轴截距为
。
Km＇对[I]的再作图： 在不同的[I]下求得相应的Km＇值， Km＇＝
， Km＇＝
， 以Km＇对[I]作图，可得一直线，直线的横轴截距为
。 横轴截距的求法：
＝0，
，
c．Dixon法求Ki值： 将双倒数方程改写成
随[I]浓度变化的方程
，
，
…………………………………① 在一个固定的[S]下，改变[I]测得相应的V，以
对[I]作图可得一条直线，两个[S]所得的两条直线的交点的横坐标为
，纵坐标为
。多个[S]所得的多条直线同样交于这一点。证明如下：
当在两个[S]下得到的两条直线的纵坐标
相等时，有
=
，
，
，
，
（交点横坐标）。 将
代入①得
，
，
（交点纵坐标）。 在Dixon作图中，直线的斜率＝
，在不同的[S]下可以得到不同的斜率，以斜率对
作图，可得一通过原点的直线，这充分证明抑制剂为竞争性的。因为混合型抑制也能得到如图“竞争性抑制双倒数图的斜率对[I]的再作图”中的直线，但得不到“竞争性抑制Dixon作图斜率对
的再作图”中的直线。混合型抑制的图是 6.3.4.2 非竞争性抑制作用（non-competitive inhibition） A．非竞争性抑制模式 S和I各自独立地与酶结合，互不影响，只有ES能分解出产物。并且Ks = Ks＇，Ki = Ki＇。 B．动力学方程
=
C．讨论 在非竞争性抑制作用中，I只影响Vm，使之下降，但不影响Km 。 在个别酶反应中，ESI也能分解出产物，但速度较慢。在过量I和一定底物浓度下测酶反应速度，若ESI不能分解出产物，随着[I]的增加，V趋向于零；若ESI可以分解出产物随着[I]的增加，V趋向于一定值。 设残留活性分数为a，则
=
＝
， 此式说明a与[S]无关，并且Ki等于残留50%酶活性时的[I]。 若以抑制x % 酶活性所需的I浓度为 [I]x ，则
，
。 D．非竞争性抑制作图法 a．双倒数法作图：
， 式中
。 在固定[I]时，
对
作图可得一直线。直线的纵轴截距随[I]变化，等于
，[I]越大，
越小；直线的横轴截距不变，为
。 b．Hanes-Woolf作图法：
横轴截距为
。 E．求非竞争性抑制作用中的Ki值 a．双倒数式的斜率对[I]再作图： 斜率＝
＝
， 直线的横轴截距为
。
b．双倒数式的截距对[I]再作图：
＝
， 直线的横轴截距为
。 c．Dixon作图法： 由双倒数方程
，
，
以
对[I]作图，直线的横轴截距为
。 此Dixon直线的斜率＝
， 斜率＝
， 以斜率对
再作图，得一纵轴截距为
的直线，这与竞争性抑制作用不同，后者的直线通过原点。 6.3.4.3 反竞争性抑制作用（uncompetition inhibition） A．反竞争性抑制模式 在反竞争性抑制作用中，I只与ES结合，只有ES能分解出产物。由于I的存在促进了E和S的结合，所以称为反竞争性抑制。
B．动力学方程
=
C．讨论 反竞争性抑制既降低Vm（成为Vm＇），也降低Km（成为Km＇）。 在[I]一定时，随着[S]的增加，抑制分数也增加。证明如下：

=
＝
＝
＝
。 D．反竞争性抑制作图法 a．双倒数作图法：
，在不同的[I]下，可得一组平行直线。 b．Hanes-Woolf作图法：
=

E．求反竞争性抑制作用中的Ki值 a．双倒数方程纵轴截距的再作图： 纵轴截距＝
＝
，作直线图的横轴截距为
。 b．双倒数方程横轴截距的再作图： 先将横轴截距取相反数（取正值）。 横轴截距＝
＝
，作直线图的横轴截距为
。

c．Dixon作图法：
，当[S]无穷大时，横轴截距为
。 6.3.4.4 混合型抑制作用（mixed-type inhibition） A．混合型抑制模式 与非竞争性抑制相比，混合型抑制的α不等于1，而非竞争性抑制的α等于1。 B．动力学方程
C．讨论 a．混合型抑制剂既影响Vm（使之下降），又影响Km（使之上升或下降，取决于α的大小。当α>1时，Km升高；当α<1时，Km下降）。 b．当β＝1且α≠1时，抑制剂不影响Vm，只影响Km，这时类似竞争性抑制作用；当α＝1且β≠1时，抑制剂不影响Km，只影响Vm，这时类似非竞争性抑制作用。由于β一般为0 ≤β＜1，α≠1且α＞0，所以为混合型抑制作用。 D．混合型抑制作图法 双倒数作图：按β＝0。
， 在不同[I]下可以作出多条直线。
当
>1（即
>
）时，不同[I]下作出的这些直线的交点位于第二象限，交点坐标为（
）。当0<
<1（即
<
）时，交点位于第三象限，交点坐标同上，此时
为负值。 E．求混合型抑制作用中的
和
a．双倒数图的斜率对[I]再作图： 斜率＝
＝
斜率对[I]再作图的横轴截距为
，纵轴截距为
。 b．双倒数图的截距对[I]再作图： 截距＝
＝
截距对[I]再作图的横轴截距为
，纵轴截距为
。 c．Dixon作图法： 根据双倒数式整理得

以
对[I]作图，不同的[S]得到不同的直线，这些直线的交点坐标为（
）。当
>1时，交点位于第二象限；当0<
<1时，交点位于第三象限。 Dixon图的斜率＝
斜率＝
，此直线不通过原点。 6.4 酶活化动力学 6.4.1 酶的活化 本节所说的酶的活化指的是由某种物质与酶结合后能显著提高酶活性的现象，这种结合是可逆的。这种活化剂以金属离子为代表，常见的需Mg2+活化的酶是糖代谢中能作用于磷酰化底物的酶。 6.4.2 酶活化动力学 6.4.2.1 酶活化模式 活化剂对酶的活化有两种模式，一是活化剂与酶的某个调节部位结合，影响酶的构象，从而提高了酶活性；活化剂不存在时酶也有活性，但活性较低。二是活化剂A与底物S先形成络合物SA，再与酶结合，SA为酶反应的真正底物。常见的第二种情况是涉及到ATP的反应，其活化剂是Mg2+，真正的底物是MgATP2－。 下面讨论多种活化模式中的一种。 6.4.2.2 速度方程的推导 A．用[SA]表达速度方程
……………………① B．用游离[A]和[S]表达速度方程
，
， 将[SA]表达式代入①式得

……………………②
或
。 从上面两个式子可以看出，V对[S]和[A]的依赖关系具有对称性。 C．用S和A的总浓度表示速度方程 [S] = [S]0－[SA]，[A] = [A]0－[SA]，（∴ E很少，∵ ESA也很少，故[ESA]忽略不计） [S][A] =（[S]0－[SA]）（[A]0－[SA]） = [S]0[A]0－[SA] [A]0－[S]0 [SA]＋[SA]2 ＝[SA]2－（[A]0＋[S]0）[SA]＋[S]0[A]0 将
代入上式得 [S][A] =
－（[A]0＋[S]0）
＋[S]0[A]0
－

＋[S]0[A]0＝0 以
为自变量，此式为一元二次方程，解此方程得
=

=
在两个解中，有且只有一个符合题意，因为
≤[A]0 ，
≤
；又
≤[S]0 ，
≤
；所以较大的解应舍去，式中“±”应取“－”号。 将符合题意的解代入②式得
………………③ 从上式可以看出，V对于[S]0和[A]0的依赖关系也具有对称性。 6.4.2.3 讨论 a．当[A]0远大于KA时，[SA]=[S]0，这时可用①式作图求KSA。 以MgATP2－为真正底物的体系为例： 假设 [Mg2+]0 = 10－3mol/L， [ATP4－]0＝10－5mol/L， KA=10－5mol/L 。
， 设
，则
， 整理得
， 解此一元二次方程得
＝1.01×10－3mol/L ，
＝0.99×10－5mol/L 。 由于
>[ATP4－]0 ，舍去；所以
＝0.99×10－5mol/L ≈10－5mol/L。 b．在双倒数图中，随着[S]0的增加，
对
成直线，到[S]0≈[A]0时，图形开始弯曲；当[S]0 >>[A]0时，图形呈水平线，该线的延长线与纵轴的交点为
。当[S]0 和[A]0都很高时，可得出
和
。 6.5 酶与配体解离平衡常数的测定 6.5.1 平衡透析法 由一片半透膜将一个小室隔成两半，半透膜仅允许配体透过而不允许酶透过。在膜的一侧加酶和配体，另一侧仅加配体，配体是同位素标记的。经过一段时间平衡后，测定膜两侧的配体浓度（可用液体闪烁计数仪测定），可计算出解离平衡常数。 设加酶和配体一侧测得的配体浓度为
，仅加配体一侧测得的配体浓度为
，加的酶浓度为
，则

， 式中
为与酶结合的配体浓度
。 在小室体积仅20μl，取3份样品，每份样品5μl就可以测定。该装置至少需要平衡1～2小时，所以不能用于不稳定的酶和配体。 6.5.2 过滤分析法 许多蛋白质（与任何一种缓慢解离的结合配体一起）可以结合在硝酸纤维素滤膜上，而游离配体不会被阻滞。分别测定滤膜上和滤液中配体的量，同上式可以计算出Ks 。 6.5.3 凝胶过滤平衡 酶和配体的分子量一般差别较大，用凝胶过滤层析的方法可使二者分开。先用含一定浓度的配体溶液（平衡溶液，也是加样溶液和洗脱溶液）平衡柱中层析介质（如Sephadex），将加有酶的样品上样，再用洗脱溶液洗脱，可得如下洗脱曲线图。配体是放射性标记的，洗脱曲线记录的是放射性强度（即配体量）。先出来的一个峰是与酶结合的配体峰，后出来的一个谷是样品中部分配体被酶结合后剩余的配体量。这样可知与酶结合的配体量（可换算成浓度）和配体的原浓度（即加样溶液中的配体浓度）。实验成功的标志是峰和谷的面积相等。此法适用于配体分子量较大，不能透过半透膜的情况。但缺点是要使用大量的配体。 6.5.4 光谱法 当配体在与酶结合前后有吸收光谱的变化或荧光的变化，可用光谱法测定解离平衡常数，还可以测定一分子酶可以结合几分子的配体。下面以配体与酶结合后产生荧光为例：酶液中酶的浓度应至少比解离平衡常数大10倍，逐渐滴加配体，同时测定荧光，可得下图，低浓度配体时荧光曲线可作一条直线，高浓度配体时荧光曲线成为水平线，两线相交处的横坐标为配体结合的当量数（即一分子酶结合几分子配体）。图中纵坐标也可以是[△荧光强度]或[△光吸收x nm]。根据弧线处的纵坐标也可算出解离平衡常数。