第五章 酶催化动力学基础 5.1 引言 酶催化动力学主要是研究各种因素对酶促反应速度的影响、酶促反应的规律及反应历程。影响酶促反应速度的因素包括[S]、[E]、[P]、[I]、[A]、pH和温度等。本章重点讨论[S]对酶促反应速度的影响，并且介绍一些基本概念，和简单体系的动力学方程的推导。 5.2 反应级数和速度常数 5.2.1 反应级数 化学反应的级数就是动力学方程中影响反应速度的各反应物浓度项上的指数之和。 5.2.1.1 零级反应 反应速度与底物的浓度无关，称为零级反应。当[S]大大高于[E]时，可认为是零级反应。  （4.1），  （4.2）。 积分（4.2）式得，  （4.3）。 也即，故[P]与t成正比，k0为该零级反应的速度常数，它表明单位时间底物的减少量或产物的生成量，因次为“C·t－1”。 零级反应的半寿期（即一半底物转化成产物所需的时间）可以由 代入式（4.3）求得  ，  ，  （4.4）。 与[S]0成正比，与k0成反比。 5.2.1.2 一级反应 反应速度与底物浓度成正比（单底物反应），称为一级反应。当[E] 〉〉[S]时为一级反应。  （4.5），  （4.6）。 式中k1为一级反应速度常数。将式（4.6）积分得 ， ， 。 即  （4.7）。 将t对作图可得一直线，斜率为， k1的因次为“t－1”。 将代入式（4.7）可以得出  ，  （4.8）。 在一级反应中，与k1成反比，而与底物浓度无关。 5.2.1.3 二级反应 反应速度与两个反应物的浓度成正比，称为二级反应，这种反应可以是两个相同的反应物反应生成产物（2S → P），也可以是两个不同的反应物反应生成产物（A＋B → P）。 先看第一种情况（2S → P）：  （4.9），  （4.10）。 式中k2为二级反应速度常数。将（4.10）积分得 ， ，  （4.11）。 t对作图可得一直线，斜率k2，截距。K2的因次为“C－1·t－1”。 将代入（4.11）可求出  ，  ，  （4.12）。 与k2及[S]0都成反比。零级反应中[S]0越大，也越大；二级反应中[S]0越大，反而越小；一级反应与[S]0无关。 再看第二种情况（A＋B → P）： ，如果[A] = [B]，则与第一种情况的全部推导和结果相同。 如果两个反应物中，[SA]比[SB]大得多，即[SA] 〉〉[SB]，反应中[SA]下降的相对值很小，可以认为保持恒定，此时反应速度只与[SB]成正比，其动力学方程式与一级反应的相同，其反应的速度常数用kobs表示，称为表观反应速度常数。 这种反应表面看起来是一级反应，但实际上是二级反应，故称为假一级反应，kobs在这里也是假一级反应速度常数。 当[SA] 〉〉[SB]时，有 ，式中 （4.13）。 在恒定[SB]和不同的[SA]时测定反应速度，得出不同[SA]时的kobs，再按（4.13）作图，斜率即为k2。 如果[SA]和[SB]相差不大，情况比较复杂，这里不作讨论。 5.3 酶催化反应动力学方程 5.3.1 反应初速度的测定 在研究酶反应动力学时，一是改变各种因素（如[S]、[I]、pH等），二就是测酶反应速度。随着酶反应的进行，底物浓度逐渐下降，产物逐渐积累，酶反应速度也会逐渐变小。为了排除底物和产物浓度变化对酶反应速度的影响，人们采用酶反应的初速度作为衡量的指标。 从理论上来说，作出反应时间对反应物变化量的曲线，从近0处作曲线的切线，则切线的斜率代表初速度。但实际上切线无法作准确。 实际使用的初速度测定方法有以下几种： 5.3.1.1 高底物浓度测定法 高底物浓度测定法即零级反应近似法。它采用[S]＞10Km的条件，在中，Km可以忽略不计，V≈Vm，即与零级反应近似，V为一恒定值，此法必须在无高底物浓度抑制时才适用，为了避免产物抑制，应在反应的初期测定。 5.3.1.2 低底物浓度测定法 低底物浓度测定法即一级反应近似法。它采用[S]＜Km的条件，在中，分母中的[S]可以忽略不计，，在不同[S]时测定V，以V对[S]作图，直线部分的斜率为。在直线部分，[S]乘以得V。 5.3.1.3 使用不同酶量的测定法 在加不同酶量的情况下测反应速度，作出产物生成量对反应时间的图，然后以酶量对反应速度作图，此反应速度为反应了不同时间的速度平均值，以不同的反应时间分别作曲线，在直线范围的酶量和反应时间对应的反应速度可看作初速度。 5.3.2 [E]对反应速度的影响 在[S]过量的情况下，V对[E]成正比；而在[E]一定时，[S]与V成双曲线关系。  若酶催化单底物反应机理为E＋S E＋P，则V = k [E][S]，也就是V与[E]及[S]都成正比，但实际情况不是这样，这个结果符合以H+为催化剂的情况。 若假设底物和酶先形成ES复合物，再由ES转化成产物，其机理可写成 E＋S ESE＋P 并假设第一步可迅速平衡，第二步较慢，是限速步骤。根据这些假设可推导出动力学方程式： ，在此式中，V与[E]0成正比，而与[S]成双曲线关系，符合实际情况，故假设的机理正确。 5.3.3 单底物——单产物反应 5.3.3.1 酶——底物复合物的存在 经过电子显微镜观察、x光衍射和动力学方法研究，证实了确实有ES复合物存在。 5.3.3.2 平衡学说（Henri, Michaelis和Menten 方程） 1902年Henri和Brown提出了S＋E ES —→E＋P学说；1913年Michaelis和Menten完善了这个理论，他们的第一步是快速可逆的平衡，第二步慢，为限速反应。 E＋S  ES E＋P 在推导动力学方程时，有几点假设：①第一步迅速平衡，第二步慢，即k2〈〈 k－1；②[S] 〉〉[E]，[S] 〉〉[ES]；③酶以E和ES两种状态存在。 设Vf为E与S结合的速度，Vr为ES解离的速度，则 Vf＝k1 ( [E]0－[ES] )( [S]－[ES] )， Vr＝k－1 [ES]， ∵ 平衡时Vf＝Vr ， ∴ k1 ( [E]0－[ES] )( [S]－[ES] )＝k－1 [ES] ， 又∵ [S] 〉〉[ES]， [S]－[ES]≈[S]， ∴ k1 ( [E]0－[ES] ) [S]＝k－1 [ES]， ，解出 [ES] 得  ， 令Ks＝， 则  ， 由于V = k2 [ES]，代入前式得。因为当所有的E都成为ES时，可达最大反应速度，即Vm = k2 [E]0 ，所以  ，这就是米氏方程。 5.3.3.3 稳态学说（Briggs-Haldane修正公式） 1925年，Briggs和Haldane提出稳态学说。他们认为，许多酶催化反应的k2很高，k2不仅不特小于k－1， 而且远比k－1大，即ES分解成E和P的速度比解离成E和S的速度快。该学说认为，在反应进行了一段很短的时间后，[ES]由0增加到一定数值，然后保持不变，即达到稳态水平，这时生成ES的速度与ES分解和解离的速度相等。 ES生成的速度=k1[E] ( [S]－[ES] )≈k1[E][S]， ES解离和分解的速度＝＝k－1[ES]＋k2[ES] = (k－1+ k2) [ES] ， 在稳态时，， 即k1[E][S] = (k－1+ k2) [ES] ， ∵ [E] = [E]0－[ES]， ∴ k1([E]0－[ES])[S] = (k－1+ k2) [ES] ， k1[E]0[S]－k1[ES][S] = (k－1+ k2) [ES] ， k1[E]0[S] = k1[ES][S] +(k－1+ k2) [ES]， k1[E]0[S] = (k1[S] + k－1+ k2)[ES] ， [ES] = ， 设Km =  ， [ES] =  ， 将V = k2[ES] 代入得 ，  。 平衡法与稳态法所得的动力学方程形式完全一样，只是Ks和Km的区别，Ks =，Km =；当k－1 〉〉k2时，k2可以忽略不计，Km转变成Ks 。 5.3.3.4 Haldane关系公式 1930年，Haldane提出了一个关系公式。考虑到酶催化的反应有一些是可逆反应：  正反应速度Vf＝ ， 正反应的米氏常数Kmf = ， 逆反应速度Vr＝，逆反应的米氏常数Km r = ， 当可逆反应达到平衡时，ES的解离达到平衡，即k1[E][S]＝k－1[ES]，， ES的分解也达到平衡，即k2[ES]＝k－2[E][P]，， ∴ ＝， ＝Keq 。 Keq为可逆反应平衡时的平衡常数，也是平衡时产物P和底物S的浓度比。 ， ， ＝Keq （Haldane关系公式） 由此可见，正逆反应的Vm和Km都不同，但最终的Keq是相同的。 5.3.3.5 有两个中间复合物时的米氏方程 ①用稳态法推导  （推导略） V= ②King-Altman对动力学方程的推导 King-Altman根据矩阵原理，采用图像的方法简化了方程的推导过程。具体方法如下： 写出反应历程并安排成封闭的几何图形； 写出所有的n-1线图形，图形必须涉及全部的酶存在形式；  按照King-Altman图形，写出每种酶形式的浓度和总酶浓度之比的代数式； ①对于E： 箭头都指向E。 含有[E]的各项常数和＝k－1k－2＋k－1k3＋k2 k3 = a ； ②对于ES： 箭头都指向ES。含有[ES]的各项常数和＝k1k－2[S]＋k1k3[S]＋k－2k－3[P]＝b ； ③对于EP： 箭头都指向EP。含有[EP]的各项常数和＝k1k2[S]＋k－1k－3[P]＋k2k－3[P]＝c ； 则各种酶形式的浓度与总酶浓度之比为 ， ， 。 d．写出速度方程， ， 将[EP]和[E]代入上式得  ， 5.3.3.6 米氏方程的积分形式 米氏方程是一个微分方程， 或 ，根据米氏方程采用作图法求Vm和Km时，要测不同[S]下的反应初速度，要求反应转化掉的S不超过[S]0的5%，但有时P太少不易检测。采用积分速度方程，就可以使用不同反应程度的数据，例如可以把10%～90%的[S]0转变成P这个范围内的测定数据都用于作图，以求得Vm和Km 。但还有一些限制条件，如无产物抑制，Keq很大等。 ， ，    ，  或 。 这样测定几个不同时间（t）的[P]或[S]，以对作图，得到  按此法作图，从一个比Km大几倍的[S]0（如 [S]≥10Km ）开始，并且使反应进行到[S]显著低于Km（如 [S]＜0.1Km ＝时，都能得到很好的分布点。 5.3.3.7 米氏方程所作图的特征 在较广范围[S]的变化中，V随[S]的变化而变化，并表现出三个性质不同的动力学区域。 当[S]＜0.01Km时，V对[S]基本上是直线关系，反应速度与[S]成正比，这对底物来说为一级反应，对酶来说也是一级反应。 当[S]＞100Km时，反应速度不依赖于[S]，V与[S]无关，这对底物来说是零级反应，但对酶来说是一级反应。 当[S]＞0.01Km和[S]＜100Km时，为混合级动力学区域。 A．一级反应动力学 当[S]＜0.01Km时，米氏方程中的[S]可以忽略不计，所以 ， 而一级反应速度是与[S]成正比的，即 ， 反应速度又是单位时间底物S的减少率，即  ， 从这3 个式子可以得出下列关系： 。 一级反应速度常数k的物理意义是：在任何时间t时，现存底物在单位时间内的转化比值。 如果用求k值不方便时，可用下列方法求k值： a．积分法求k值：，，，，  。 以lg [S] 对t作图可得一直线，其斜率为。  b．半寿期法求k值：一半底物反应生成产物所需的时间为半寿期。 当t＝时，  ， 由得 ， ，按上图求出，即可求出k值。 B．零级反应动力学 当[S] 〉〉Km时， ，  。 5.3.3.8 米氏方程的意义 我们讨论米氏方程的几个特点及应用。 A．反应速度与底物浓度之间的关系 a．V和[S]的关系为一双曲线： 将米氏方程整理可得双曲线方程的标准形式。   当[S]为正值时，此式的图形是双曲线位于第四象限的一支。与标准双曲线（）相比，（虚线是原轴）米氏方程的纵轴右移了Km，横轴下移了Vm。 b．特定的V和[S]值： 当[S] 〉〉Km时，V = Vm ，这是酶被底物全部饱和时所能达到的最大反应速度。 当[S]＝Km时，V=Vm ，Km可定义为反应速度达到最大反应速度一半时的[S]。 当[S]〈〈 Km时，，此方程有两个含义。一是在[S]很低时，V和[S]呈直线关系；二是为二级反应速度常数，这个常数可作为比较催化效率的一个特征常数。在同系列底物中，最大的是该酶的最适底物。 c．任何两个Vm分数时的[S]之比为常数： 当V = 0.9Vm时，，[S]＝9Km ； 当V = 0.7Vm时，，[S]＝Km ； 当V = 0.1Vm时，，[S]＝Km ； ， 。 B．Km的意义 Km是酶的特征性常数，但必须固定在某一反应条件下（pH、温度、离子强度等）才能保持不变。若一个酶可以催化多种底物反应，则对不同底物有不同的Km值。 a．计算V达到Vm的百分率： ，已知Km和[S]，可知反应速度达到最大反应速度的百分率。 b．要达到一定的，需要多大的[S]： c．寻找天然底物：找Km值最低或最大的底物为天然底物。如黄嘌呤氧化酶（Xanthine oxidase）既可催化黄嘌呤氧化，又可催化醛的氧化，因其Km值分别为0.05mmol/L和10mmol/L数量级，故将此酶命名为黄嘌呤氧化酶。木糖异构酶（Xylose isomerase）也能催化D-葡萄糖异构成D-果糖，但因其催化D-木糖转变成D-木酮糖的Km值较低，故称为木糖异构酶。 d．判断在细胞内酶是否受[S]的调控： 了解酶的Km和细胞内的[S]可以推测该酶在细胞内是否受[[S]的调控。当[S] 〉〉Km时，[S]的稍微变化不会使V有多大变化；反之，如果[S]〈〈 Km，则V对[S]的变化十分敏感。 己糖激酶同工酶Ⅳ存在于肝中，对葡萄糖的Km＝10mmol/L，而己糖激酶同工酶Ⅰ～Ⅲ存在于多种组织中（尤其是肌肉中），它们对葡萄糖的Km＝0.04mmol/L。在禁食状态下，血糖浓度大约为3mmol/L，这时同工酶Ⅰ～Ⅲ的反应速度已达到Vm（98.7%Vm），而对同工酶Ⅳ只有23%Vm。当摄入食物后血糖水平达到约9.5mmol/L，这时同工酶Ⅰ～Ⅲ的反应速度仍然是Vm（99.6%Vm），而同工酶Ⅳ的V达到49%Vm。这说明同工酶Ⅳ受血糖浓度的调控，而同工酶Ⅰ～Ⅲ不受此因素调控。由此可见，肝中的己糖激酶同工酶Ⅳ能够在血糖浓度升高时，使糖原合成的速度加快。 e．判断在细胞中酶催化反应的主要方向： 根据酶催化正反两个方向反应的Km及体内两向的[S]，可以判断体内反应进行的方向。 f．寻找限速步骤： 根据代谢途径中各步反应酶的Km和相应的[S]，推测限速步骤。 g．作为判断同工酶种类的依据： 同工酶对同一底物的Km往往不同，而具有同工多形性的非同工酶（蛋白质修饰方式不同）对同一底物的Km常常是相同的。据此可以判断不同来源催化相同反应的酶是否同工酶。 h．判断酶和底物亲和力的大小： 当k－1 〉〉k2时，Km＝Ks =， Km越小，表明酶与底物的亲和力越大。为酶与底物的亲和常数。 C．Vm及k2的意义 当[S] 〉〉Km时，Vm＝k2[E]0，可通过k2＝来求k2。这时的反应为假一级反应，k2是表观一级反应速度常数。若[E]0用活性中心当量表示，则k2表示每个活性中心在单位时间内催化的底物分子数，即转换数。k2又称催化常数，用kcat表示。 5.3.3.9 Km和Vm的求法 A．Lineweaver-Burk作图法（双倒数作图法） ， 两边取倒数得 。 以对作图，在一定范围内可得一直线。直线的纵轴截距为，横轴截距为。 B． Hanes-Woolf作图法 给双倒数式两边同乘以[S]得 。 以对[S]作图，在一定范围内可得一直线。 直线的纵轴截距为，横轴截距为－Km 。 C．Eadie-Hofstee作图法 ， KmV＋[S]V = Vm[S]， [S]V = －KmV＋Vm[S]，。 以V对作图，在一定范围内可得一直线。直线的纵轴截距为Vm，横轴截距为。 5.3.3.10 偶联酶反应中的动力学问题 A．用偶联酶的实验问题 若被测酶反应的产物不便于测定，可偶联一个酶，。若E1和E2的反应条件差别较大，可在E1反应一段适当时间后，终止反应（加热等）。然后改成适合E2反应的条件，加入E2和必须的辅底物，反应适当时间使S全部转化成P，再测定P的量。问题是第二阶段要反应多久，才能使最大限度的S转化成P。 从“5.3.3.6米氏方程的积分形式”中的积分方程可得 ，式中和分别为偶联酶的最大反应速度和偶联酶对S的米氏常数，[S]0为第一步反应的产物浓度，也是第二步反应的初始底物浓度。 从理论上计算，当[S]下降到很低时，反应为一级反应，若要使100%的S转变成P，需要无限长的时间。假如我们确定要使98%的S转变成P，这个误差是可以接受的。 设KmE2 = 2×10－4mol/L，VmE2 = 5×10－5mol/L/min（等于0.05国际单位/ml的酶量），第一步反应积累的[S]0＝1×10－4mol/L，则将98%的S转变成P所需的时间为： ＝17.6 min≈18 min 利用这个积分方程，我们也可以先确定反应时间，再计算需要加多少酶。 VmE2与酶量的换算关系：1mol/L·min＝1mmol/ml/min =1000μmol/min/ml =1000国际单位/ml * 如果[S]0〈〈 KmE2，那么第二步反应是一级反应，这样只需测出第二步反应的初速度，即可根据下式计算出[S]0。 ≈，  B．偶联反应的动力学 若E1和 E2所需的反应条件相似，互相不干扰，就可以将这两个反应同时进行，在达到稳态后，[S]不变，记为[S]ss（steady state），这时第二步反应的速度与第一步反应的速度相等，所以只要测出E2的反应速度即可知E1的反应速度。 为了能够用上述方法测定，需要满足以下两个条件： a．第一步反应必须是零级反应，并且不可逆。 b．第二步反应必须是一级反应，并且不可逆。 当[A]0 〉〉KmE1时，第一步反应可以认为是零级反应；第二步反应连续地消耗S，S的浓度最大达到[S]ss，当[S]ss很小时，可以认为第一步反应不可逆。 用充分过量的E2，可使[S]ss〈〈 KmE2，这时第二步反应为一级反应；若E2反应的平衡远远向右（Keq很大）或E2反应的辅产物被连续地移去（生成气体、沉淀等），或反应只进行很小的程度，E2的反应可以认为不可逆。在这些条件下，经过一个短时的延迟期，体系将达到稳态。 E1反应为零级反应，反应速度与A的浓度无关，V1 = k1 ；E2反应为一级反应，在稳态时反应速度与[S]ss成正比，V2＝k2[S]ss ；稳态时V1=V2，k1＝k2[S]ss，所以[S]ss＝。 如果E1加倍，则第一步反应速度V1加倍，根据稳态条件，V2也加倍；而V2＝k2[S]ss，所以 [S]ss也加倍。另一方面，如果E2加倍，由于V1没变，根据稳态条件，V2也不会变；E2加倍，k2也会加倍，所以[S]ss减半。因此一旦有充分过量的E2存在，E2的变化不影响V2，V总＝V1=V2。E2的使用量可通过试验取得，也可用McClure于1969年提出的方法计算而得。