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第五节 遗传工程 P166
一,遗传工程概述
*二,染色体工程
*三,细胞工程
四,基因工程
五、基因组学
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一,遗传工程概述
?遗传工程 (genetic engineering)是七十年代才开始
发展起来的一门新技术。它是在分子遗传学的理
论基础上，综合采用分子生物学与微生物学的现
代方法和手段建立起来的。这一先进技术的兴起，
标志着现代遗传学已发展到定向控制遗传性状的
新阶段。
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一,遗传工程概述
?遗传研究要阐明遗传与变异的现象和基本规律，探
索遗传与变异的原因及其物质基础。在此基础上：
?解释、研究 生物进化 的原因、过程和规律 (遗传与进化 )。
?改善动、植物和微生物的遗传特性 —— 按照人类的意愿，
创造、培育各种生物的新类型、新品种的 人工进化 过程
(育种学 )。育种工作的理论和技术水平在很大程度上取决
于遗传学所取得的成就。
?讫今为止，动、植物育种的绝大部分成就都是以经
典遗传、细胞遗传和数量遗传理论为基础所取得的。
?六、七十年代的绿色革命；
?育种工作面临的问题。
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一,遗传工程概述
(一 ),遗传工程的基础
?人类对自然改造的能力取决于对自然规律的认识
水平。分子遗传、生物化学及分子生物学、细胞
生物学的理论和技术发展使生物遗传操作的能力
正在不断提高。
?遗传工程的理论与技术基础主要来自于：
1,分子遗传学的理论；
2,生物化学及分子生物学的成就；
3,细胞生物学理论和技术。
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(二 ),遗传工程的含义
?生物技术
?生物工程：
?遗传工程；
?蛋白质工程、酶工程；
?微生物工程；
?……
?遗传工程：在分子遗传
理论、技术的基础上，
通过工程设计与施工方
式，从细胞、分子水平
改造生物遗传特性。
?作为一个综合性的技术
群体系,广义的遗传工
程 包含许多相关的组成
部分，其主要的部分有
三个：
?1,染色体工程；
?2,细胞工程；
?3,基因工程。
?狭义的遗传工程 指
的是基因工程。
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(二 ),遗传工程的含义
? 遗传工程或以分为狭义和广义的两种。
广义的遗传工程包括：基因工程、细胞工程、染色体工程、细胞器
工程。习惯上所讲的遗传工程多指基因工程。
基因工程是一种操作，它不是通过一般传统的有性杂交方法，而是
采取类似于工程建设的方式，按照预先设计的蓝图，借助于实验室的
技术，将某种生物的基因或基因组转移到另一种生物中去，使后者定
向地获得新的遗传性状，成为新的类型。
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(二 ),遗传工程的含义
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(二 ),遗传工程的含义
?一般说来，进行基因工程首先需要一个施工的设计蓝图，
然后才能进行施工的操作。
基因工程的施工程序大致分为 四个步骤,
1、为施工准备材料，即“目的”基因、载体和工具酶等。
2、把目的基因与载体结合成重组 DNA分子。
3、把重组 DNA分子引入受体细胞，建立分子无性繁系
(Clone)或称克隆。
4、从细胞群体中选出所需要的无性繁殖系，并使外源基
因在受体细胞中正确表达。
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(三 )、基因的分离与合成
?目的”基因即在遗传工程中所需要的基因，它的来源不外
乎分离自然的基因与人工合成基因。
?目前采用的方法主要有两种：鸟枪射击法和化学合成基因。
(一 )、利用鸟枪射击法 (Shotgun)分离基因；
用限制性核酸内切酶把一个 DNA分子切成一个或略大于
一个基因的片段，然后把全部片段一一与载体组成重组
DNA分子，转化到大肠杆菌 K12中去，进行纯系繁殖，使
每个基因片段都繁殖到适于研究的数量，再进行分离鉴定，
选择出所需要的基因。
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(三 )、基因的分离与合成
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(三 )、基因的分离与合成
?(二 )、基因的化学合成
1970年考兰纳 (Khorana,H.G)等采用有机化学的方法首
次合成了转录成酵母丙氨酸 tRNA的基因，为基因的合成
开辟了一条新的道路。考兰纳先合成大量彼此互补的 10-
15个核苷酸单链片段，然后用连接酶将它们连接并配合成
双链。
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一,遗传工程概述
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一,遗传工程概述
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一,遗传工程概述
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一,遗传工程概述
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一,遗传工程概述
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一,遗传工程概述
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一,遗传工程概述
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一,遗传工程概述
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一,遗传工程概述
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*二、染色体工程
?染色体工程是物种间遗传转移的 最传统的方式,
也是目前广泛进入生产应用的遗传工程。
?其重要性因作物不同而异：
?对蕃茄而言，世界上任何具有商业价值的栽培品种都
带有一个从野生种导入的抗枯萎病性状，其它六个野
生种则是耐盐性、抗虫性等性状的来源。
?小麦许多抗白粉病基因和抗锈病基因都来源于其野生
近缘物种。
?相反，蚕虫改良则完全是在栽培种 (Vicia faba)内进行
杂交选择。现在还不能从其它任何种导入基因到该作
物中。
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(一 ),种间有性杂交
?生殖隔离是物种形成的原因之一，也是染色体工
程面临的第一个难题，获得种间有性杂种的难易
直接影响外源基因导入栽培作物。
?对不同的作物而言，种间杂交障碍的机制可能截
然不同，其表现阶段也各不相同。目前认为，种
间杂交产生杂种的障碍可能表现在以下几个阶段：
?受精前柱头和花柱中的障碍 ；
?受精过程中的障碍 ；
?受精后胚与种子发育过程中的障碍 。
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受精前障碍与克服
?障碍机制：
?物种间花粉管与雌蕊 不亲和,在花粉管到达胚珠
之前，停止伸长而不能受精。
?主要克服办法：
?主要是选择适当的 授粉时期,采用 正反杂交、蒙
导授粉、植物生长调节剂 等。
?另外，有明确试验证据表明，栽培物种和野生种
内均存在 可杂交性 遗传变异，并受简单遗传控制。
利用可杂交性基因，能提高种间杂交的效率。
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受精过程的障碍与克服
?被子植物受精过程属于双受精，对种间杂交受精
过程的生殖生物学研究表明：种间杂交的失败往
往是由于 双受精之一失败 引起的。
?讫今为止，人们对受精的控制机制知之甚少，所
以这一领域明显是一个有风险，但又极可能富有
成效的研究领域。
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(四 ),染色体工程中的现代技术
?在传统远缘杂交的基础上采用的现代技术主要是：
?离体胚 (子房 )培养技术；
?植物染色体显带技术；
?染色体分子原位杂交技术等。
?染色体工程仍然是外源基因转移最有效、最接近
实际应用的技术。
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*三、细胞工程
?细胞工程的主要技术和研究领域包括：
?细胞、原生质体的分离、培养；
?细胞、原生质体植株再生 ；
?体细胞 无性系变异 的诱导、筛选与应用；
?以细胞、原生质体作为 基因工程受体 ；
?细胞、原生质体 融合,杂种细胞筛选、鉴定与应用 。
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(一 )、细胞、原生质体植株再生
?采用体细胞杂交在物种间进行遗传转移与应用的
必要条件是：细胞、原生质体遗传全能性能充分
实现,再生 成新的生物个体。
?对 植物 而言，细胞和原生质体再生技术已经比较
成熟。
?曾经是人们公认难题的禾本科植物原生质体再生在近
二十多年来也已取得巨大进展。
?对 动物 而言，克隆羊“多利”的诞生表明：动物
细胞 (包括人体细胞 )再生成为个体都是可能，其
技术实现需要的仅仅是时间。
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(二 )、植物原生质体作为基因工程的受体
?最初常用的转基因受体有 叶圆片、幼胚、愈伤组
织 等植物组织器官。
?在这些组织、器官中：
?细胞壁的存在会增加操作的难度；
?产生细胞嵌合体现象，难以筛选 转化子 。
?因此原生质体是最具潜力的植物基因工程受体，
转化效率高、筛选方便。
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(三 )、细胞、原生质体融合
?采用细胞、原生质体融合产生杂种细胞，通过诱导再生
获得杂种个体 (双二倍体 )，可 避免有性杂交障碍 。
?动物细胞不具有细胞壁，细胞融合技术较植物成熟和成
功。当然动物细胞融合都局限于获得杂种细胞及其无性
细胞系。
?可以预见：用杂种细胞核代替 维尔 ·穆特 获得克隆羊所采用的
乳腺细胞核可以获得物种间杂种生物个体。
?人与小鼠杂种细胞的无性细胞系曾在人类基因染色体定位研究
上发挥重要的作用。
?植物细胞融合由于细胞壁的存在而受到极大的限制。因
此，去除细胞壁分离原生质体的技术是植物细胞杂交的
基础。获得杂种细胞及其再生植株后，即可进行 物种间
细胞核、染色体以及细胞器 的转移。
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四,基因工程
?基因工程是遗传工程，以至生物工程的核心内容
和最前沿技术，最集中地体现了现代生物学理论
和技术成就。
?限制性内切酶 和 载体 是基因工程的众多理论与技
术基础中最重要的基石。
?基因工程的基本步骤可以概括为：
?目的基因的获得 (基因克隆 )；
?目的基因与载体连接 (DNA分子重组 )；
?重组 DNA分子导入受体；
?转化子的筛选、鉴定。
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限制性内切酶 P166 与 DNA连接酶
?细菌细胞内特异性降解外源 (异源 )核酸分子的核
酸酶。其作用特点是：
?特异性降解异源 DNA分子 (甲基化修饰差异 )；
?I类限制酶随机切割双链 DNA分子,II类限制酶识别、
切割特殊的回文 (对称 )序列；
?II类限制酶交错切割 DNA双链，产生 粘性单链末端 。
?来源不同、具有相同粘性末端 DNA片段在 DNA
连接酶 的作用下可准确连接形成重组 DNA分子。
?通常使用来自 T4噬菌体 DNA连接酶。
?重组 DNA技术 是基因工程最核心的技术，贯穿
于整个基因工程各个步骤中。
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限制性内切酶与 DNA连接酶
?细菌细胞具有防御异源遗传信息进入的手段。异源 DNA分子
进入细菌细胞后，在许多情况下遭到毁灭，这个过程称为 限
制 (restrietion)。限制的能力来源于微生物的一种特殊的酶，
称为限制性核酸内切酶。这是一种水解 DNA的磷酸二脂酶，
它是遗传工程上的一种极其重要的工具酶。
限制性内切酶可分为两大群：
第一群以 EcoB,Ecok等为代表，分子量在约为 300000。
它作用时需要 ATP,Mg++,S-腺苷甲硫氨酸等辅助因子，
能切断双链，切割部位没有特异性。
第二群以大肠杆菌的 EcoR1与嗜血杆菌的 HindⅢ 为代表，
分子量比第一群小，约为 20000～ 100000，与底物作用时，
只需要 Mg++存在。能切断双链，切割部位在 DNA分子上有
特定的碱基顺序，即切割部位具有特异性。因此，遗传工程
多采用这一群。
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限制性内切酶与 DNA连接酶
?第二群限制酶有两大特点：
?(一 )、只在一定核苷酸顺序上起作用，在遗传工程
上应用最多的是 EcoR1，它所切断的部位如 动画 所
示；另一个应用较多的是 HindⅢ 它所切断的部位如
动画 所示
?(二 )、多数可以产生粘性末端，即在酶解时,DNA
双链不在同一地方断开，因而产生的片段两端都带
有数个碱基的单链尾巴，这两个单链尾巴带有互补
的碱基配对顺序，可以互相自动接合成为环状 DNA，
如 动画 所示，因此称为粘性末端
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限制性内切酶
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限制性内切酶
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限制性内切酶
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限制性内切酶
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限制性内切酶
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限
制
性
内
切
酶
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载体 (vector)
?用于承载、克隆、转移目
的基因 (DNA片段 )，能自我
复制的 DNA分子。
? 在基因克隆时：将目的片
段转移到宿主细胞中进行
复制克隆 —— 克隆载体 ；
? 在基因导入受体时：将目
的片段转移到受体细胞中
并进行使之表达 —— 转化
载体 或 表达载体 。
? 常用基因工程载体有：
1,细菌质粒 (克隆 )；
2,λ噬菌体 (克隆 )；
3,柯斯质粒 (克隆 )；
4,穿梭质粒 (克隆 /表达 )；
5,细菌人工染色体 (克隆 /表达 )；
6,酵母人工染色体 (克隆 /表达 )；
7,Ti质粒及其衍生载体 (转化 )。
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载体 (vector)
?作为载体，至少需要具备下列三个条件：
1
2、有多种限制酶的切点，每种酶的切点最好只有一个，
酶切后并不损坏其复制能力及选择标志基因 (gene
marker)，并能嵌入外源 DNA的片段。
3、具有可作为重组 DNA
目前只有少数的细菌质粒,λ噬菌体，类人猿病毒
SV40符合上述的条件。
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载体 (vector)
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载体 (vector)
? 质粒 (如图 11-54)是在细菌中发现的，它是易于取出和引入的小型环状
DNA。一般有 1～ 200Kb左右 (Kb为千碱基对 )它的 DNA分子很小，一般为
细菌染色体 DNA的 0.5～ 3%。
? 一个细菌细胞内质粒的数目可能有 1～ 2个，有的可能有 20～ 60个。
? 基因工程中最有意义的质粒有两类：一类是对多种药物以及重金属和
紫外线有抗性的质粒；一类是携带有合成大肠杆菌素基因的质粒。大肠
杆菌素是具有蛋白质性质的抗生素，它使大肠杆菌敏感株致死。
? λ噬菌体 不易引起生物危害，而且用它作为载体 DNA有助于进入细胞
以及具有在细胞内易于繁殖的优点。 λ噬菌体失去其 DNA总量的 25%，仍
不失活，再多则失活。这一部分 DNA的空挡正好用于转运其他 DNA。 (如
图 11-55)
? 除 λ噬菌体外，用其他 一些病毒 也可以作为载体，特别是将外源 DNA移
入真核细胞并使之繁殖时，就必须找到一种能在真核细胞内增殖的基因
载体，能使灵长类和啮齿类致癌的病毒 SV40(如图 11-56)就符合这种要求。
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载体 (vector)
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载体 (vector)
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载体 (vector)
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载体 (vector)
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载体 (vector)
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载体 (vector)
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载体 (vector)
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载体 (vector)
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载体 (vector)
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载体 (vector)
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载体 (vector)
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载体 (vector)
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(一 )、目的基因的获得
?基因工程最主要的特点是其定向性，也就是对特
定的基因进行操作。因此 分离目的基因 并 获得足
够的拷贝数 (基因克隆 )是基因工程及相关研究工
作的前提。
?1,基因库构建与目的基因分离 ；
?2,PCR扩增、克隆基因；
?3,化学法合成基因。
?获得目的基因后可进行的研究还包括：序列分析、
结构分析、表达机制以及表达机制研究。
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克隆 (clone)的含义
?名词 (pl,clones)：克隆、无性 (繁殖 )系。
?生物个体、细胞的无性繁殖系；
?同一基因或 DNA片段的多份拷贝。
?动词 (cloning)：克隆。
?细胞克隆,从单个细胞产生一组具有同样遗传组成的
细胞；
?分子克隆,获得单个基因 /DNA片段多份拷贝。常用
的方法有①将带有目的片段的重组 DNA分子导入到
特定宿主细胞中，利宿主细胞 DNA复制系统进行复
制；②利用 DNA聚合酶在无细胞系统中复制 (PCR,聚
合酶链式反应 )。
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基因库构建与目的基因分离
?基因库 (基因文库 )：包含特定基因组所有基因,DNA区
段的全部分子克隆的集合体。
?根据分子克隆中所含核酸片段的类型，基因库可分为：
核基因库、染色体库,cDNA库和线粒体库等。
?构建基因库的基本过程以及从基因库中筛选含目的基因
克隆 (亚克隆 )的方法教材上有 简要 的描述，本课程仅作
为初步了解。
?分子克隆实验指南 (分子生物学与基因工程研究作者的圣经 )中
译本有一千多页。
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(二 )、转基因受体
?转基因受体的种类和特性对目的基因导入、导入后筛选、
受体的再生等都有很大的影响。
?植物基因工程 常用受体包括：组织、器官、悬浮培养细
胞、未成熟胚、合子以及原生质体等。可分别通过器官
发生、胚状体或直接发育而获得转基因植株。
?动物基因工程 受体主要有两类。一类是 受精卵或早期胚
胎 。可以发育形成动物个体 (转基因动物 )。许多研究发
现转基因动物获得的性状可以稳定的遗传，表明外源基
因可以整合到受体的染色体上。另一类受体是 体细胞无
性系 。在“多利”诞生之前，这类受体仅局限于获得转
基因细胞系供基因表达等的研究，也可用于药物生产。
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(三 )、目的基因导入受体
?将目的基因导入受体，并整合到受体染色体上是
基因工程目标实现的关键环节。
?在基因工程研究领域的人们倾向于把所有将外源
基因导入受体的过程称为 转化 (transforming)，将
接受外源基因并整合到染色体上的细胞、个体称
为 转化体 /转化子 (transformant或 transgenic ~)。
?最常用转化方法是：
?载体导入；
?理化方法导入 (微注射、基因枪、电穿孔法、化学法 )；
?还有一种特殊的方法是将外源总 DNA导入植物。
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1,载体法导入外源基因
?载体法 —— 将目的基因 连接 到特定的载体 (转化
载体 )上，利用载体 进入细胞并整合到受体染色
体上 的能力实现外源基因转化。
?Ti质粒及其衍生载体 是最常用的植物基因工程转化载
体，具有导入外源基因并整合到染色体上的能力。
?将目的基因与载体连接的过程就是 重组 DNA分子构
建 的过程 (如前述 )。
?将含有转化载体 (重组 DNA分子 )的根癌农杆菌与受体
共培养就可以实现转化。
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2,理化方法导入外源基因
?理化方法是采用物理、化学方法使受体细胞膜产生局部破
损或缺陷,被动吸纳 外源 DNA片段。
(1).微注射 /显微注射 。在显微镜下用注射器将 DNA片段注入
受体细胞 (动物受精卵 )。针头是 ?0.5-10μm尖头玻璃管。
(2).基因枪 。将 DNA片段 (载体?)包在钨或金微粒表面 (?1-
3μm)，用静电或火药爆炸等驱动微粒射入受体。
(3).电穿孔法 。将受体细胞臵于脉冲电场中，可以使细胞膜
产生短暂的 (?30nm)左右的微孔，吸收 DNA片段。
(4).化学法 。许多化学物质，如 PEG(聚乙二醇 )可以刺激原生
质体产生吸收 DNA片段。
?常用 PEG与电穿孔法结合，提高外源 DNA的吸收率。
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*3,外源总 DNA导入植物
?基因工程技术“本土化”过程中，国内生物科技
工作者受基因工程在从分子水平进行基因转移的
启发，设计了一些外源 DNA导入植物的方法。
?这里介绍的两种方法均是采用 供体植物的全部
DNA提取物 作为操作材料，省去了目的基因获
得的过程，所以称为 外源总 DNA导入 。
?(1),减压渗透法 (刘熔山 )；
?(2),花粉管通道导入法 (周光宇 )。
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*(四 )、转化体的筛选与鉴定
?转化体筛选：
?根据转基因技术设计进行，如：载体上带有特异性状
标记，特别是某种抗生素抗性等。
?转化体鉴定有两个层次：
?目的基因是否进入受体 (可以是大肠杆菌、酵母、植
物或动物 )，得到转化体。
即在 DNA水平进行筛选与鉴定，常用方法有：限制
性酶谱分析、核酸分子杂交、核酸序列测定、序列分
析,RFLP等一切可鉴定特定 DNA片段的方法。
?目的基因是否能够正常表达。
包括性状表现、蛋白质产物鉴定。
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第五节 遗传工程 P166
一,遗传工程概述
*二,染色体工程
*三,细胞工程
四,基因工程
五、基因组学
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一,遗传工程概述
?遗传工程 (genetic engineering)是七十年代才开始
发展起来的一门新技术。它是在分子遗传学的理
论基础上，综合采用分子生物学与微生物学的现
代方法和手段建立起来的。这一先进技术的兴起，
标志着现代遗传学已发展到定向控制遗传性状的
新阶段。
3/95
一,遗传工程概述
?遗传研究要阐明遗传与变异的现象和基本规律，探
索遗传与变异的原因及其物质基础。在此基础上：
?解释、研究 生物进化 的原因、过程和规律 (遗传与进化 )。
?改善动、植物和微生物的遗传特性 —— 按照人类的意愿，
创造、培育各种生物的新类型、新品种的 人工进化 过程
(育种学 )。育种工作的理论和技术水平在很大程度上取决
于遗传学所取得的成就。
?讫今为止，动、植物育种的绝大部分成就都是以经
典遗传、细胞遗传和数量遗传理论为基础所取得的。
?六、七十年代的绿色革命；
?育种工作面临的问题。
4/95
一,遗传工程概述
(一 ),遗传工程的基础
?人类对自然改造的能力取决于对自然规律的认识
水平。分子遗传、生物化学及分子生物学、细胞
生物学的理论和技术发展使生物遗传操作的能力
正在不断提高。
?遗传工程的理论与技术基础主要来自于：
1,分子遗传学的理论；
2,生物化学及分子生物学的成就；
3,细胞生物学理论和技术。
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(二 ),遗传工程的含义
?生物技术
?生物工程：
?遗传工程；
?蛋白质工程、酶工程；
?微生物工程；
?……
?遗传工程：在分子遗传
理论、技术的基础上，
通过工程设计与施工方
式，从细胞、分子水平
改造生物遗传特性。
?作为一个综合性的技术
群体系,广义的遗传工
程 包含许多相关的组成
部分，其主要的部分有
三个：
?1,染色体工程；
?2,细胞工程；
?3,基因工程。
?狭义的遗传工程 指
的是基因工程。
6/95
(二 ),遗传工程的含义
? 遗传工程或以分为狭义和广义的两种。
广义的遗传工程包括：基因工程、细胞工程、染色体工程、细胞器
工程。习惯上所讲的遗传工程多指基因工程。
基因工程是一种操作，它不是通过一般传统的有性杂交方法，而是
采取类似于工程建设的方式，按照预先设计的蓝图，借助于实验室的
技术，将某种生物的基因或基因组转移到另一种生物中去，使后者定
向地获得新的遗传性状，成为新的类型。
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(二 ),遗传工程的含义
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(二 ),遗传工程的含义
?一般说来，进行基因工程首先需要一个施工的设计蓝图，
然后才能进行施工的操作。
基因工程的施工程序大致分为 四个步骤,
1、为施工准备材料，即“目的”基因、载体和工具酶等。
2、把目的基因与载体结合成重组 DNA分子。
3、把重组 DNA分子引入受体细胞，建立分子无性繁系
(Clone)或称克隆。
4、从细胞群体中选出所需要的无性繁殖系，并使外源基
因在受体细胞中正确表达。
9/95
(三 )、基因的分离与合成
?目的”基因即在遗传工程中所需要的基因，它的来源不外
乎分离自然的基因与人工合成基因。
?目前采用的方法主要有两种：鸟枪射击法和化学合成基因。
(一 )、利用鸟枪射击法 (Shotgun)分离基因；
用限制性核酸内切酶把一个 DNA分子切成一个或略大于
一个基因的片段，然后把全部片段一一与载体组成重组
DNA分子，转化到大肠杆菌 K12中去，进行纯系繁殖，使
每个基因片段都繁殖到适于研究的数量，再进行分离鉴定，
选择出所需要的基因。
10/95
(三 )、基因的分离与合成
11/95
(三 )、基因的分离与合成
?(二 )、基因的化学合成
1970年考兰纳 (Khorana,H.G)等采用有机化学的方法首
次合成了转录成酵母丙氨酸 tRNA的基因，为基因的合成
开辟了一条新的道路。考兰纳先合成大量彼此互补的 10-
15个核苷酸单链片段，然后用连接酶将它们连接并配合成
双链。
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一,遗传工程概述
13/95
一,遗传工程概述
14/95
一,遗传工程概述
15/95
一,遗传工程概述
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一,遗传工程概述
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一,遗传工程概述
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一,遗传工程概述
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一,遗传工程概述
20/95
一,遗传工程概述
21/95
*二、染色体工程
?染色体工程是物种间遗传转移的 最传统的方式,
也是目前广泛进入生产应用的遗传工程。
?其重要性因作物不同而异：
?对蕃茄而言，世界上任何具有商业价值的栽培品种都
带有一个从野生种导入的抗枯萎病性状，其它六个野
生种则是耐盐性、抗虫性等性状的来源。
?小麦许多抗白粉病基因和抗锈病基因都来源于其野生
近缘物种。
?相反，蚕虫改良则完全是在栽培种 (Vicia faba)内进行
杂交选择。现在还不能从其它任何种导入基因到该作
物中。
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(一 ),种间有性杂交
?生殖隔离是物种形成的原因之一，也是染色体工
程面临的第一个难题，获得种间有性杂种的难易
直接影响外源基因导入栽培作物。
?对不同的作物而言，种间杂交障碍的机制可能截
然不同，其表现阶段也各不相同。目前认为，种
间杂交产生杂种的障碍可能表现在以下几个阶段：
?受精前柱头和花柱中的障碍 ；
?受精过程中的障碍 ；
?受精后胚与种子发育过程中的障碍 。
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受精前障碍与克服
?障碍机制：
?物种间花粉管与雌蕊 不亲和,在花粉管到达胚珠
之前，停止伸长而不能受精。
?主要克服办法：
?主要是选择适当的 授粉时期,采用 正反杂交、蒙
导授粉、植物生长调节剂 等。
?另外，有明确试验证据表明，栽培物种和野生种
内均存在 可杂交性 遗传变异，并受简单遗传控制。
利用可杂交性基因，能提高种间杂交的效率。
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受精过程的障碍与克服
?被子植物受精过程属于双受精，对种间杂交受精
过程的生殖生物学研究表明：种间杂交的失败往
往是由于 双受精之一失败 引起的。
?讫今为止，人们对受精的控制机制知之甚少，所
以这一领域明显是一个有风险，但又极可能富有
成效的研究领域。
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(四 ),染色体工程中的现代技术
?在传统远缘杂交的基础上采用的现代技术主要是：
?离体胚 (子房 )培养技术；
?植物染色体显带技术；
?染色体分子原位杂交技术等。
?染色体工程仍然是外源基因转移最有效、最接近
实际应用的技术。
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*三、细胞工程
?细胞工程的主要技术和研究领域包括：
?细胞、原生质体的分离、培养；
?细胞、原生质体植株再生 ；
?体细胞 无性系变异 的诱导、筛选与应用；
?以细胞、原生质体作为 基因工程受体 ；
?细胞、原生质体 融合,杂种细胞筛选、鉴定与应用 。
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(一 )、细胞、原生质体植株再生
?采用体细胞杂交在物种间进行遗传转移与应用的
必要条件是：细胞、原生质体遗传全能性能充分
实现,再生 成新的生物个体。
?对 植物 而言，细胞和原生质体再生技术已经比较
成熟。
?曾经是人们公认难题的禾本科植物原生质体再生在近
二十多年来也已取得巨大进展。
?对 动物 而言，克隆羊“多利”的诞生表明：动物
细胞 (包括人体细胞 )再生成为个体都是可能，其
技术实现需要的仅仅是时间。
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(二 )、植物原生质体作为基因工程的受体
?最初常用的转基因受体有 叶圆片、幼胚、愈伤组
织 等植物组织器官。
?在这些组织、器官中：
?细胞壁的存在会增加操作的难度；
?产生细胞嵌合体现象，难以筛选 转化子 。
?因此原生质体是最具潜力的植物基因工程受体，
转化效率高、筛选方便。
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(三 )、细胞、原生质体融合
?采用细胞、原生质体融合产生杂种细胞，通过诱导再生
获得杂种个体 (双二倍体 )，可 避免有性杂交障碍 。
?动物细胞不具有细胞壁，细胞融合技术较植物成熟和成
功。当然动物细胞融合都局限于获得杂种细胞及其无性
细胞系。
?可以预见：用杂种细胞核代替 维尔 ·穆特 获得克隆羊所采用的
乳腺细胞核可以获得物种间杂种生物个体。
?人与小鼠杂种细胞的无性细胞系曾在人类基因染色体定位研究
上发挥重要的作用。
?植物细胞融合由于细胞壁的存在而受到极大的限制。因
此，去除细胞壁分离原生质体的技术是植物细胞杂交的
基础。获得杂种细胞及其再生植株后，即可进行 物种间
细胞核、染色体以及细胞器 的转移。
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四,基因工程
?基因工程是遗传工程，以至生物工程的核心内容
和最前沿技术，最集中地体现了现代生物学理论
和技术成就。
?限制性内切酶 和 载体 是基因工程的众多理论与技
术基础中最重要的基石。
?基因工程的基本步骤可以概括为：
?目的基因的获得 (基因克隆 )；
?目的基因与载体连接 (DNA分子重组 )；
?重组 DNA分子导入受体；
?转化子的筛选、鉴定。
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限制性内切酶 P166 与 DNA连接酶
?细菌细胞内特异性降解外源 (异源 )核酸分子的核
酸酶。其作用特点是：
?特异性降解异源 DNA分子 (甲基化修饰差异 )；
?I类限制酶随机切割双链 DNA分子,II类限制酶识别、
切割特殊的回文 (对称 )序列；
?II类限制酶交错切割 DNA双链，产生 粘性单链末端 。
?来源不同、具有相同粘性末端 DNA片段在 DNA
连接酶 的作用下可准确连接形成重组 DNA分子。
?通常使用来自 T4噬菌体 DNA连接酶。
?重组 DNA技术 是基因工程最核心的技术，贯穿
于整个基因工程各个步骤中。
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限制性内切酶与 DNA连接酶
?细菌细胞具有防御异源遗传信息进入的手段。异源 DNA分子
进入细菌细胞后，在许多情况下遭到毁灭，这个过程称为 限
制 (restrietion)。限制的能力来源于微生物的一种特殊的酶，
称为限制性核酸内切酶。这是一种水解 DNA的磷酸二脂酶，
它是遗传工程上的一种极其重要的工具酶。
限制性内切酶可分为两大群：
第一群以 EcoB,Ecok等为代表，分子量在约为 300000。
它作用时需要 ATP,Mg++,S-腺苷甲硫氨酸等辅助因子，
能切断双链，切割部位没有特异性。
第二群以大肠杆菌的 EcoR1与嗜血杆菌的 HindⅢ 为代表，
分子量比第一群小，约为 20000～ 100000，与底物作用时，
只需要 Mg++存在。能切断双链，切割部位在 DNA分子上有
特定的碱基顺序，即切割部位具有特异性。因此，遗传工程
多采用这一群。
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限制性内切酶与 DNA连接酶
?第二群限制酶有两大特点：
?(一 )、只在一定核苷酸顺序上起作用，在遗传工程
上应用最多的是 EcoR1，它所切断的部位如 动画 所
示；另一个应用较多的是 HindⅢ 它所切断的部位如
动画 所示
?(二 )、多数可以产生粘性末端，即在酶解时,DNA
双链不在同一地方断开，因而产生的片段两端都带
有数个碱基的单链尾巴，这两个单链尾巴带有互补
的碱基配对顺序，可以互相自动接合成为环状 DNA，
如 动画 所示，因此称为粘性末端
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限制性内切酶
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限制性内切酶
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限制性内切酶
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限制性内切酶
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限制性内切酶
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限
制
性
内
切
酶
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载体 (vector)
?用于承载、克隆、转移目
的基因 (DNA片段 )，能自我
复制的 DNA分子。
? 在基因克隆时：将目的片
段转移到宿主细胞中进行
复制克隆 —— 克隆载体 ；
? 在基因导入受体时：将目
的片段转移到受体细胞中
并进行使之表达 —— 转化
载体 或 表达载体 。
? 常用基因工程载体有：
1,细菌质粒 (克隆 )；
2,λ噬菌体 (克隆 )；
3,柯斯质粒 (克隆 )；
4,穿梭质粒 (克隆 /表达 )；
5,细菌人工染色体 (克隆 /表达 )；
6,酵母人工染色体 (克隆 /表达 )；
7,Ti质粒及其衍生载体 (转化 )。
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载体 (vector)
?作为载体，至少需要具备下列三个条件：
1
2、有多种限制酶的切点，每种酶的切点最好只有一个，
酶切后并不损坏其复制能力及选择标志基因 (gene
marker)，并能嵌入外源 DNA的片段。
3、具有可作为重组 DNA
目前只有少数的细菌质粒,λ噬菌体，类人猿病毒
SV40符合上述的条件。
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载体 (vector)
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载体 (vector)
? 质粒 (如图 11-54)是在细菌中发现的，它是易于取出和引入的小型环状
DNA。一般有 1～ 200Kb左右 (Kb为千碱基对 )它的 DNA分子很小，一般为
细菌染色体 DNA的 0.5～ 3%。
? 一个细菌细胞内质粒的数目可能有 1～ 2个，有的可能有 20～ 60个。
? 基因工程中最有意义的质粒有两类：一类是对多种药物以及重金属和
紫外线有抗性的质粒；一类是携带有合成大肠杆菌素基因的质粒。大肠
杆菌素是具有蛋白质性质的抗生素，它使大肠杆菌敏感株致死。
? λ噬菌体 不易引起生物危害，而且用它作为载体 DNA有助于进入细胞
以及具有在细胞内易于繁殖的优点。 λ噬菌体失去其 DNA总量的 25%，仍
不失活，再多则失活。这一部分 DNA的空挡正好用于转运其他 DNA。 (如
图 11-55)
? 除 λ噬菌体外，用其他 一些病毒 也可以作为载体，特别是将外源 DNA移
入真核细胞并使之繁殖时，就必须找到一种能在真核细胞内增殖的基因
载体，能使灵长类和啮齿类致癌的病毒 SV40(如图 11-56)就符合这种要求。
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载体 (vector)
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(一 )、目的基因的获得
?基因工程最主要的特点是其定向性，也就是对特
定的基因进行操作。因此 分离目的基因 并 获得足
够的拷贝数 (基因克隆 )是基因工程及相关研究工
作的前提。
?1,基因库构建与目的基因分离 ；
?2,PCR扩增、克隆基因；
?3,化学法合成基因。
?获得目的基因后可进行的研究还包括：序列分析、
结构分析、表达机制以及表达机制研究。
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克隆 (clone)的含义
?名词 (pl,clones)：克隆、无性 (繁殖 )系。
?生物个体、细胞的无性繁殖系；
?同一基因或 DNA片段的多份拷贝。
?动词 (cloning)：克隆。
?细胞克隆,从单个细胞产生一组具有同样遗传组成的
细胞；
?分子克隆,获得单个基因 /DNA片段多份拷贝。常用
的方法有①将带有目的片段的重组 DNA分子导入到
特定宿主细胞中，利宿主细胞 DNA复制系统进行复
制；②利用 DNA聚合酶在无细胞系统中复制 (PCR,聚
合酶链式反应 )。
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基因库构建与目的基因分离
?基因库 (基因文库 )：包含特定基因组所有基因,DNA区
段的全部分子克隆的集合体。
?根据分子克隆中所含核酸片段的类型，基因库可分为：
核基因库、染色体库,cDNA库和线粒体库等。
?构建基因库的基本过程以及从基因库中筛选含目的基因
克隆 (亚克隆 )的方法教材上有 简要 的描述，本课程仅作
为初步了解。
?分子克隆实验指南 (分子生物学与基因工程研究作者的圣经 )中
译本有一千多页。
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(二 )、转基因受体
?转基因受体的种类和特性对目的基因导入、导入后筛选、
受体的再生等都有很大的影响。
?植物基因工程 常用受体包括：组织、器官、悬浮培养细
胞、未成熟胚、合子以及原生质体等。可分别通过器官
发生、胚状体或直接发育而获得转基因植株。
?动物基因工程 受体主要有两类。一类是 受精卵或早期胚
胎 。可以发育形成动物个体 (转基因动物 )。许多研究发
现转基因动物获得的性状可以稳定的遗传，表明外源基
因可以整合到受体的染色体上。另一类受体是 体细胞无
性系 。在“多利”诞生之前，这类受体仅局限于获得转
基因细胞系供基因表达等的研究，也可用于药物生产。
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(三 )、目的基因导入受体
?将目的基因导入受体，并整合到受体染色体上是
基因工程目标实现的关键环节。
?在基因工程研究领域的人们倾向于把所有将外源
基因导入受体的过程称为 转化 (transforming)，将
接受外源基因并整合到染色体上的细胞、个体称
为 转化体 /转化子 (transformant或 transgenic ~)。
?最常用转化方法是：
?载体导入；
?理化方法导入 (微注射、基因枪、电穿孔法、化学法 )；
?还有一种特殊的方法是将外源总 DNA导入植物。
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1,载体法导入外源基因
?载体法 —— 将目的基因 连接 到特定的载体 (转化
载体 )上，利用载体 进入细胞并整合到受体染色
体上 的能力实现外源基因转化。
?Ti质粒及其衍生载体 是最常用的植物基因工程转化载
体，具有导入外源基因并整合到染色体上的能力。
?将目的基因与载体连接的过程就是 重组 DNA分子构
建 的过程 (如前述 )。
?将含有转化载体 (重组 DNA分子 )的根癌农杆菌与受体
共培养就可以实现转化。
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2,理化方法导入外源基因
?理化方法是采用物理、化学方法使受体细胞膜产生局部破
损或缺陷,被动吸纳 外源 DNA片段。
(1).微注射 /显微注射 。在显微镜下用注射器将 DNA片段注入
受体细胞 (动物受精卵 )。针头是 ?0.5-10μm尖头玻璃管。
(2).基因枪 。将 DNA片段 (载体?)包在钨或金微粒表面 (?1-
3μm)，用静电或火药爆炸等驱动微粒射入受体。
(3).电穿孔法 。将受体细胞臵于脉冲电场中，可以使细胞膜
产生短暂的 (?30nm)左右的微孔，吸收 DNA片段。
(4).化学法 。许多化学物质，如 PEG(聚乙二醇 )可以刺激原生
质体产生吸收 DNA片段。
?常用 PEG与电穿孔法结合，提高外源 DNA的吸收率。
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*3,外源总 DNA导入植物
?基因工程技术“本土化”过程中，国内生物科技
工作者受基因工程在从分子水平进行基因转移的
启发，设计了一些外源 DNA导入植物的方法。
?这里介绍的两种方法均是采用 供体植物的全部
DNA提取物 作为操作材料，省去了目的基因获
得的过程，所以称为 外源总 DNA导入 。
?(1),减压渗透法 (刘熔山 )；
?(2),花粉管通道导入法 (周光宇 )。
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*(四 )、转化体的筛选与鉴定
?转化体筛选：
?根据转基因技术设计进行，如：载体上带有特异性状
标记，特别是某种抗生素抗性等。
?转化体鉴定有两个层次：
?目的基因是否进入受体 (可以是大肠杆菌、酵母、植
物或动物 )，得到转化体。
即在 DNA水平进行筛选与鉴定，常用方法有：限制
性酶谱分析、核酸分子杂交、核酸序列测定、序列分
析,RFLP等一切可鉴定特定 DNA片段的方法。
?目的基因是否能够正常表达。
包括性状表现、蛋白质产物鉴定。
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