1
1575年，西班牙医生 N.Monardes发现。
1852年,Sir George Stokes对荧光产生的机理作了解释，并提出了“荧光”。
1867年，首次用于分析测定。
1928年,Jette和 West提出第一台光电荧光计。
1952年，商品荧光分光光度计出现。
8.7 分子荧光与分子磷光 分析法
2
8.7.1 发光机理 (Jablonski Diagram)
荧光寿命,
10－ 9～ 10－ 7 s
磷光寿命,
10－ 4～ 10 s
分子吸光与发光示意图
3
吸收光谱发射光谱蒽的 激发光谱（吸收光谱） 和 发射光谱（荧光光谱）
激发光谱,Excitation Spectrum,激发波长,?ex
发射光谱 Emission Spectrum,发射波长,?em
5
荧光光谱的特点
Stokes位移：分子荧光的发射峰相对于吸收峰位移到较长的波长,
荧光发射光谱的形状与激发波长的选择无关,
镜像规则：荧光发射光谱和它的吸收光谱呈镜像对称关系,
6
8.7.2 定量分析的基础
—荧光强度 (F )与物质浓度 (c)的关系在 稀溶液 中：
F＝ 2.3Kφεb cI0＝ 2.3KφAI0
φ — 荧光物质的荧光效率 (量子产率 )：
ε— 荧光物质的吸光系数
b— 液层厚度
I0— 入射光强度
K— 检测效率（由仪器决定）
发射荧光的量子数吸收激发光的量子数当 b,I0一定时,F＝ Kc
7
F
c
一般当 εb c? 0.05 时,F 与 c呈线性关系高浓度 时，荧光物质发生 自熄灭 和自吸收 现象,使 F与 c不呈线性关系
F
c
8
8.7.3 荧光与分子结构的关系
1.共轭效应? →?* 跃迁芳香族化合物、五元杂环上取代苯基,
共轭体系越大,越易产生荧光,荧光效率也增大,
─(CH=CH)3─ φ=0.68
─(CH=CH)2─ φ=0.28
9
2,刚性结构和共平面效应酚酞 (无荧光 )
8－羟基喹啉 (弱荧光 ) 红色荧光
C
O-O O
COO-
C
O
COO-
-O
N
O- N
O
Mg
N
O
荧光黄
10
联二苯 φ=0.2
芴 φ= 1.0
3,4-苯并芘
( 强荧光物质 )
CH
2
11
3,取代基的作用给电子基增强荧光,
－ OH,－ OR,－ NH2,－ NHR,－ NR2,－ C≡N
吸电子基减弱荧光：
－ COOH,－ C=O,－ NO2,－ N＝ N,－ Cl,－ Br,－ I
与?体系作用小的取代基影响不明显,
－ SO3R,－ NH3＋,－ SH,－ F,－ R。
COOH NO2 I 无荧光
NH2 OH
比 荧光强 50倍
12
取代基之间若发生氢键，增强分子平面性和刚性会加强荧光,
碱性有荧光
COOH
OH
无荧光
OH
COOH 水杨酸中性、碱性均有荧光
OH
OH
C
O
13
8.7.4 影响荧光强度的主要因素
1,浓度,稀溶液,F∝ c (?bc≤0.05)
2,光源,F∝ I0,应强度大，稳定。
3,温度,T 低,φ增加。
荧光素钠的乙醇溶液,T<0℃ 时,每降低
10℃,φ增加 3%,-80 ℃ 时 φ=100%,
4,酸度,
有荧光无荧光
OH O—
14
8.7.5 荧光光度计及荧光测定方法
I0 It
F
氙灯 (或高压汞灯）
（ 200-800 nm)
光电倍增管荧光光度计示意图
15
荧光仪部件激发光源,能够在紫外 -可见光区连续发光,
常用 氙灯,高压汞灯 或 激光光源,
样品池,石英池,四壁透明,
单色器,两个 光栅单色器,分置于样品池前后,
检测器,光电池或 光电倍增管,与激发光 成直角的方向 检测荧光,
16
荧光光度计光路图电源 光度计 记录仪光电倍增管试样液池光源
17
测定方法 — 标准曲线法
1,确定?ex和?em (激发光谱和发射光谱 )；
2,确定适宜的 条件,试剂浓度,pH,T,t
等；
3,以标准溶液做 工作曲线 ；
4,测未知样 的荧光强度 (F),根据工作曲线计算荧光物质的浓度,
18
8.7.6 荧光分析法的特点和应用
灵敏度高,测定下限 0.1～ 0.001 μg/mL,
比分光光度法高 2～ 4个数量级。
（在黑背景下检测；光源的强度大）
选择性高：
适当选择激发光的波长和荧光测定的波 长；
应用荧光寿命的差别 –时间分辨技术。
19
荧光测定的选择性蒽的激发和发射光谱菲 和 蒽 的荧光光谱
（激发波长 265 nm)
蒽 菲
菲在 360 nm以上无吸收，用
365 nm激发光时，菲无荧光，
可以在 400 nm测定蒽的荧光。
在 265 nm,蒽和菲均有吸收，
以此波长的光激发，在 350 nm
只有菲有荧光，故可测定菲。
20
MFS与 UV/Vis 法比较：
原理
UV/Vis 吸收
MFS 发射测定方法
I0 It
F
灵敏度,选择性
10-5～ 10-6mol·L-1
10-7～ 10-9 mol·L-1
I0 F
21
荧光光度法的应用生物化学分析，生理医学研究，临床检测,
直接测定能产生荧光的物质,
带苯环的氨基酸：色氨酸、酪氨酸、苯基丙氨酸,
测定能与荧光试剂反应生成荧光化合物的物质,
荧光生色团标记蛋白质，研究蛋白质的结构；
致癌物同核酸结合常引起显著的荧光；
无机离子（ Mg2+,Al3+,Zn2+,Be+等）可同试剂形成荧光络合物。
荧光熄灭法测定猝灭剂
Ni2+对 Al-PAN络合物有荧光猝灭作用，可测 Ni2+（ 6× 10-
5 ～ 6× 10-3?g·mL-1）
22
N
OH
HO
OH
N=N
HO
SO3Na8－羟基喹啉 (Al,Be等 ) 茜素紫酱 R(Al,F-等 )
用于测定无机离子的有机试剂
C C
O OH
H
安息香 (B,Zn,Ge,Si等 )黄酮醇 (Zr,Sn等 )
O
OH
O
23
举例 — 痕量 3,4-苯并芘的测定,
苯并芘萃取（环己酮或石油醚） → 浓缩 → 层析
→ 以 H2SO4 溶解苯并芘 → 荧光分析荧光测定：
ex = 520 nm
em= 545 nm
24
8.7.7 磷光分析法
获得较强磷光应采取的措施,
1,低温,
禁阻跃迁,几率小 ;
系间窜跃,寿命长,S1 T1 S0无辐射 辐射
磷光分析仪器液槽,石英液槽放入盛液氮的石英杜瓦瓶,
斩波片,在激发光单色器与液槽之间以及在发射光单色器与液槽之间各装一个斩波片,
应用,主要用于有机分析,与荧光法互补,
室温
2,固体磷光，吸附在滤纸或纤维素上,
3,加表面活性剂,形成胶束缔合物,增强刚性,
4,重原子效应 (Ag+,Pb2+,Tl+…… 盐类 ),利于系间跨越,
25
室温磷光
--固体样品
低温磷光
--液体样品样品管镀银未镀银Io
液氮低温磷光的样品装置
26
转筒式磷光镜（ a）和转盘式磷光镜（ b）
27
第 4章
1,平衡常数,各级形成常数 Ki,不稳定常数 K不,酸的质子化常数 K H,累积形成常数?i ；分布系数 。
络合反应的副反应系数 （?Y,?M,?MY） 与条件常数 （ K?） 的计算 。
2,络合滴定基本原理：金属指示剂的作用原理 ; 滴定曲线,终点误差,误差公式,可以准确滴定的条件 （ lgcK?≥6） ；单一离子滴定时最高酸度与最低酸度的限制及酸度控制 。
28
3,混合离子的选择性滴定,可控制酸度分步滴定的条件 (?lgcK≥6),适宜酸度 ; 络合掩蔽 及解蔽的应用 ; 氧化还原掩蔽法及沉淀掩蔽法的应用示例 。
会设计分析方案 。
4,络合滴定的方式和应用,
直接滴定,返滴定,析出法,置换滴定,间接滴定法 应用示例 ；
EDTA标准溶液的配制和标定,水质对测定结果的影响 。
29
第 5章反应完全程度,不同类型的反应对 要求不同
2,影响反应速度的因素,浓度、温度、催化剂、诱导反应
3,滴定曲线,与 有关,与浓度无关
4,指示剂,氧还、自身、专用
5,各种方法的特点、应用条件、测定事例
6,计算,等物质的量规则 (基本单元 ),换算因数法
12''
lg
0,0 5 9
p
K
1,条件电位,离子强度、沉淀、络合、酸度的影响反应平衡常数,
30
第 6,7章
1,掌握莫尔法,佛尔哈德法,法扬司法中所用的指示剂,方法特点,应用条件 。
2,掌握溶解度与溶度积,条件溶度积 的换算关系 ;
4,了解重量法的特点,沉淀重量法的分析过程及对沉淀形,称量形的要求；
5,一般了解沉淀的形成过程和影响沉淀纯度的因素；
6,掌握晶形沉淀的条件和称量形的获得。
31
1,分子对光的吸收 — 吸收曲线 。
2,掌握光吸收基本定律 — 朗伯 -比尔定律：
A=lgI0/I = － lgT=Kbc,摩尔吸光系数?,比吸光系数 。 式中各参数的物理意义,定量计算 。
3,方法和仪器：基本部件,分光光度计的类型,测量误差
(准确度 ),灵敏度 (?,S,） 。
4,显色反应及条件的确定,显色剂用量,酸度,时间,温度,
干扰及消除 。
5,应用,单一组分测定示例,多组分测定,光度滴定,络合物组成的测定,酸碱离解常数的测定 。
6,紫外 -可见光度法在定性分析中的应用,了解能级跃迁的基本类型,共轭烯烃键数与能量的关系,溶剂极性对吸收光谱的影响,
7,分子荧光与分子磷光的产生及特点,仪器比较,
第 8章
32
1,沉淀分离类型,提高选择性的方法
2,溶剂萃取分离,KD,D,E 的定义与计算
3,离子交换分离,树脂的种类和性质、应用。
4,色谱法：柱、纸、薄层色谱的定性定量应用,比移值 。
第 9章
33
中文系程玉缀教授于 96年 1月所作,考场歌,
燕园学子,人中龙凤；身经百战,从从容容 。
笔走龙蛇,文思泉涌；寥寥数题,笑谈之中 。
遵守考纪,严肃校风；因小失大,徒然无功 。
临场赋诗,肺腑相送：瓜田李下,请君自重 ！
春华秋实,来自劳动；有限人生,无上光荣 ！
34
1575年，西班牙医生 N.Monardes发现。
1852年,Sir George Stokes对荧光产生的机理作了解释，并提出了“荧光”。
1867年，首次用于分析测定。
1928年,Jette和 West提出第一台光电荧光计。
1952年，商品荧光分光光度计出现。
8.7 分子荧光与分子磷光 分析法
2
8.7.1 发光机理 (Jablonski Diagram)
荧光寿命,
10－ 9～ 10－ 7 s
磷光寿命,
10－ 4～ 10 s
分子吸光与发光示意图
3
吸收光谱发射光谱蒽的 激发光谱（吸收光谱） 和 发射光谱（荧光光谱）
激发光谱,Excitation Spectrum,激发波长,?ex
发射光谱 Emission Spectrum,发射波长,?em
5
荧光光谱的特点
Stokes位移：分子荧光的发射峰相对于吸收峰位移到较长的波长,
荧光发射光谱的形状与激发波长的选择无关,
镜像规则：荧光发射光谱和它的吸收光谱呈镜像对称关系,
6
8.7.2 定量分析的基础
—荧光强度 (F )与物质浓度 (c)的关系在 稀溶液 中：
F＝ 2.3Kφεb cI0＝ 2.3KφAI0
φ — 荧光物质的荧光效率 (量子产率 )：
ε— 荧光物质的吸光系数
b— 液层厚度
I0— 入射光强度
K— 检测效率（由仪器决定）
发射荧光的量子数吸收激发光的量子数当 b,I0一定时,F＝ Kc
7
F
c
一般当 εb c? 0.05 时,F 与 c呈线性关系高浓度 时，荧光物质发生 自熄灭 和自吸收 现象,使 F与 c不呈线性关系
F
c
8
8.7.3 荧光与分子结构的关系
1.共轭效应? →?* 跃迁芳香族化合物、五元杂环上取代苯基,
共轭体系越大,越易产生荧光,荧光效率也增大,
─(CH=CH)3─ φ=0.68
─(CH=CH)2─ φ=0.28
9
2,刚性结构和共平面效应酚酞 (无荧光 )
8－羟基喹啉 (弱荧光 ) 红色荧光
C
O-O O
COO-
C
O
COO-
-O
N
O- N
O
Mg
N
O
荧光黄
10
联二苯 φ=0.2
芴 φ= 1.0
3,4-苯并芘
( 强荧光物质 )
CH
2
11
3,取代基的作用给电子基增强荧光,
－ OH,－ OR,－ NH2,－ NHR,－ NR2,－ C≡N
吸电子基减弱荧光：
－ COOH,－ C=O,－ NO2,－ N＝ N,－ Cl,－ Br,－ I
与?体系作用小的取代基影响不明显,
－ SO3R,－ NH3＋,－ SH,－ F,－ R。
COOH NO2 I 无荧光
NH2 OH
比 荧光强 50倍
12
取代基之间若发生氢键，增强分子平面性和刚性会加强荧光,
碱性有荧光
COOH
OH
无荧光
OH
COOH 水杨酸中性、碱性均有荧光
OH
OH
C
O
13
8.7.4 影响荧光强度的主要因素
1,浓度,稀溶液,F∝ c (?bc≤0.05)
2,光源,F∝ I0,应强度大，稳定。
3,温度,T 低,φ增加。
荧光素钠的乙醇溶液,T<0℃ 时,每降低
10℃,φ增加 3%,-80 ℃ 时 φ=100%,
4,酸度,
有荧光无荧光
OH O—
14
8.7.5 荧光光度计及荧光测定方法
I0 It
F
氙灯 (或高压汞灯）
（ 200-800 nm)
光电倍增管荧光光度计示意图
15
荧光仪部件激发光源,能够在紫外 -可见光区连续发光,
常用 氙灯,高压汞灯 或 激光光源,
样品池,石英池,四壁透明,
单色器,两个 光栅单色器,分置于样品池前后,
检测器,光电池或 光电倍增管,与激发光 成直角的方向 检测荧光,
16
荧光光度计光路图电源 光度计 记录仪光电倍增管试样液池光源
17
测定方法 — 标准曲线法
1,确定?ex和?em (激发光谱和发射光谱 )；
2,确定适宜的 条件,试剂浓度,pH,T,t
等；
3,以标准溶液做 工作曲线 ；
4,测未知样 的荧光强度 (F),根据工作曲线计算荧光物质的浓度,
18
8.7.6 荧光分析法的特点和应用
灵敏度高,测定下限 0.1～ 0.001 μg/mL,
比分光光度法高 2～ 4个数量级。
（在黑背景下检测；光源的强度大）
选择性高：
适当选择激发光的波长和荧光测定的波 长；
应用荧光寿命的差别 –时间分辨技术。
19
荧光测定的选择性蒽的激发和发射光谱菲 和 蒽 的荧光光谱
（激发波长 265 nm)
蒽 菲
菲在 360 nm以上无吸收，用
365 nm激发光时，菲无荧光，
可以在 400 nm测定蒽的荧光。
在 265 nm,蒽和菲均有吸收，
以此波长的光激发，在 350 nm
只有菲有荧光，故可测定菲。
20
MFS与 UV/Vis 法比较：
原理
UV/Vis 吸收
MFS 发射测定方法
I0 It
F
灵敏度,选择性
10-5～ 10-6mol·L-1
10-7～ 10-9 mol·L-1
I0 F
21
荧光光度法的应用生物化学分析，生理医学研究，临床检测,
直接测定能产生荧光的物质,
带苯环的氨基酸：色氨酸、酪氨酸、苯基丙氨酸,
测定能与荧光试剂反应生成荧光化合物的物质,
荧光生色团标记蛋白质，研究蛋白质的结构；
致癌物同核酸结合常引起显著的荧光；
无机离子（ Mg2+,Al3+,Zn2+,Be+等）可同试剂形成荧光络合物。
荧光熄灭法测定猝灭剂
Ni2+对 Al-PAN络合物有荧光猝灭作用，可测 Ni2+（ 6× 10-
5 ～ 6× 10-3?g·mL-1）
22
N
OH
HO
OH
N=N
HO
SO3Na8－羟基喹啉 (Al,Be等 ) 茜素紫酱 R(Al,F-等 )
用于测定无机离子的有机试剂
C C
O OH
H
安息香 (B,Zn,Ge,Si等 )黄酮醇 (Zr,Sn等 )
O
OH
O
23
举例 — 痕量 3,4-苯并芘的测定,
苯并芘萃取（环己酮或石油醚） → 浓缩 → 层析
→ 以 H2SO4 溶解苯并芘 → 荧光分析荧光测定：
ex = 520 nm
em= 545 nm
24
8.7.7 磷光分析法
获得较强磷光应采取的措施,
1,低温,
禁阻跃迁,几率小 ;
系间窜跃,寿命长,S1 T1 S0无辐射 辐射
磷光分析仪器液槽,石英液槽放入盛液氮的石英杜瓦瓶,
斩波片,在激发光单色器与液槽之间以及在发射光单色器与液槽之间各装一个斩波片,
应用,主要用于有机分析,与荧光法互补,
室温
2,固体磷光，吸附在滤纸或纤维素上,
3,加表面活性剂,形成胶束缔合物,增强刚性,
4,重原子效应 (Ag+,Pb2+,Tl+…… 盐类 ),利于系间跨越,
25
室温磷光
--固体样品
低温磷光
--液体样品样品管镀银未镀银Io
液氮低温磷光的样品装置
26
转筒式磷光镜（ a）和转盘式磷光镜（ b）
27
第 4章
1,平衡常数,各级形成常数 Ki,不稳定常数 K不,酸的质子化常数 K H,累积形成常数?i ；分布系数 。
络合反应的副反应系数 （?Y,?M,?MY） 与条件常数 （ K?） 的计算 。
2,络合滴定基本原理：金属指示剂的作用原理 ; 滴定曲线,终点误差,误差公式,可以准确滴定的条件 （ lgcK?≥6） ；单一离子滴定时最高酸度与最低酸度的限制及酸度控制 。
28
3,混合离子的选择性滴定,可控制酸度分步滴定的条件 (?lgcK≥6),适宜酸度 ; 络合掩蔽 及解蔽的应用 ; 氧化还原掩蔽法及沉淀掩蔽法的应用示例 。
会设计分析方案 。
4,络合滴定的方式和应用,
直接滴定,返滴定,析出法,置换滴定,间接滴定法 应用示例 ；
EDTA标准溶液的配制和标定,水质对测定结果的影响 。
29
第 5章反应完全程度,不同类型的反应对 要求不同
2,影响反应速度的因素,浓度、温度、催化剂、诱导反应
3,滴定曲线,与 有关,与浓度无关
4,指示剂,氧还、自身、专用
5,各种方法的特点、应用条件、测定事例
6,计算,等物质的量规则 (基本单元 ),换算因数法
12''
lg
0,0 5 9
p
K
1,条件电位,离子强度、沉淀、络合、酸度的影响反应平衡常数,
30
第 6,7章
1,掌握莫尔法,佛尔哈德法,法扬司法中所用的指示剂,方法特点,应用条件 。
2,掌握溶解度与溶度积,条件溶度积 的换算关系 ;
4,了解重量法的特点,沉淀重量法的分析过程及对沉淀形,称量形的要求；
5,一般了解沉淀的形成过程和影响沉淀纯度的因素；
6,掌握晶形沉淀的条件和称量形的获得。
31
1,分子对光的吸收 — 吸收曲线 。
2,掌握光吸收基本定律 — 朗伯 -比尔定律：
A=lgI0/I = － lgT=Kbc,摩尔吸光系数?,比吸光系数 。 式中各参数的物理意义,定量计算 。
3,方法和仪器：基本部件,分光光度计的类型,测量误差
(准确度 ),灵敏度 (?,S,） 。
4,显色反应及条件的确定,显色剂用量,酸度,时间,温度,
干扰及消除 。
5,应用,单一组分测定示例,多组分测定,光度滴定,络合物组成的测定,酸碱离解常数的测定 。
6,紫外 -可见光度法在定性分析中的应用,了解能级跃迁的基本类型,共轭烯烃键数与能量的关系,溶剂极性对吸收光谱的影响,
7,分子荧光与分子磷光的产生及特点,仪器比较,
第 8章
32
1,沉淀分离类型,提高选择性的方法
2,溶剂萃取分离,KD,D,E 的定义与计算
3,离子交换分离,树脂的种类和性质、应用。
4,色谱法：柱、纸、薄层色谱的定性定量应用,比移值 。
第 9章
33
中文系程玉缀教授于 96年 1月所作,考场歌,
燕园学子,人中龙凤；身经百战,从从容容 。
笔走龙蛇,文思泉涌；寥寥数题,笑谈之中 。
遵守考纪,严肃校风；因小失大,徒然无功 。
临场赋诗,肺腑相送：瓜田李下,请君自重 ！
春华秋实,来自劳动；有限人生,无上光荣 ！
34
