绪 论
分析化学理论
应用于皮革生产
基本的分析方法
皮革生产中的化学分析方法和物理检验技术
皮革理化分析
过程控制分析
皮革成品分析
原材料分析
操作液分析
废水分析
化学组分的分析
物理 -机械性能的分析
一、皮革理化分析的任务和作用
标准化
产品质量
降低成本
使用原材料
控制工艺条件
新材料、新工艺、新产品
三废治理
提
供
数
据
二、内容安排
皮革生产过程控制
原材料：酸、碱、盐、酶
操作液：铬鞣液、灰液
废 水：铬、硫,COD
三、皮革理化分析的特点
1,准确度属于工业分析的范畴。
2,由分析对象决定取样方法。
3,尽可能在短时间内完成。
工业分析的公差范围
被测组分含量 (﹪ ) 公差 (用相对误差来表示 )
80~90(99) 0.4~0.3(0.1)
40~80 0.6~0.4
20~40 1.0~0.6
10~20 1.2~1.0
5~10 1.6~1.2
1~5 5.0~1.6
0.1~1 2.0~5.0
0.01~0.1 50~20
四、皮革分析的学习方法和基本要求
实践性很强,2/3实验学时
要 求
实验前：予习，订好实验计划
实验中：观察、思考、记录
实验后：总结、报告
实验报告要求
目的
原理
试剂及仪器
实验操作
记录及数据处理
计算及结果
讨论
实验室要求
1,按时到，遵守实验室纪律；
2,不抽烟、唱歌、串门、打闹；
3,东西带齐：钥匙、课本、笔记本、实验记录本
预习报告、实验报告；
4,实验前考察：提问、抽察；
5,打扫卫生。个人卫生：整理仪器、擦桌子；
值日卫生：扫地, 拖地, 收拾仪
器药品, 洗水池等 。
Na2S含量的测定
一、概述
二、高铁氰化钾法测定原理
三、试剂
四、操作
五、计算
六、讨论
一、概述
1,Na2S的性质
2,Na2S在制革生产中的作用
3．测定意义
1,Na2S的性质
Na2S M=78.05 粉粒状
Na2S·9H2O M=240.2 无色或微紫色棱柱形晶体
Na2S + 2H2O ═ NaOH + NaHS
强碱性,硫化碱, 臭碱, 火碱
Na2 S + 2H+ ═ 2Na+ + H2S
有毒而易燃
Na2 S + 2O2+ H20 ═ Na2S2O3 + 2NaOH
2,Na2S在制革生产中的应用
灰 -碱法或碱 -碱法脱毛：
R-S— S-R1 + 2Na2S → R-SNa+R1-SNa + Na2S2
Ca（ OH） 2 + 2NaHS → Ca（ SH） 2 + NaOH
R-S-S-R1 + Ca（ SH） 2 → 2R-SH + CaS + S↓OH
-
3,Na2S含量的测定及意义
（ 1） 原材料
（ 2） 脱毛浸灰液
（ 3） 脱毛废液及废水
二、高铁氰化钾法测定原理
K3[Fe（ CN） 6]为滴定剂
Na2[Fe（ CN） 5（ NO） ]为指示剂
碱性介质中
先预滴定，再后加指示剂精确滴定
1．化学反应原理
S + 2e OH- S2- E0= -0.48 V
S + 2H+ + 2e H2 S E0= 0.141V
K3[Fe（ CN） 6]/ K4[Fe（ CN） 6] E0= 0.36V
ΔE01=0.36-(-0.48)=0.84V
ΔE02=0.36-0.141=0.219V
Na2S + 2K3[Fe(CN)6] OH- S↓ + 2NaK3[Fe(CN)6]
还原剂 氧化剂
氧化 -还原滴定指示剂
（ 1） 氧化 -还原指示剂
如：邻菲罗啉
（ 2） 指示剂与氧化剂或还原剂显色
如：淀粉
（ 3） 自身指示剂
如,KMnO4
2．指示原理
Na2S + Na2[Fe(CN)5(NO)]
(CN)5
Na4 Fe
N=O
S2-
紫红色络合物紫红色络合物
颜色变化
深紫色 → 浅紫 → 乳白色中透紫
→ 几乎乳白 → 乳黄
过量半滴的 K3[Fe（ CN） 6]
终点前的颜色
紫红色络合物
乳白色 S
乳
白
色
中
透
紫
终点颜色
过量半滴的
K3[Fe（ CN） 6]
乳白色 S
乳
黄
三、试剂
1,0.1mol/L NaOH水溶液
2,0.1000mol/L K3[Fe（ CN） 6]标准溶液
3,0.4%的亚硝酰铁氰化钠水溶液
1000ml32.9250g K3[Fe（ CN） 6]
1．预滴定
50ml H2O
5ml0.1mol/L NaOH
10或 25ml试液
1ml指示剂
四、操作
250ml三角瓶
K3[Fe（ CN） 6] 乳黄 V
1深紫色
2．精确滴定
50ml煮沸过的 H2O
5ml0.1mol/L NaOH
10或 25ml试液
滴加 K3[Fe（ CN） 6] (V1-0.5)ml
1ml指示剂
紫色
K3[Fe（ CN） 6]
乳黄
注 意
1．终点的观察；
2．滴定应迅速；
3．指示剂的使用；
4．加液次序。
五、计算
Na2S + 2K3[Fe(CN)6] OH- 2S↓ + 2NaK 3[Fe(CN)6]
1mol Na2S 2mol K3[Fe（ CN） 6]
（ M× V） Fe3+
Na2S（ g/L） = —————— × 78.05
2 × V样
六、讨论
1．介质选择
2．为什么进行预滴定，再精确滴定？
3．对本方法的评价
1,为什么选择碱性介质？
（ 1） E0 S/S2-在碱性介质电位低
在 OH- 中,E0 = -0.48 V
在 H+中,E0 = 0.141V
（ 2） 能斯特方程
S2- + [Fe（ CN） 6]3- → S ↓ + [Fe（ CN） 6]4-
（ 2） 能斯特方程
0.059 [S]
E = E0 + ———— lg ———n [S2-]
[S2-]↑ E ↓ 对反应越有利
[S2-]↓ E ↑ 对反应越不利
在 H+中,S2- + 2H+ → H2S ↑
[S2-]↓ 不利于反应
H2S有毒
（ 3） S2- 极易水解
S2- + H2O ═ HS - + OH-
Kh = KW/ Ka2
=（ 10-14） /（ 7.1× 10-15 ）
= 1.41
加碱 [S2-]↑ E↓ 有利于反应
（ 4）碱性介质是 K3[Fe（ CN） 6]的安全介质
K3[Fe（ CN） 6] + 6H+ 3K+ + Fe3+ + 6HCN↑
剧毒2．为什么要先预滴定，
再后加指示剂精确滴定？
（ 1）缩短滴定时间
（ 2）缩短紫色络合物生成时间
3．对本方法的评价
优点：快速,准确
缺点：微量分析误差大, 有机物干扰
Na2S含量测定思考题
1．如何配制 0.1mol/L的 K3 [Fe(CN)6]标准
溶液?
2．请设计固体 Na2S含量的测定方案，并通
过计算说明。
蛋白酶的分析
一、概述
二、测定原理
三、试剂
四、操作手续
五、计算
六、注意事项
一、概述
1．什么是酶？
2．影响酶催化反应的因素
3．什么是酶的活力?
4．测定意义
1．什么是酶？
生物催化剂
特殊催化功能的蛋白质
酶的特性,
（ 1）催化速度快
（ 2） 作用有专一性、选择性
（ 3）化学本质是蛋白质
2．影响酶催化反应的因素
底物浓度
PH值
温度
时间
（ 1）底物浓度
V
Vmax
底物浓度 C
C0
饱和浓度
（ 2） PH值的影响
OD
PH
PH最适
酶的分类
酸性蛋白酶
3350 PH最适 =2～ 4； 7401 PH最适 =3.0
中性蛋白酶
1398 PH最适 =7～ 7.5； 166 PH最适 =7～ 8
碱性蛋白酶
2709 PH最适 = 9 ～ 11； 209 PH最适 =9.5～ 11
（ 3）温度的影响
OD
T（ ℃ ）
T最适
（ 4）作用时间的影响
Q（反应物的消耗量或生成物的生成量 )
t0 t
结 论
酶催化反应
在反应初速度时间内
最适温度
最适 PH
饱合底物浓度
在最大活力处比较
3．什么是酶的活力?
蛋白酶的活力
酪氨酸的微克数 1g酶粉或 1ml酶液 ?每分钟
4．测定意义
酶的活力会下降
酶的催化能力强
二、测定原理
酪蛋白 酪氨酸
显色剂
比色
酶催化
条件
1．酶催反应
条件,底物浓度 温度 PH 时间
选择,C0 T最适 PH最适 t0
措施,C≥ C0 恒温水浴 缓冲溶液 t= t0
例子,537
0.5%酪蛋白 40℃ 3.0 10min
例子,1398
0.5%酪蛋白 40℃ 7.5 10min
例子,2709
0.5%酪蛋白 40℃ 10 10min
2．显色
Na2WO4
Na2MoO4
H2O
H3PO4 福林试剂 → 亮金黄色
HCL
Li2SO4
Br2
显色剂
显色反应
福林试剂 + 酪氨酸 OH- 蓝色物质
HO — —CH2—CH—COOH
还原性 NH2
钼蓝 +钨蓝
3．朗伯 -比尔定律及其应用
E —— 吸光度
A —— 消光值
OD —— 光密度
E = K·Ｃ ·L
= lg（ I0/I）
= K′· C
T = I I0
透光率
入射光强度 I0
有色真溶液
透过光强度 IC
L
朗伯 -比尔定律的应用
[X] → [RX] → OD
[X] OD
OD=K·C组分
注 意
① 选择 λ max
λ max =680nm
② OD值的范围
OD=0.2～ 0.6
4．制作标准曲线
酪氨酸浓度 C OD
C1 OD1
C2 OD2
C3 OD3
··· ···
Cn ODn
福林 —酚法测定蛋白酶活力
方法要点
配制系列浓度的酪氨酸标准溶液，在一定条
件下（ T,PH,t）与福林试剂显色后，测定光密
度 OD值。绘制标准曲线。精称酶制剂，配成适当
浓度的溶液。以酪素为底物，在一定温度,PH下
与上述酶液作用一定时间，用三氯醋酸终止反应,
并使未水解的酪素沉淀，过滤，移取滤液，加入
碳酸钠调节 PH为碱性，再加入福林试剂，显色后
测定光密度，与标准曲线比较，计算出被测酶制
剂的活力。
三、试剂
10﹪ CL 3CCOOH 水溶液
0.55mol/L碳酸钠溶液
缓冲溶液
福林试剂 显色剂 一种杂多酸
磷钼酸 H3[P（ Mo3O10） 4]
磷钨酸 H3[P（ W3O10） 4]
福林试剂的配制
Na2WO4·2H2O 100g
Na2MoO4·2H2o 25g Li2 SO4 50g
H2O 100ml 10hr +
85﹪H 3PO4 50ml H2O 50ml
浓 HCL 100ml
混匀 + 溴水 15`
冷却 → 黄色 → 过滤
金黄色溶液
回流
Δ
Δ
(1)柠檬酸 —柠檬酸钠缓冲溶液
PH=3.0
A液,0.1mol/L柠檬酸
21.01g C6H8O7·H2O → 1000ml
CH2—COOH
HO—C —COOH
CH2—COOH
B液,0.1mol/L柠檬酸纳
29.4gNa3C6H5O7·2H2O → 1000ml
用时,A∶B= 18.6∶ 1.4混合
柠檬酸 —柠檬酸钠溶液的 PH计算
弱酸 —弱酸盐缓冲体系
PH = Pka1-lg（ C酸 /C盐 ）
= 3.13- lg（ C酸 /C盐 ）
柠檬酸,
PKa1 = 3.13
PKa2 = 4.76
PKa3 = 6.40
（ 2） 0.02mol/L的磷酸缓冲溶液
A液,0.2mol/L NaH2PO4溶液
31.2g NaH2PO4·2H2O → 1000ml
B液,0.2mol/L Na2HPO4溶液
71.7g Na2HPO4·12H2O → 1000ml
① PH=7.2的磷酸缓冲溶液
A液 28ml
B液 72ml 1000ml
H2O
② PH=7.5的磷酸缓冲溶液
A液 16ml
B液 84ml
H2O 1000ml
磷酸盐缓冲溶液 PH值计算
弱酸 —弱酸盐缓冲体系
PH = PKa - lg（ C酸 /C盐 ）
[H2PO4-]
= 7.21-lg ————
[HPO4=]
Ka2 = 6.17× 10-8
（ 3）硼砂 —氢氧化纳缓冲溶液
PH=10
A液,0.055mol/L Na2B4O7 ·8 H2O
19g Na2B4O7 ·8 H2O 1000ml
B液,0.2 mol/L NaOH
8g NaOH 1000ml
A液 50ml
B液 43ml
H2O 200ml
硼砂 —氢氧化纳缓冲溶液的 PH计算
弱酸 —弱酸盐缓冲体系
Na2B4O7 + 7H2O ═ NaOH + 4H 3BO3
H3BO3 + H2O ═ B(OH) 4- + H+
一元弱酸 Ka=5.6× 10-10
PH=Pka1-lg（ C酸 /C盐 ）
=9.24- lg（ C酸 /C盐 ）
四、操作手续
（一）制作标准曲线
1．配制 100μ g/ml酪氨酸标准溶液
2．配制系列浓度的酪氨酸标准溶液
（二）测定蛋白酶活力 ——实测
1．缓冲溶液的配制
2．底物配制
3．待测酶液配制
4．测定
1．配制 100μ g/mL酪氨酸标准溶液
0.1000g酪氨酸 0.1mol/LHCL 100ml容量瓶
1mg/ml=1000μ g/ml
再移取 10ml 0.1mol/LHCL 100ml容量瓶
100μ g/ml
（一）制作标准曲线
2．配制系列浓度的酪氨酸标准溶液
管号 酪氨酸浓度
（ μ g/ml ）
加 100 μ g / m l 酪氨酸的量
（ ml ）
加蒸馏水的量
（ ml ）
0 0 0 10
1 10 1 9
2 20 2 8
3 30 3 7
4 40 4 6
5 50 5 5
6 60 6 4
用 5 或 10ml 刻度移液管移取
操作解释
为什么酪氨酸要干燥至恒重？
为什么酪氨酸要称准至 0.1000g？
为什么酪氨酸用盐酸溶解？
3．系列浓度的酪氨酸显色并测 OD值
酪氨酸标准溶液 1ml
摇匀 10分钟 蓝色 冷却
1cm比色皿
680nm波长
5ml0.55mol/L Na2CO3
福林试剂 1ml
40℃ 水浴
0号调零，测 OD值
说明
（ 1） 各试剂均用刻度移液管移取
（ 2） 显色后需冷却到室温
（ 3） 每一点测两份, Δ OD≤0.01
共 3× 6＝ 18支干试管
4．描点作图
（ 1）画图求直线斜率的倒数 K
（ 2）计算 K
（ 3）直接查取
（ 4）计算机处理，回归曲线,C=K.OD
（ 1）画图求直线斜率的倒数 K
Δ C
K = Δ OD
（ μ g/ml OD）
OD
C（ μ g/ml）
10 20 30 40 50 600
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
ΔC
ΔOD
（ 2）计算 K
Kn =
K1+K2+K3+K4+K5
K=
5
Cn
ODn
（ 3）直接查取
（二）测定蛋白酶活力 ——实测
1．缓冲溶液的配制
2．底物配制
3．待测酶液配制
4．测定
1．缓冲溶液的配制
酸性蛋白酶。如,537 PH最适 =3.0
柠檬酸 —柠檬酸钠缓冲溶液 PH=3.0
中性蛋白酶。如,1398 PH最适 =7～ 7.5；
0.02mol/L的磷酸缓冲溶液 PH=7.5
碱性蛋白酶。如,2709 PH最适 = 9 ～ 11；
硼砂 —氢氧化纳缓冲溶液 PH=10
2．底物配制
中性、碱性蛋白酶
0.5或 2﹪ 酪素
≥ 饱合浓度
0.5﹪ 酪素溶液的配制
0.5g酪素 润涨 透明 调 PH =PH最适 冷却
100ml
0.5mol/L的 NaOH 0.1mol/L的 HCL
沸水浴
PH=PH最适 的缓冲溶液
2．配制待测酶液
0.5g酶粉 研磨 5` 研磨 5` 搅拌 沉降 转移清液 研磨
反复 3~4次 200ml 8层干沙布 过滤 吸取
10ml滤液 100ml容量瓶
缓冲溶液
配制酶液的关键
稀释倍数与称量重量的原则
光密度 OD=0.4± （或 0.2~0.6）
研磨时间
3．测定
酪蛋白 酪氨酸
酪氨酸 + 福林试剂 蓝色溶液
酶催化
条件
操作手续（一）
编 号 空白管 0 平行管 1 平行管 2
酶液（ ml ） 1 1 1
10 ﹪三氯乙酸（ ml ） 3 0 0
酪素（ ml ） 2 2 2
现象 白色↓ 无 无
操作 40 ℃ 水浴锅内保温 10 分钟
10 ﹪三氯乙酸（ ml ） 0 3 3
现象 白色↓ 白色↓ 白色↓
取出摇振后室温下静置数分钟过滤
编 号 空白管 0 平行管 1 平行管 2
酶液（ ml ） 1 1 1
10 ﹪三氯乙酸（ ml ） 3 0 0
酪素（ ml ） 2 2 2
现象 白色↓ 无 无
操作 40 ℃ 水浴锅内保温 10 分钟
10 ﹪三氯乙酸（ ml ） 0 3 3
现象 白色↓ 白色↓ 白色↓
取出摇振后室温下静置数分钟过滤
操作手续 (二 )
接滤液 1` 1` 2`
干试管 0`` 1`` 2``
移取滤液（ ml ） 1 1 1
0.55mol/LNa 2 CO 3 （ ml ） 5
福林试剂（ ml ） 1
40 ℃ 水浴锅内保温 10 分钟
测定 OD值
测定温度：室温
比色皿厚 =1cm
λ max=680nm
“0”号调零，测 1``,2``平行管
Δ OD≤0.01
解 释
三个系列试管的异同
过滤操作
滤液介质
空白选择
前后两个 10分钟有什么不同？
五、计算
K·OD·6·N 6·K·OD·N
单位 /g = =
10·W 10·W
OD：实测光密度的平均值；
K：酪氨酸（ μg/ml） / OD；
6：过滤前溶液的体积为 6ml；
N：稀释倍数。在此 N=2000；
W：酶粉重（ g）；
10：反应时间为 10分钟。
六、注意事项
微量分析，麻烦、细碎。
特别细心操作。
严格控制条件、温度、反应时间等。
胰酶的测定
一、概述
二、醋酸盐指示剂法测定原理
三、试剂
四、操作
五、计算
六、注意事项及讨论
一、概述
1．胰酶的性质
2．胰酶在制革生产中的应用
3．为什么要测定胰酶活力？
4．定义
1．胰酶的性质
食用动物的新鲜胰脏 → 清洗 → 切碎 → 脱
水干燥 → 粉碎 → 脱脂 → 浸提 → 胰酶粉剂
白色或黄色的无晶形粉末
PH最适 =7.8~8.7
2．胰酶在制革生产中的应用
软化
消解蛋白质、脏物、毛根、纤维间质等
继续脱脂
3．为什么要测定胰酶活力？
4．胰酶活度的定义
× 克酪蛋白 / g酶粉 ?一定时间
二、醋酸盐指示剂法测定原理
（富尔德 —哥劳斯法）
在 PH=8~9,T= 40℃ 的条件下,定量酪
蛋白和不同量的胰酶作用一定时间后,用醋酸
盐指示剂调节反应液 PH达到酪蛋白的等电点
(PI=4.6),未被水解的酪蛋白呈白色沉淀析
出，据此，可确定使定量的酪蛋白完全水解
的最小胰酶量。根据胰酶的体积和浓度，即
可计算出胰酶对酪蛋白的转化倍数，即胰酶
的活度。
三、试剂
1,1.24∶ 50 （ 0.4mol/L）硼酸水溶液（ A液）
H3BO4 PKa=9.24 弱酸
2,0.1mol/LNaOH水溶液（ B液）
3．硼酸盐溶液
A液 20ml + B液 2ml
[H2BO3-]
PH =PKa + lg ————
H3BO3
理论上 PH=7.64
实际上 PH=6~7
4,13.6﹪ （ 1.66mol/L） NaAC水溶液（ A液）
5,60﹪ (10 mol/L)醋酸溶液（ B液）
6．醋酸盐缓冲液 (指示剂 )
A液与 B液等体积混合
PH= PKa +lg [NaAC]/[HAC]
=3.95
≌ 4
三、试剂
四、操作
1．配制底物酪蛋白
2．胰酶溶液的配制
3．粗测
4．精确测定
1．配制底物酪蛋白溶液
精称 0.2g细酪蛋白于小烧杯中，加
20ml H2O，移取 5ml 0.1mol/LNaOH，
40℃ 水浴 上加热约 30分钟，搅拌使之溶
解，转移洗涤到 100ml容量瓶中，在移
取 5ml H3BO3 溶液，用蒸馏水定容到刻
度。（ PH=8.5）
解 释
1,为什么要精确称量？
2,为什么先加水，后加 NaOH？
3,NaOH的作用是什么？
4,H3BO3的作用是什么？
硼酸 -硼酸盐缓冲溶液
C盐
PH= PKa+lg———
C酸
0.1× 5/100
=9.24 - lg——————
0.4× 5/100
≌ 8.6
2．配制胰酶溶液
研钵中精称胰酶 0.1g，（先加 3~5
滴研磨，再补加 15~17滴）共 1ml硼酸
盐溶液，浸泡 3~5分钟，研磨到无大块
胰酶，转移定容到 500ml容量瓶。
3．粗测
编 号 1 2 3 4 5 6 7
酪蛋白溶液（ ml ） 5 5 5 5 5 5 5
胰酶溶液（ ml ） 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0
蒸馏水（ ml ） 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0
总体积（ ml ） 10 10 10 10 10 10 10
充分振荡摇匀,40 ℃ 水浴保温 1hr
醋酸盐指示剂
（ 10 滴）
↓ ↓ ↓
编 号 1 2 3 4 5 6 7
酪蛋白溶液（ ml ） 5 5 5 5 5 5 5
胰酶溶液（ ml ） 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0
蒸馏水（ ml ） 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0
总体积（ ml ） 10 10 10 10 10 10 10
充分振荡摇匀,40 ℃ 水浴保温 1hr
醋酸盐指示剂
（ 10 滴）
↓ ↓ ↓
4．精确测定
编 号 1 2 3 4 5 6
酪蛋白溶液（ ml ） 5 5 5 5 5 5
胰酶溶液（ ml ） 2,5 2,4 2,3 2,2 2,1 2,0
蒸馏水（ ml ） 2,5 2,6 2,7 2,8 2,9 3,0
总体积（ ml ） 10 10 10 10 10 10
充分震荡,40 C
0
恒温 1 hr
醋酸盐指示剂
（ 10 滴）
↓ ↓ ↓ ↓
五、计算
酪蛋白的 g数 （ W酪 /100） × 5
X = =
胰酶的 g数 （ W酶 /500） × U2
25× W酪
= （倍）
W酶 × U2
六、注意事项及讨论
1．反应液的混合；
2．水浴加热；
3．试管的粗细程度；
4．胰酶和酪蛋白溶液的保存；
5．比较蛋白酶活力与胰酶活力测定配制酪
蛋白溶液有什么不同？为什么？
6．白色 ↓ 的观察；
7．使蛋白质沉淀的方法有哪些？
分析化学理论
应用于皮革生产
基本的分析方法
皮革生产中的化学分析方法和物理检验技术
皮革理化分析
过程控制分析
皮革成品分析
原材料分析
操作液分析
废水分析
化学组分的分析
物理 -机械性能的分析
一、皮革理化分析的任务和作用
标准化
产品质量
降低成本
使用原材料
控制工艺条件
新材料、新工艺、新产品
三废治理
提
供
数
据
二、内容安排
皮革生产过程控制
原材料：酸、碱、盐、酶
操作液：铬鞣液、灰液
废 水：铬、硫,COD
三、皮革理化分析的特点
1,准确度属于工业分析的范畴。
2,由分析对象决定取样方法。
3,尽可能在短时间内完成。
工业分析的公差范围
被测组分含量 (﹪ ) 公差 (用相对误差来表示 )
80~90(99) 0.4~0.3(0.1)
40~80 0.6~0.4
20~40 1.0~0.6
10~20 1.2~1.0
5~10 1.6~1.2
1~5 5.0~1.6
0.1~1 2.0~5.0
0.01~0.1 50~20
四、皮革分析的学习方法和基本要求
实践性很强,2/3实验学时
要 求
实验前：予习，订好实验计划
实验中：观察、思考、记录
实验后：总结、报告
实验报告要求
目的
原理
试剂及仪器
实验操作
记录及数据处理
计算及结果
讨论
实验室要求
1,按时到，遵守实验室纪律；
2,不抽烟、唱歌、串门、打闹；
3,东西带齐：钥匙、课本、笔记本、实验记录本
预习报告、实验报告；
4,实验前考察：提问、抽察；
5,打扫卫生。个人卫生：整理仪器、擦桌子；
值日卫生：扫地, 拖地, 收拾仪
器药品, 洗水池等 。
Na2S含量的测定
一、概述
二、高铁氰化钾法测定原理
三、试剂
四、操作
五、计算
六、讨论
一、概述
1,Na2S的性质
2,Na2S在制革生产中的作用
3．测定意义
1,Na2S的性质
Na2S M=78.05 粉粒状
Na2S·9H2O M=240.2 无色或微紫色棱柱形晶体
Na2S + 2H2O ═ NaOH + NaHS
强碱性,硫化碱, 臭碱, 火碱
Na2 S + 2H+ ═ 2Na+ + H2S
有毒而易燃
Na2 S + 2O2+ H20 ═ Na2S2O3 + 2NaOH
2,Na2S在制革生产中的应用
灰 -碱法或碱 -碱法脱毛：
R-S— S-R1 + 2Na2S → R-SNa+R1-SNa + Na2S2
Ca（ OH） 2 + 2NaHS → Ca（ SH） 2 + NaOH
R-S-S-R1 + Ca（ SH） 2 → 2R-SH + CaS + S↓OH
-
3,Na2S含量的测定及意义
（ 1） 原材料
（ 2） 脱毛浸灰液
（ 3） 脱毛废液及废水
二、高铁氰化钾法测定原理
K3[Fe（ CN） 6]为滴定剂
Na2[Fe（ CN） 5（ NO） ]为指示剂
碱性介质中
先预滴定，再后加指示剂精确滴定
1．化学反应原理
S + 2e OH- S2- E0= -0.48 V
S + 2H+ + 2e H2 S E0= 0.141V
K3[Fe（ CN） 6]/ K4[Fe（ CN） 6] E0= 0.36V
ΔE01=0.36-(-0.48)=0.84V
ΔE02=0.36-0.141=0.219V
Na2S + 2K3[Fe(CN)6] OH- S↓ + 2NaK3[Fe(CN)6]
还原剂 氧化剂
氧化 -还原滴定指示剂
（ 1） 氧化 -还原指示剂
如：邻菲罗啉
（ 2） 指示剂与氧化剂或还原剂显色
如：淀粉
（ 3） 自身指示剂
如,KMnO4
2．指示原理
Na2S + Na2[Fe(CN)5(NO)]
(CN)5
Na4 Fe
N=O
S2-
紫红色络合物紫红色络合物
颜色变化
深紫色 → 浅紫 → 乳白色中透紫
→ 几乎乳白 → 乳黄
过量半滴的 K3[Fe（ CN） 6]
终点前的颜色
紫红色络合物
乳白色 S
乳
白
色
中
透
紫
终点颜色
过量半滴的
K3[Fe（ CN） 6]
乳白色 S
乳
黄
三、试剂
1,0.1mol/L NaOH水溶液
2,0.1000mol/L K3[Fe（ CN） 6]标准溶液
3,0.4%的亚硝酰铁氰化钠水溶液
1000ml32.9250g K3[Fe（ CN） 6]
1．预滴定
50ml H2O
5ml0.1mol/L NaOH
10或 25ml试液
1ml指示剂
四、操作
250ml三角瓶
K3[Fe（ CN） 6] 乳黄 V
1深紫色
2．精确滴定
50ml煮沸过的 H2O
5ml0.1mol/L NaOH
10或 25ml试液
滴加 K3[Fe（ CN） 6] (V1-0.5)ml
1ml指示剂
紫色
K3[Fe（ CN） 6]
乳黄
注 意
1．终点的观察；
2．滴定应迅速；
3．指示剂的使用；
4．加液次序。
五、计算
Na2S + 2K3[Fe(CN)6] OH- 2S↓ + 2NaK 3[Fe(CN)6]
1mol Na2S 2mol K3[Fe（ CN） 6]
（ M× V） Fe3+
Na2S（ g/L） = —————— × 78.05
2 × V样
六、讨论
1．介质选择
2．为什么进行预滴定，再精确滴定？
3．对本方法的评价
1,为什么选择碱性介质？
（ 1） E0 S/S2-在碱性介质电位低
在 OH- 中,E0 = -0.48 V
在 H+中,E0 = 0.141V
（ 2） 能斯特方程
S2- + [Fe（ CN） 6]3- → S ↓ + [Fe（ CN） 6]4-
（ 2） 能斯特方程
0.059 [S]
E = E0 + ———— lg ———n [S2-]
[S2-]↑ E ↓ 对反应越有利
[S2-]↓ E ↑ 对反应越不利
在 H+中,S2- + 2H+ → H2S ↑
[S2-]↓ 不利于反应
H2S有毒
（ 3） S2- 极易水解
S2- + H2O ═ HS - + OH-
Kh = KW/ Ka2
=（ 10-14） /（ 7.1× 10-15 ）
= 1.41
加碱 [S2-]↑ E↓ 有利于反应
（ 4）碱性介质是 K3[Fe（ CN） 6]的安全介质
K3[Fe（ CN） 6] + 6H+ 3K+ + Fe3+ + 6HCN↑
剧毒2．为什么要先预滴定，
再后加指示剂精确滴定？
（ 1）缩短滴定时间
（ 2）缩短紫色络合物生成时间
3．对本方法的评价
优点：快速,准确
缺点：微量分析误差大, 有机物干扰
Na2S含量测定思考题
1．如何配制 0.1mol/L的 K3 [Fe(CN)6]标准
溶液?
2．请设计固体 Na2S含量的测定方案，并通
过计算说明。
蛋白酶的分析
一、概述
二、测定原理
三、试剂
四、操作手续
五、计算
六、注意事项
一、概述
1．什么是酶？
2．影响酶催化反应的因素
3．什么是酶的活力?
4．测定意义
1．什么是酶？
生物催化剂
特殊催化功能的蛋白质
酶的特性,
（ 1）催化速度快
（ 2） 作用有专一性、选择性
（ 3）化学本质是蛋白质
2．影响酶催化反应的因素
底物浓度
PH值
温度
时间
（ 1）底物浓度
V
Vmax
底物浓度 C
C0
饱和浓度
（ 2） PH值的影响
OD
PH
PH最适
酶的分类
酸性蛋白酶
3350 PH最适 =2～ 4； 7401 PH最适 =3.0
中性蛋白酶
1398 PH最适 =7～ 7.5； 166 PH最适 =7～ 8
碱性蛋白酶
2709 PH最适 = 9 ～ 11； 209 PH最适 =9.5～ 11
（ 3）温度的影响
OD
T（ ℃ ）
T最适
（ 4）作用时间的影响
Q（反应物的消耗量或生成物的生成量 )
t0 t
结 论
酶催化反应
在反应初速度时间内
最适温度
最适 PH
饱合底物浓度
在最大活力处比较
3．什么是酶的活力?
蛋白酶的活力
酪氨酸的微克数 1g酶粉或 1ml酶液 ?每分钟
4．测定意义
酶的活力会下降
酶的催化能力强
二、测定原理
酪蛋白 酪氨酸
显色剂
比色
酶催化
条件
1．酶催反应
条件,底物浓度 温度 PH 时间
选择,C0 T最适 PH最适 t0
措施,C≥ C0 恒温水浴 缓冲溶液 t= t0
例子,537
0.5%酪蛋白 40℃ 3.0 10min
例子,1398
0.5%酪蛋白 40℃ 7.5 10min
例子,2709
0.5%酪蛋白 40℃ 10 10min
2．显色
Na2WO4
Na2MoO4
H2O
H3PO4 福林试剂 → 亮金黄色
HCL
Li2SO4
Br2
显色剂
显色反应
福林试剂 + 酪氨酸 OH- 蓝色物质
HO — —CH2—CH—COOH
还原性 NH2
钼蓝 +钨蓝
3．朗伯 -比尔定律及其应用
E —— 吸光度
A —— 消光值
OD —— 光密度
E = K·Ｃ ·L
= lg（ I0/I）
= K′· C
T = I I0
透光率
入射光强度 I0
有色真溶液
透过光强度 IC
L
朗伯 -比尔定律的应用
[X] → [RX] → OD
[X] OD
OD=K·C组分
注 意
① 选择 λ max
λ max =680nm
② OD值的范围
OD=0.2～ 0.6
4．制作标准曲线
酪氨酸浓度 C OD
C1 OD1
C2 OD2
C3 OD3
··· ···
Cn ODn
福林 —酚法测定蛋白酶活力
方法要点
配制系列浓度的酪氨酸标准溶液，在一定条
件下（ T,PH,t）与福林试剂显色后，测定光密
度 OD值。绘制标准曲线。精称酶制剂，配成适当
浓度的溶液。以酪素为底物，在一定温度,PH下
与上述酶液作用一定时间，用三氯醋酸终止反应,
并使未水解的酪素沉淀，过滤，移取滤液，加入
碳酸钠调节 PH为碱性，再加入福林试剂，显色后
测定光密度，与标准曲线比较，计算出被测酶制
剂的活力。
三、试剂
10﹪ CL 3CCOOH 水溶液
0.55mol/L碳酸钠溶液
缓冲溶液
福林试剂 显色剂 一种杂多酸
磷钼酸 H3[P（ Mo3O10） 4]
磷钨酸 H3[P（ W3O10） 4]
福林试剂的配制
Na2WO4·2H2O 100g
Na2MoO4·2H2o 25g Li2 SO4 50g
H2O 100ml 10hr +
85﹪H 3PO4 50ml H2O 50ml
浓 HCL 100ml
混匀 + 溴水 15`
冷却 → 黄色 → 过滤
金黄色溶液
回流
Δ
Δ
(1)柠檬酸 —柠檬酸钠缓冲溶液
PH=3.0
A液,0.1mol/L柠檬酸
21.01g C6H8O7·H2O → 1000ml
CH2—COOH
HO—C —COOH
CH2—COOH
B液,0.1mol/L柠檬酸纳
29.4gNa3C6H5O7·2H2O → 1000ml
用时,A∶B= 18.6∶ 1.4混合
柠檬酸 —柠檬酸钠溶液的 PH计算
弱酸 —弱酸盐缓冲体系
PH = Pka1-lg（ C酸 /C盐 ）
= 3.13- lg（ C酸 /C盐 ）
柠檬酸,
PKa1 = 3.13
PKa2 = 4.76
PKa3 = 6.40
（ 2） 0.02mol/L的磷酸缓冲溶液
A液,0.2mol/L NaH2PO4溶液
31.2g NaH2PO4·2H2O → 1000ml
B液,0.2mol/L Na2HPO4溶液
71.7g Na2HPO4·12H2O → 1000ml
① PH=7.2的磷酸缓冲溶液
A液 28ml
B液 72ml 1000ml
H2O
② PH=7.5的磷酸缓冲溶液
A液 16ml
B液 84ml
H2O 1000ml
磷酸盐缓冲溶液 PH值计算
弱酸 —弱酸盐缓冲体系
PH = PKa - lg（ C酸 /C盐 ）
[H2PO4-]
= 7.21-lg ————
[HPO4=]
Ka2 = 6.17× 10-8
（ 3）硼砂 —氢氧化纳缓冲溶液
PH=10
A液,0.055mol/L Na2B4O7 ·8 H2O
19g Na2B4O7 ·8 H2O 1000ml
B液,0.2 mol/L NaOH
8g NaOH 1000ml
A液 50ml
B液 43ml
H2O 200ml
硼砂 —氢氧化纳缓冲溶液的 PH计算
弱酸 —弱酸盐缓冲体系
Na2B4O7 + 7H2O ═ NaOH + 4H 3BO3
H3BO3 + H2O ═ B(OH) 4- + H+
一元弱酸 Ka=5.6× 10-10
PH=Pka1-lg（ C酸 /C盐 ）
=9.24- lg（ C酸 /C盐 ）
四、操作手续
（一）制作标准曲线
1．配制 100μ g/ml酪氨酸标准溶液
2．配制系列浓度的酪氨酸标准溶液
（二）测定蛋白酶活力 ——实测
1．缓冲溶液的配制
2．底物配制
3．待测酶液配制
4．测定
1．配制 100μ g/mL酪氨酸标准溶液
0.1000g酪氨酸 0.1mol/LHCL 100ml容量瓶
1mg/ml=1000μ g/ml
再移取 10ml 0.1mol/LHCL 100ml容量瓶
100μ g/ml
（一）制作标准曲线
2．配制系列浓度的酪氨酸标准溶液
管号 酪氨酸浓度
（ μ g/ml ）
加 100 μ g / m l 酪氨酸的量
（ ml ）
加蒸馏水的量
（ ml ）
0 0 0 10
1 10 1 9
2 20 2 8
3 30 3 7
4 40 4 6
5 50 5 5
6 60 6 4
用 5 或 10ml 刻度移液管移取
操作解释
为什么酪氨酸要干燥至恒重？
为什么酪氨酸要称准至 0.1000g？
为什么酪氨酸用盐酸溶解？
3．系列浓度的酪氨酸显色并测 OD值
酪氨酸标准溶液 1ml
摇匀 10分钟 蓝色 冷却
1cm比色皿
680nm波长
5ml0.55mol/L Na2CO3
福林试剂 1ml
40℃ 水浴
0号调零，测 OD值
说明
（ 1） 各试剂均用刻度移液管移取
（ 2） 显色后需冷却到室温
（ 3） 每一点测两份, Δ OD≤0.01
共 3× 6＝ 18支干试管
4．描点作图
（ 1）画图求直线斜率的倒数 K
（ 2）计算 K
（ 3）直接查取
（ 4）计算机处理，回归曲线,C=K.OD
（ 1）画图求直线斜率的倒数 K
Δ C
K = Δ OD
（ μ g/ml OD）
OD
C（ μ g/ml）
10 20 30 40 50 600
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
ΔC
ΔOD
（ 2）计算 K
Kn =
K1+K2+K3+K4+K5
K=
5
Cn
ODn
（ 3）直接查取
（二）测定蛋白酶活力 ——实测
1．缓冲溶液的配制
2．底物配制
3．待测酶液配制
4．测定
1．缓冲溶液的配制
酸性蛋白酶。如,537 PH最适 =3.0
柠檬酸 —柠檬酸钠缓冲溶液 PH=3.0
中性蛋白酶。如,1398 PH最适 =7～ 7.5；
0.02mol/L的磷酸缓冲溶液 PH=7.5
碱性蛋白酶。如,2709 PH最适 = 9 ～ 11；
硼砂 —氢氧化纳缓冲溶液 PH=10
2．底物配制
中性、碱性蛋白酶
0.5或 2﹪ 酪素
≥ 饱合浓度
0.5﹪ 酪素溶液的配制
0.5g酪素 润涨 透明 调 PH =PH最适 冷却
100ml
0.5mol/L的 NaOH 0.1mol/L的 HCL
沸水浴
PH=PH最适 的缓冲溶液
2．配制待测酶液
0.5g酶粉 研磨 5` 研磨 5` 搅拌 沉降 转移清液 研磨
反复 3~4次 200ml 8层干沙布 过滤 吸取
10ml滤液 100ml容量瓶
缓冲溶液
配制酶液的关键
稀释倍数与称量重量的原则
光密度 OD=0.4± （或 0.2~0.6）
研磨时间
3．测定
酪蛋白 酪氨酸
酪氨酸 + 福林试剂 蓝色溶液
酶催化
条件
操作手续（一）
编 号 空白管 0 平行管 1 平行管 2
酶液（ ml ） 1 1 1
10 ﹪三氯乙酸（ ml ） 3 0 0
酪素（ ml ） 2 2 2
现象 白色↓ 无 无
操作 40 ℃ 水浴锅内保温 10 分钟
10 ﹪三氯乙酸（ ml ） 0 3 3
现象 白色↓ 白色↓ 白色↓
取出摇振后室温下静置数分钟过滤
编 号 空白管 0 平行管 1 平行管 2
酶液（ ml ） 1 1 1
10 ﹪三氯乙酸（ ml ） 3 0 0
酪素（ ml ） 2 2 2
现象 白色↓ 无 无
操作 40 ℃ 水浴锅内保温 10 分钟
10 ﹪三氯乙酸（ ml ） 0 3 3
现象 白色↓ 白色↓ 白色↓
取出摇振后室温下静置数分钟过滤
操作手续 (二 )
接滤液 1` 1` 2`
干试管 0`` 1`` 2``
移取滤液（ ml ） 1 1 1
0.55mol/LNa 2 CO 3 （ ml ） 5
福林试剂（ ml ） 1
40 ℃ 水浴锅内保温 10 分钟
测定 OD值
测定温度：室温
比色皿厚 =1cm
λ max=680nm
“0”号调零，测 1``,2``平行管
Δ OD≤0.01
解 释
三个系列试管的异同
过滤操作
滤液介质
空白选择
前后两个 10分钟有什么不同？
五、计算
K·OD·6·N 6·K·OD·N
单位 /g = =
10·W 10·W
OD：实测光密度的平均值；
K：酪氨酸（ μg/ml） / OD；
6：过滤前溶液的体积为 6ml；
N：稀释倍数。在此 N=2000；
W：酶粉重（ g）；
10：反应时间为 10分钟。
六、注意事项
微量分析，麻烦、细碎。
特别细心操作。
严格控制条件、温度、反应时间等。
胰酶的测定
一、概述
二、醋酸盐指示剂法测定原理
三、试剂
四、操作
五、计算
六、注意事项及讨论
一、概述
1．胰酶的性质
2．胰酶在制革生产中的应用
3．为什么要测定胰酶活力？
4．定义
1．胰酶的性质
食用动物的新鲜胰脏 → 清洗 → 切碎 → 脱
水干燥 → 粉碎 → 脱脂 → 浸提 → 胰酶粉剂
白色或黄色的无晶形粉末
PH最适 =7.8~8.7
2．胰酶在制革生产中的应用
软化
消解蛋白质、脏物、毛根、纤维间质等
继续脱脂
3．为什么要测定胰酶活力？
4．胰酶活度的定义
× 克酪蛋白 / g酶粉 ?一定时间
二、醋酸盐指示剂法测定原理
（富尔德 —哥劳斯法）
在 PH=8~9,T= 40℃ 的条件下,定量酪
蛋白和不同量的胰酶作用一定时间后,用醋酸
盐指示剂调节反应液 PH达到酪蛋白的等电点
(PI=4.6),未被水解的酪蛋白呈白色沉淀析
出，据此，可确定使定量的酪蛋白完全水解
的最小胰酶量。根据胰酶的体积和浓度，即
可计算出胰酶对酪蛋白的转化倍数，即胰酶
的活度。
三、试剂
1,1.24∶ 50 （ 0.4mol/L）硼酸水溶液（ A液）
H3BO4 PKa=9.24 弱酸
2,0.1mol/LNaOH水溶液（ B液）
3．硼酸盐溶液
A液 20ml + B液 2ml
[H2BO3-]
PH =PKa + lg ————
H3BO3
理论上 PH=7.64
实际上 PH=6~7
4,13.6﹪ （ 1.66mol/L） NaAC水溶液（ A液）
5,60﹪ (10 mol/L)醋酸溶液（ B液）
6．醋酸盐缓冲液 (指示剂 )
A液与 B液等体积混合
PH= PKa +lg [NaAC]/[HAC]
=3.95
≌ 4
三、试剂
四、操作
1．配制底物酪蛋白
2．胰酶溶液的配制
3．粗测
4．精确测定
1．配制底物酪蛋白溶液
精称 0.2g细酪蛋白于小烧杯中，加
20ml H2O，移取 5ml 0.1mol/LNaOH，
40℃ 水浴 上加热约 30分钟，搅拌使之溶
解，转移洗涤到 100ml容量瓶中，在移
取 5ml H3BO3 溶液，用蒸馏水定容到刻
度。（ PH=8.5）
解 释
1,为什么要精确称量？
2,为什么先加水，后加 NaOH？
3,NaOH的作用是什么？
4,H3BO3的作用是什么？
硼酸 -硼酸盐缓冲溶液
C盐
PH= PKa+lg———
C酸
0.1× 5/100
=9.24 - lg——————
0.4× 5/100
≌ 8.6
2．配制胰酶溶液
研钵中精称胰酶 0.1g，（先加 3~5
滴研磨，再补加 15~17滴）共 1ml硼酸
盐溶液，浸泡 3~5分钟，研磨到无大块
胰酶，转移定容到 500ml容量瓶。
3．粗测
编 号 1 2 3 4 5 6 7
酪蛋白溶液（ ml ） 5 5 5 5 5 5 5
胰酶溶液（ ml ） 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0
蒸馏水（ ml ） 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0
总体积（ ml ） 10 10 10 10 10 10 10
充分振荡摇匀,40 ℃ 水浴保温 1hr
醋酸盐指示剂
（ 10 滴）
↓ ↓ ↓
编 号 1 2 3 4 5 6 7
酪蛋白溶液（ ml ） 5 5 5 5 5 5 5
胰酶溶液（ ml ） 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0
蒸馏水（ ml ） 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0
总体积（ ml ） 10 10 10 10 10 10 10
充分振荡摇匀,40 ℃ 水浴保温 1hr
醋酸盐指示剂
（ 10 滴）
↓ ↓ ↓
4．精确测定
编 号 1 2 3 4 5 6
酪蛋白溶液（ ml ） 5 5 5 5 5 5
胰酶溶液（ ml ） 2,5 2,4 2,3 2,2 2,1 2,0
蒸馏水（ ml ） 2,5 2,6 2,7 2,8 2,9 3,0
总体积（ ml ） 10 10 10 10 10 10
充分震荡,40 C
0
恒温 1 hr
醋酸盐指示剂
（ 10 滴）
↓ ↓ ↓ ↓
五、计算
酪蛋白的 g数 （ W酪 /100） × 5
X = =
胰酶的 g数 （ W酶 /500） × U2
25× W酪
= （倍）
W酶 × U2
六、注意事项及讨论
1．反应液的混合；
2．水浴加热；
3．试管的粗细程度；
4．胰酶和酪蛋白溶液的保存；
5．比较蛋白酶活力与胰酶活力测定配制酪
蛋白溶液有什么不同？为什么？
6．白色 ↓ 的观察；
7．使蛋白质沉淀的方法有哪些？
