吉林农业大学学报 2005,27 (3),344～ 349
Journal of Jilin Agricultural University
鱼类免疫增强剂的研究现状 X
王桂芹 1,2,周洪琪 1XX
(11 上海水产大学生命科学与技术学院,上海 200090 ; 21 吉林农业大学动物科技学院,长春 130118)
摘 要,综述了对鱼类免疫效果较好的多糖、微量营养物等免疫增强剂及其作用机理,同时对其使用中存在的问题及发展趋势做一评述。
关键词,水产养殖 ; 免疫增强剂 ; 非特异性免疫 ; 多糖 ; 维生素中图分类号,S963 文献标识码,A 文章编号,100025684 (2005) 0320344206
Current Re search Status of Fish Immuno stimulants
WANG Gui2qin1,2,ZHOU Hong2qin1
(1,College of Aqua2Life Science and Technology,Shanghai Fisheries University,Shanghai 200090,
China ; 2,College of Animal Science and Technology,Jilin Agricultural University,Changchun 130118,
China)
Abstract,Immunostimulants are valuable for the prevention and control of fish diseases in aquacul2
ture1Several immunostimulants such as polysaccharide and micronutritional factors and their effective
mechanism are reviewed,meantime,existing problems in immunostimulant application and future re2
search tendency are described1
Key words,aquaculture ; immunostimulant ; non2specific immunity ; polysaccharide ; vitamin
随着集约化养殖的发展,鱼类病害成了制约其健康养殖的关键因素之一。目前水产养殖中对水产动物疾病的防治常使用抗生素。由于抗生素等化学药物的长期使用和滥用,鱼类对抗生素的耐药致病菌株不断增多,使其免疫功能下降,药物在水产品中的残留也严重影响食物的安全和人类的健康。免疫增强剂是指单独或同时与抗原使用均能增强动物免疫反应的物质,这些物质可增强鱼类抵抗外界病原体 (细菌、真菌、病毒和寄生虫等 )侵袭的能力,同时也可减轻外界环境胁迫对鱼类的免疫抑制作用。水产动物的生长发育受多种因素的影响,免疫增强剂能够通过提高水产动物的非特异性免疫功能来增强其抗应激、抗感染能力,提高其生产性能,具有作用广泛、特性稳定、安全高效等特点,适宜于作为饲料添加剂来替代抗生素对水产动物进行免疫,成为解决病害的重要途径之一。水产上应用的免疫增强剂主要包括化学合成物、细菌衍生物 (β 2葡聚糖、肽聚糖等 ),糖类 (壳聚糖、低聚糖、蘑菇多糖等 ),微量营养素 (维生素类、硒,n - 3 HUFA 等 ) 等 \[1 \]。本文就常用的免疫增强剂对鱼类免疫力和抗病力影响的研究现状进行综述,以期寻找鱼类健康养殖的途径。
1 糖类
1,1 甲壳素和壳聚糖甲壳素 (Chitin) 亦称几丁质,化学名称是 β 2
(1,4)222乙酰氨基 2D2葡萄糖。广泛存在于昆虫、
甲壳类动物如虾蟹等的外壳及真菌的细胞壁中。
甲壳素脱去乙酰基成为壳聚糖 (Chitosan),化学名称为 β 2(1,4)222脱氧 2D2葡萄糖。壳聚糖的非特异
X
XX 通讯作者基金项目,上海市自然科学基金资助项目 (00ZC14054)
作者简介,王桂芹 (19702),女,在读博士,讲师,研究方向,水产动物营养与饲料。
收稿日期,2004202220
性免疫机理在于其为阳性趋化剂,可吸附从血管中游出的单核细胞,聚集在组织中形成巨噬细胞,
亦可直接刺激局部组织,促进细胞增生,演变为巨噬细胞并被活化,使其吞噬能力增强,直接杀伤胞内生物和变异细胞,提高其免疫力 \[2 \]。
甲壳素或壳聚糖通常通过注射或浸泡途径使用。注射甲壳素能够增强黄条 鱼师 ( Seriola quin2
queradiata) \[3 \]巨噬细胞的吞噬活力,提高其对 Pas2
teurella piscicida 的抵抗力。对溪红点鲑 ( Salvelinus
fontinalis) \[2 \]注射或浸浴壳聚糖 1～ 3 d,可提高对
A1salmonicida 的抵抗力,但到 14 d 后,对该病原的抵抗力无明显增强。对鲮鱼 ( Labeo rahita) 的研究表明,腹腔注射壳聚糖 7 d 后,巨噬细胞吞噬活力和抗体的凝集效价显著增强 \[4 \]。金头鲷 ( Spa2
rus auratu L1) 口服甲壳素可以显著提高吞噬活性、细胞毒活性和血清补体活性等 \[5 \]。异育银鲫饲料中添加壳聚糖可提高血清和脾脏的溶菌酶活性以及血清超氧化物歧化酶活性 \[6 \]。免疫增强剂给予方式不同,结果也不一致 \[5,728 \]。如口服甲壳素可显著增强鱼体补体活力、吞噬活力,而呼吸爆发活力却没有受到显著影响,腹腔注射甲壳素能够显著增强其吞噬活力和呼吸爆发活力,对补体活力并没有显著影响,这可能是作用于细胞的免疫增强剂的有效剂量不同所致。
1,2 微生物多糖微生物多糖是一类带有多种复杂基因的生物聚合物,它能作为免疫增强剂激活鱼类的非特异性免疫系统。对鱼类免疫研究较多的有脂多糖
(LPS),肽聚糖 (PG),葡聚糖等。
11211 脂多糖 (Lipopolysaccharide,LPS) 脂多糖存在于所有革兰氏阴性菌外膜中,又称内毒素,
是最具潜力的免疫增强剂。脂多糖可促进 T辅助淋巴细胞抗原特异性分化,是 B 淋巴细胞有丝分裂原及巨噬细胞的激活剂。巨噬细胞受脂多糖刺激后释放出淋巴细胞活化因子,增强其免疫力。
研究表明,口服或注射脂多糖能够提高斑点叉尾鱼回 ( Ictalurus punctatus)的白细胞的吞噬活力 \[9 \],增强鲽鱼 ( Pleuronectes platessa L,) 巨噬细胞移动能力 \[10 \],促进大西洋鲑 ( Salmo salar L1)单核细胞中白细胞介素 Ⅰ的产生 \[11 \],提高鲤鱼对 Aeromoinas
bestiarum 的抵抗力 \[12 \]。体外实验也表明适量的脂多糖也可提高鱼类的免疫力。如提高大西洋鲑
( Samo salaar L,) 和真鲷巨噬细胞吞噬活力 \[13214 \]、
虹鳟 ( Oncorhynchus mykiss) 血清抗体水平 \[15 \]、鲇鱼单核细胞中白介素的水平 \[9 \]、斑点叉尾 鱼回 血清的干扰素水平等 \[9 \]。可见,LPS 效果显著,但使用剂量过高会产生免疫抑制。
11212 肽聚糖 ( Peptidoglucan,PG) 肽聚糖存在于革兰氏阴、阳性菌的细胞壁中,尤其是革兰氏阳性菌细胞壁中肽聚糖含量占细胞壁干重的 40 %～
90 %,是由 N2乙酰葡萄糖与 N2乙酰胞壁酸形成的二糖通过肽链相互交叉构成的聚合物,其中胞壁肽 (MDP)是细菌肽聚糖的保守亚基,能替代佛氏完全佐剂 (FCA)中的具有免疫增强活性的最小单位。虹鳟口服肽聚糖可增强其抵抗鳗弧菌的能力,腹腔注射能提高对 A1salmonicida 感染的抵抗力 \[16 \]。 Itami 等 \[17 \]研究发现,用含肽聚糖的饲料投喂黄尾 鱼师 可提高头肾的吞噬活力和吞噬指数,
提高对 Enterococcus seriolicida 感染的抵抗力。注射肽聚糖能够提高鲤鱼干扰素 - Ⅰ的水平,增加巨噬细胞的超氧阴离子含量 \[18 \]。可见,肽聚糖能够提高鱼类的非特异性免疫力和抗病力。
11213 葡聚糖 (β 2glucan) β 2葡聚糖通常存在于特殊种类的细菌、酵母菌、真菌的细胞壁中。 β 2葡聚糖以 1,32键为主体,且含有 1,62键的支链,β 2葡聚糖因其独特的螺旋形分子结构,易被免疫系统接受。 β 2葡聚糖对鱼类免疫功能提高的作用主要是增强其非特异性免疫功能,β 21,3 和 β 21,62葡聚糖能选择性地作用于巨噬细胞、颗粒细胞和自然杀伤细胞的特异性受体并激活这些细胞,通过细胞的吞噬作用,吸收、破坏、清除体内的病原微生物,同时还能产生细胞因子,如白细胞介素 Ⅰ
( IL - Ⅰ ),提高鱼类的免疫功能。研究表明,葡聚糖能增强大西洋鲑的补体活力和巨噬细胞的杀菌活力 \[19 \],提高大西洋鲑、大菱鲆的溶菌酶活力 \[19220 \]以及大菱鲆和金头鲷细胞的呼吸爆发活力 \[21222 \]。给虹鳟饲料中添加酵母 β 2葡聚糖和维生素 C,可显著提高补体活力和吞噬细胞的吞噬能力,并促进特异抗体的产生 \[23 \]。通过口服或注射葡聚糖也能增强斑点叉尾 鱼回 和鲤鱼对爱德华氏菌 \[24225 \]、南亚野鲮鱼对 A1 hydrophila\[26 \]、大西洋鲑对 Aeromonas salmonicida,V1 anguillarum,V1salm2
onicida 和 Y1 ruckeri 感染的抵抗力 \[27228 \]。可见,酵母葡聚糖具有很强的免疫原性,能够诱导鱼类的免疫系统发挥免疫力和抗病力。但也有葡聚糖对大菱鲆的免疫力和抗病力没有影响的报道 \[29 \]。
543第 27 卷 第 3 期 王桂芹等,鱼类免疫增强剂的研究现状产生差异的原因可能是因试验鱼的种类、给予剂量 或方式等不同的结果。
2 微量营养物营养与免疫功能密切相关,营养素缺乏时能直接引起机体免疫器官、免疫细胞的损伤、改变或分化,导致免疫缺陷,或通过影响其它组织的营养生长和代谢,间接引起免疫功能和抗病能力的下降。因此饲料的营养尤其是微量营养物是保持动物免疫功能以及充分发挥免疫力的决定因素之一。对维生素 C,E 和不饱和脂肪酸在鱼类上的应用研究较多。
2,1 维生素 C
维生素 C 是鱼类生长和发挥生理功能所必需的营养物质,大多数鱼类自身不能合成,必须从饲料中获取。很多研究都表明,投喂高于正常生长需要量的维生素 C 能增强鱼类的免疫力和抗病力,但也有对鱼类免疫力和抗病力的影响结论不一致的报道。维生素 C 能通过非特异性免疫机制使鱼体抗病能力提高,能清除鱼类免疫细胞吞噬和呼吸爆发产生的氧自由基,使其免受氧化损伤,提高其吞噬细胞的吞噬活性和杀菌能力。
维生素 C 能提高虹鳟 \[23,30 \]、大西洋鲑 \[31 \]、金头鲷 \[32 \]、大菱鲆 \[33 \]的巨噬细胞的吞噬能力。由于维生素 C 可作为还原性物质参与脯氨酸的羟化反应,因此能提高虹鳟 \[23 \]、大西洋鲑 \[31 \]、斑点叉尾鱼回 \[30,34 \]、金头鲷 \[32 \]等的血清补体活力。饲料中添加高水平的维生素 C 能够增强试验鱼的溶菌酶活力、呼吸爆发活力和抗体水平 \[23,30,32,35 \]。同样体外试验也表明维生素 C 能够增强巨噬细胞的呼吸爆发活力 \[31 \]。饲料中添加高剂量维生素 C
增强斑点叉尾 鱼回 对 Edwardsiella tarda\[36237 \]、大西洋鲑对 Aeromonaas salmonicida 的感染能力 \[31 \]。但
Lim等 \[37 \]对斑点叉尾 鱼回 饲料中添加维生素 C的试验却表明其对 E1 ictalari 的感染没有抵抗力。造成这种差异的原因可能是由试验鱼的种类、大小、
感染时间、剂量和方式的差异造成的。
维生素 C 对同种鱼的不同免疫指标的影响亦有差异。 Ortuno 等 \[32 \]在金头鲷饲料中添加不同剂量的维生素 C,血清中补体活力、吞噬活力和呼吸爆发活力分别在不同时期达到峰值,且均高于对照组。 Hardie 等 \[32 \]对大西洋鲑的研究表明,同一时间测得的免疫指标中,除了对血清补体活力有影响外,对其它免疫指标如抗体水平和吞噬能力没有影响。所以在试验中选择指标不同,应设置不同的时间段进行检测。
维生素 C 不仅可单独使用,也可与葡聚糖、
铁和脂肪酸等营养元素结合起来 \[23,35,37239 \]。 Verl2
hac 等用对照组饲料 (含维生素 C 150 mgPkg,不含葡聚糖 ) 喂虹鳟 4 周后,再用分别含有维生素 C
150 mgPkg 和 1 000 mgPkg、有或无葡聚糖的 4 组试验饲料投喂 2 周,结果发现,呼吸爆发活力、胞饮作用和溶菌酶受饲料中维生素 C 的影响更大,但抗体效价受葡聚糖的影响更大,二者的交互作用可促进鱼类免疫力的增强 \[23 \]。 Anderson 等 \[39 \]亦证明,大西洋鲑肝脏铁的沉积随饲料铁和维生素
C的增加而增加。 Lim 等 \[37 \]亦发现斑点叉尾 鱼回 饲料中铁含量较高时,维生素 C 能促进肝铁的沉积,表明维生素 C 可影响鱼体对铁的吸收和利用。
综上所述,维生素 C 的确能提高鱼类的免疫力,但因不同鱼类对病原的易感程度不同,适宜的添加量亦不同。同时维生素 C 和其它营养物的交互作用对鱼类的免疫力的影响有待进一步的研究。
2,2 维生素 E
维生素 E是水产动物重要的营养物质,其主要功能是消除体内多余自由基,保护脂溶性细胞膜和不饱和脂肪酸不被氧化,通过促进和调理免疫细胞的功能来改善动物体的免疫力。有关饲料中维生素 E对鱼类免疫系统的影响报道较多,但研究结果有一定的差异。
在饲料中适量添加维生素 E,可增强斑点叉尾 鱼回 \[40 \]、大菱鲆 \[41 \]吞噬细胞的吞噬活力。维生素
E可通过改变巨噬细胞膜的功能而调节真鲷 \[42 \]、
大西洋鲑 \[43 \]等鱼类的血清补体活力,因为巨噬细胞是一些补体蛋白产生的位点,其细胞膜脂肪氧化可能会影响补体蛋白的合成 \[42 \]。维生素 E 能够避免呼吸爆发产生的自由离子、过氧化物和超氧阴离子等对巨噬细胞的氧化破坏 \[43 \]。也有报道斑点叉尾 鱼回 饲料中缺乏维生素 E 时,会降低其脾脏巨噬细胞的超氧阴离子的含量 \[40 \],而饲料中添加维生素 E 显著提高了金头鲷巨噬细胞的呼吸爆发活力 \[44 \]。饲料中添加适量的维生素 E 可提高大西洋鲑对 A1salmonicida\[45 \]、斑点叉尾鱼回 \[40 \]、大菱鲆 \[41 \]对 Edwardsiella ictaluri,虹鳟 \[46 \]对
643 吉 林 农 业 大 学 学 报 2005 年
Yersinia ruckeri 的抵抗力,从而提高其非特异性免疫 力。
维生素 E 对鱼类免疫力的影响亦与试验时间和添加剂量有关。 Ortuno 等 \[47 \]在金头鲷的饲料中添加维生素 E,补体的吞噬活力在第 30～ 45 d
达到最大,在 15 d 时对免疫力没有影响。而
Cuesta 等 \[48 \]研究则表明,斑点叉尾 鱼回 饲料中添加维生素 E时,其自然杀伤细胞的杀菌能力在第 2～
4 周达到最大,而到第 6 周时,又恢复到对照组的水平。同样对金头鲷 \[47 \]、斑点叉尾 鱼回 \[48 \]的研究也表明,在一定的范围内,鱼类的免疫力随饲料中维生素 E的增加而提高,但过量添加会导致免疫抑制。
213 n - 3 PHUFA
n - 3 HUFA 是鱼类必需脂肪酸,饲料中含有足够的 n - 3 HUFA 可维持大西洋鲑的补体活性,
因添加 n - 3 HUFA 可通过影响花生四烯酸代谢而改变细胞膜磷脂结构,消除感染等产生的应激反应 \[49 \]。富含 n - 3 HUFA 的饲料可显著增强斑点叉尾 鱼回 巨噬细胞杀菌活力 \[50 \],这可能是由于
n - 3 HUFA 的缺乏导致磷脂层内脂肪酸组成不合理,从而影响细胞膜的通透性和流动性及相关的受体活力造成的 \[51 \]。大西洋鲑饲喂高含量 n - 3
HUFA 的饲料时,能提高其对 Vibrio salmonicida 和
Aeromonas salmonicida 感染的抵抗力 \[52 \]。同样缺乏
n - 3 PUFA 饲料的金头鲷、虹鳟易感染细菌,降低对病毒侵袭的抵抗力 \[51,53 \]。但也有在斑点叉尾鱼回 \[54 \]饲料中添加富含 n - 3 HUFA 的鲱鱼油,鱼类却易感爱德华氏菌,金头鲷 \[51 \]溶菌酶活力不受饲料中 n - 3 HUFA 的升高影响的相反报道。所以有关 n - 3 HUFA 对鱼类免疫力和抗病力的影响机理还有待于进一步研究和探讨。
3 免疫增强剂在未来水产养殖中的研究方向
1) 免疫增强剂的给予时间。预防是免疫增强剂的主要作用,在动物产生应激、生产性能受损或受病原菌侵害之前应用较好。水产动物免疫系统随个体发育而不断完善,不同阶段的使用效果有待验证。
2) 免疫增强剂的给予途径、剂量、周期。上述免疫增强剂的效果多通过注射表现出来,但最经济实用的方法是将其作为饲料添加剂使用,用最低浓度的免疫增强剂,在最短的时间内取得最佳的免疫效果是最好的。因此探索新的给予途径,选择适宜的剂量和周期是亟待解决的问题。
3) 免疫增强剂的应用范围。水产动物种属、
个体间存在着很大差异,免疫系统的差异直接影响免疫增强剂的作用机制和使用效果,今后应扩大免疫增强剂在水产动物的不同品种上的使用研究,不仅研究免疫增强剂对细菌性病原的免疫增强作用,还要探究对病毒和寄生虫引起的疾病是否也能发挥其免疫增强作用。
4) 免疫增强剂的可得性。有些免疫增强剂
(如脂多糖、葡聚糖等 )虽然使用效果显著,但存在着来源、提取或合成等问题,所以应选用易得且有效的免疫增强剂,其中酵母细胞壁、壳聚糖是首选。酵母细胞壁是一种全新的天然绿色添加剂,
是生产啤酒酵母过程中由可溶性物质提取的一种特殊副产品,方便易得,其活性成分为葡聚糖
5017 %、甘露寡糖 616 %、糖蛋白 2210 %。自然界中每年生物合成的甲壳素有数十亿吨,利用废弃物虾、蟹壳等生产具有免疫活性的壳聚糖作为饲料免疫增强剂有广阔的前景。
5) 目前对免疫增强剂作用机理的研究较少,
多停留在作用效果上。今后应着重研究不同免疫增强剂的组合效应如维生素 C 和葡聚糖、维生素
E和 n - 3HUFA 等,以及免疫增强剂是如何通过内分泌调控物质代谢和免疫功能来促进生长,提高抗病能力,以实现免疫增强剂在水产养殖中的合理应用。
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943第 27 卷 第 3 期 王桂芹等,鱼类免疫增强剂的研究现状
Journal of Jilin Agricultural University
鱼类免疫增强剂的研究现状 X
王桂芹 1,2,周洪琪 1XX
(11 上海水产大学生命科学与技术学院,上海 200090 ; 21 吉林农业大学动物科技学院,长春 130118)
摘 要,综述了对鱼类免疫效果较好的多糖、微量营养物等免疫增强剂及其作用机理,同时对其使用中存在的问题及发展趋势做一评述。
关键词,水产养殖 ; 免疫增强剂 ; 非特异性免疫 ; 多糖 ; 维生素中图分类号,S963 文献标识码,A 文章编号,100025684 (2005) 0320344206
Current Re search Status of Fish Immuno stimulants
WANG Gui2qin1,2,ZHOU Hong2qin1
(1,College of Aqua2Life Science and Technology,Shanghai Fisheries University,Shanghai 200090,
China ; 2,College of Animal Science and Technology,Jilin Agricultural University,Changchun 130118,
China)
Abstract,Immunostimulants are valuable for the prevention and control of fish diseases in aquacul2
ture1Several immunostimulants such as polysaccharide and micronutritional factors and their effective
mechanism are reviewed,meantime,existing problems in immunostimulant application and future re2
search tendency are described1
Key words,aquaculture ; immunostimulant ; non2specific immunity ; polysaccharide ; vitamin
随着集约化养殖的发展,鱼类病害成了制约其健康养殖的关键因素之一。目前水产养殖中对水产动物疾病的防治常使用抗生素。由于抗生素等化学药物的长期使用和滥用,鱼类对抗生素的耐药致病菌株不断增多,使其免疫功能下降,药物在水产品中的残留也严重影响食物的安全和人类的健康。免疫增强剂是指单独或同时与抗原使用均能增强动物免疫反应的物质,这些物质可增强鱼类抵抗外界病原体 (细菌、真菌、病毒和寄生虫等 )侵袭的能力,同时也可减轻外界环境胁迫对鱼类的免疫抑制作用。水产动物的生长发育受多种因素的影响,免疫增强剂能够通过提高水产动物的非特异性免疫功能来增强其抗应激、抗感染能力,提高其生产性能,具有作用广泛、特性稳定、安全高效等特点,适宜于作为饲料添加剂来替代抗生素对水产动物进行免疫,成为解决病害的重要途径之一。水产上应用的免疫增强剂主要包括化学合成物、细菌衍生物 (β 2葡聚糖、肽聚糖等 ),糖类 (壳聚糖、低聚糖、蘑菇多糖等 ),微量营养素 (维生素类、硒,n - 3 HUFA 等 ) 等 \[1 \]。本文就常用的免疫增强剂对鱼类免疫力和抗病力影响的研究现状进行综述,以期寻找鱼类健康养殖的途径。
1 糖类
1,1 甲壳素和壳聚糖甲壳素 (Chitin) 亦称几丁质,化学名称是 β 2
(1,4)222乙酰氨基 2D2葡萄糖。广泛存在于昆虫、
甲壳类动物如虾蟹等的外壳及真菌的细胞壁中。
甲壳素脱去乙酰基成为壳聚糖 (Chitosan),化学名称为 β 2(1,4)222脱氧 2D2葡萄糖。壳聚糖的非特异
X
XX 通讯作者基金项目,上海市自然科学基金资助项目 (00ZC14054)
作者简介,王桂芹 (19702),女,在读博士,讲师,研究方向,水产动物营养与饲料。
收稿日期,2004202220
性免疫机理在于其为阳性趋化剂,可吸附从血管中游出的单核细胞,聚集在组织中形成巨噬细胞,
亦可直接刺激局部组织,促进细胞增生,演变为巨噬细胞并被活化,使其吞噬能力增强,直接杀伤胞内生物和变异细胞,提高其免疫力 \[2 \]。
甲壳素或壳聚糖通常通过注射或浸泡途径使用。注射甲壳素能够增强黄条 鱼师 ( Seriola quin2
queradiata) \[3 \]巨噬细胞的吞噬活力,提高其对 Pas2
teurella piscicida 的抵抗力。对溪红点鲑 ( Salvelinus
fontinalis) \[2 \]注射或浸浴壳聚糖 1～ 3 d,可提高对
A1salmonicida 的抵抗力,但到 14 d 后,对该病原的抵抗力无明显增强。对鲮鱼 ( Labeo rahita) 的研究表明,腹腔注射壳聚糖 7 d 后,巨噬细胞吞噬活力和抗体的凝集效价显著增强 \[4 \]。金头鲷 ( Spa2
rus auratu L1) 口服甲壳素可以显著提高吞噬活性、细胞毒活性和血清补体活性等 \[5 \]。异育银鲫饲料中添加壳聚糖可提高血清和脾脏的溶菌酶活性以及血清超氧化物歧化酶活性 \[6 \]。免疫增强剂给予方式不同,结果也不一致 \[5,728 \]。如口服甲壳素可显著增强鱼体补体活力、吞噬活力,而呼吸爆发活力却没有受到显著影响,腹腔注射甲壳素能够显著增强其吞噬活力和呼吸爆发活力,对补体活力并没有显著影响,这可能是作用于细胞的免疫增强剂的有效剂量不同所致。
1,2 微生物多糖微生物多糖是一类带有多种复杂基因的生物聚合物,它能作为免疫增强剂激活鱼类的非特异性免疫系统。对鱼类免疫研究较多的有脂多糖
(LPS),肽聚糖 (PG),葡聚糖等。
11211 脂多糖 (Lipopolysaccharide,LPS) 脂多糖存在于所有革兰氏阴性菌外膜中,又称内毒素,
是最具潜力的免疫增强剂。脂多糖可促进 T辅助淋巴细胞抗原特异性分化,是 B 淋巴细胞有丝分裂原及巨噬细胞的激活剂。巨噬细胞受脂多糖刺激后释放出淋巴细胞活化因子,增强其免疫力。
研究表明,口服或注射脂多糖能够提高斑点叉尾鱼回 ( Ictalurus punctatus)的白细胞的吞噬活力 \[9 \],增强鲽鱼 ( Pleuronectes platessa L,) 巨噬细胞移动能力 \[10 \],促进大西洋鲑 ( Salmo salar L1)单核细胞中白细胞介素 Ⅰ的产生 \[11 \],提高鲤鱼对 Aeromoinas
bestiarum 的抵抗力 \[12 \]。体外实验也表明适量的脂多糖也可提高鱼类的免疫力。如提高大西洋鲑
( Samo salaar L,) 和真鲷巨噬细胞吞噬活力 \[13214 \]、
虹鳟 ( Oncorhynchus mykiss) 血清抗体水平 \[15 \]、鲇鱼单核细胞中白介素的水平 \[9 \]、斑点叉尾 鱼回 血清的干扰素水平等 \[9 \]。可见,LPS 效果显著,但使用剂量过高会产生免疫抑制。
11212 肽聚糖 ( Peptidoglucan,PG) 肽聚糖存在于革兰氏阴、阳性菌的细胞壁中,尤其是革兰氏阳性菌细胞壁中肽聚糖含量占细胞壁干重的 40 %～
90 %,是由 N2乙酰葡萄糖与 N2乙酰胞壁酸形成的二糖通过肽链相互交叉构成的聚合物,其中胞壁肽 (MDP)是细菌肽聚糖的保守亚基,能替代佛氏完全佐剂 (FCA)中的具有免疫增强活性的最小单位。虹鳟口服肽聚糖可增强其抵抗鳗弧菌的能力,腹腔注射能提高对 A1salmonicida 感染的抵抗力 \[16 \]。 Itami 等 \[17 \]研究发现,用含肽聚糖的饲料投喂黄尾 鱼师 可提高头肾的吞噬活力和吞噬指数,
提高对 Enterococcus seriolicida 感染的抵抗力。注射肽聚糖能够提高鲤鱼干扰素 - Ⅰ的水平,增加巨噬细胞的超氧阴离子含量 \[18 \]。可见,肽聚糖能够提高鱼类的非特异性免疫力和抗病力。
11213 葡聚糖 (β 2glucan) β 2葡聚糖通常存在于特殊种类的细菌、酵母菌、真菌的细胞壁中。 β 2葡聚糖以 1,32键为主体,且含有 1,62键的支链,β 2葡聚糖因其独特的螺旋形分子结构,易被免疫系统接受。 β 2葡聚糖对鱼类免疫功能提高的作用主要是增强其非特异性免疫功能,β 21,3 和 β 21,62葡聚糖能选择性地作用于巨噬细胞、颗粒细胞和自然杀伤细胞的特异性受体并激活这些细胞,通过细胞的吞噬作用,吸收、破坏、清除体内的病原微生物,同时还能产生细胞因子,如白细胞介素 Ⅰ
( IL - Ⅰ ),提高鱼类的免疫功能。研究表明,葡聚糖能增强大西洋鲑的补体活力和巨噬细胞的杀菌活力 \[19 \],提高大西洋鲑、大菱鲆的溶菌酶活力 \[19220 \]以及大菱鲆和金头鲷细胞的呼吸爆发活力 \[21222 \]。给虹鳟饲料中添加酵母 β 2葡聚糖和维生素 C,可显著提高补体活力和吞噬细胞的吞噬能力,并促进特异抗体的产生 \[23 \]。通过口服或注射葡聚糖也能增强斑点叉尾 鱼回 和鲤鱼对爱德华氏菌 \[24225 \]、南亚野鲮鱼对 A1 hydrophila\[26 \]、大西洋鲑对 Aeromonas salmonicida,V1 anguillarum,V1salm2
onicida 和 Y1 ruckeri 感染的抵抗力 \[27228 \]。可见,酵母葡聚糖具有很强的免疫原性,能够诱导鱼类的免疫系统发挥免疫力和抗病力。但也有葡聚糖对大菱鲆的免疫力和抗病力没有影响的报道 \[29 \]。
543第 27 卷 第 3 期 王桂芹等,鱼类免疫增强剂的研究现状产生差异的原因可能是因试验鱼的种类、给予剂量 或方式等不同的结果。
2 微量营养物营养与免疫功能密切相关,营养素缺乏时能直接引起机体免疫器官、免疫细胞的损伤、改变或分化,导致免疫缺陷,或通过影响其它组织的营养生长和代谢,间接引起免疫功能和抗病能力的下降。因此饲料的营养尤其是微量营养物是保持动物免疫功能以及充分发挥免疫力的决定因素之一。对维生素 C,E 和不饱和脂肪酸在鱼类上的应用研究较多。
2,1 维生素 C
维生素 C 是鱼类生长和发挥生理功能所必需的营养物质,大多数鱼类自身不能合成,必须从饲料中获取。很多研究都表明,投喂高于正常生长需要量的维生素 C 能增强鱼类的免疫力和抗病力,但也有对鱼类免疫力和抗病力的影响结论不一致的报道。维生素 C 能通过非特异性免疫机制使鱼体抗病能力提高,能清除鱼类免疫细胞吞噬和呼吸爆发产生的氧自由基,使其免受氧化损伤,提高其吞噬细胞的吞噬活性和杀菌能力。
维生素 C 能提高虹鳟 \[23,30 \]、大西洋鲑 \[31 \]、金头鲷 \[32 \]、大菱鲆 \[33 \]的巨噬细胞的吞噬能力。由于维生素 C 可作为还原性物质参与脯氨酸的羟化反应,因此能提高虹鳟 \[23 \]、大西洋鲑 \[31 \]、斑点叉尾鱼回 \[30,34 \]、金头鲷 \[32 \]等的血清补体活力。饲料中添加高水平的维生素 C 能够增强试验鱼的溶菌酶活力、呼吸爆发活力和抗体水平 \[23,30,32,35 \]。同样体外试验也表明维生素 C 能够增强巨噬细胞的呼吸爆发活力 \[31 \]。饲料中添加高剂量维生素 C
增强斑点叉尾 鱼回 对 Edwardsiella tarda\[36237 \]、大西洋鲑对 Aeromonaas salmonicida 的感染能力 \[31 \]。但
Lim等 \[37 \]对斑点叉尾 鱼回 饲料中添加维生素 C的试验却表明其对 E1 ictalari 的感染没有抵抗力。造成这种差异的原因可能是由试验鱼的种类、大小、
感染时间、剂量和方式的差异造成的。
维生素 C 对同种鱼的不同免疫指标的影响亦有差异。 Ortuno 等 \[32 \]在金头鲷饲料中添加不同剂量的维生素 C,血清中补体活力、吞噬活力和呼吸爆发活力分别在不同时期达到峰值,且均高于对照组。 Hardie 等 \[32 \]对大西洋鲑的研究表明,同一时间测得的免疫指标中,除了对血清补体活力有影响外,对其它免疫指标如抗体水平和吞噬能力没有影响。所以在试验中选择指标不同,应设置不同的时间段进行检测。
维生素 C 不仅可单独使用,也可与葡聚糖、
铁和脂肪酸等营养元素结合起来 \[23,35,37239 \]。 Verl2
hac 等用对照组饲料 (含维生素 C 150 mgPkg,不含葡聚糖 ) 喂虹鳟 4 周后,再用分别含有维生素 C
150 mgPkg 和 1 000 mgPkg、有或无葡聚糖的 4 组试验饲料投喂 2 周,结果发现,呼吸爆发活力、胞饮作用和溶菌酶受饲料中维生素 C 的影响更大,但抗体效价受葡聚糖的影响更大,二者的交互作用可促进鱼类免疫力的增强 \[23 \]。 Anderson 等 \[39 \]亦证明,大西洋鲑肝脏铁的沉积随饲料铁和维生素
C的增加而增加。 Lim 等 \[37 \]亦发现斑点叉尾 鱼回 饲料中铁含量较高时,维生素 C 能促进肝铁的沉积,表明维生素 C 可影响鱼体对铁的吸收和利用。
综上所述,维生素 C 的确能提高鱼类的免疫力,但因不同鱼类对病原的易感程度不同,适宜的添加量亦不同。同时维生素 C 和其它营养物的交互作用对鱼类的免疫力的影响有待进一步的研究。
2,2 维生素 E
维生素 E是水产动物重要的营养物质,其主要功能是消除体内多余自由基,保护脂溶性细胞膜和不饱和脂肪酸不被氧化,通过促进和调理免疫细胞的功能来改善动物体的免疫力。有关饲料中维生素 E对鱼类免疫系统的影响报道较多,但研究结果有一定的差异。
在饲料中适量添加维生素 E,可增强斑点叉尾 鱼回 \[40 \]、大菱鲆 \[41 \]吞噬细胞的吞噬活力。维生素
E可通过改变巨噬细胞膜的功能而调节真鲷 \[42 \]、
大西洋鲑 \[43 \]等鱼类的血清补体活力,因为巨噬细胞是一些补体蛋白产生的位点,其细胞膜脂肪氧化可能会影响补体蛋白的合成 \[42 \]。维生素 E 能够避免呼吸爆发产生的自由离子、过氧化物和超氧阴离子等对巨噬细胞的氧化破坏 \[43 \]。也有报道斑点叉尾 鱼回 饲料中缺乏维生素 E 时,会降低其脾脏巨噬细胞的超氧阴离子的含量 \[40 \],而饲料中添加维生素 E 显著提高了金头鲷巨噬细胞的呼吸爆发活力 \[44 \]。饲料中添加适量的维生素 E 可提高大西洋鲑对 A1salmonicida\[45 \]、斑点叉尾鱼回 \[40 \]、大菱鲆 \[41 \]对 Edwardsiella ictaluri,虹鳟 \[46 \]对
643 吉 林 农 业 大 学 学 报 2005 年
Yersinia ruckeri 的抵抗力,从而提高其非特异性免疫 力。
维生素 E 对鱼类免疫力的影响亦与试验时间和添加剂量有关。 Ortuno 等 \[47 \]在金头鲷的饲料中添加维生素 E,补体的吞噬活力在第 30～ 45 d
达到最大,在 15 d 时对免疫力没有影响。而
Cuesta 等 \[48 \]研究则表明,斑点叉尾 鱼回 饲料中添加维生素 E时,其自然杀伤细胞的杀菌能力在第 2～
4 周达到最大,而到第 6 周时,又恢复到对照组的水平。同样对金头鲷 \[47 \]、斑点叉尾 鱼回 \[48 \]的研究也表明,在一定的范围内,鱼类的免疫力随饲料中维生素 E的增加而提高,但过量添加会导致免疫抑制。
213 n - 3 PHUFA
n - 3 HUFA 是鱼类必需脂肪酸,饲料中含有足够的 n - 3 HUFA 可维持大西洋鲑的补体活性,
因添加 n - 3 HUFA 可通过影响花生四烯酸代谢而改变细胞膜磷脂结构,消除感染等产生的应激反应 \[49 \]。富含 n - 3 HUFA 的饲料可显著增强斑点叉尾 鱼回 巨噬细胞杀菌活力 \[50 \],这可能是由于
n - 3 HUFA 的缺乏导致磷脂层内脂肪酸组成不合理,从而影响细胞膜的通透性和流动性及相关的受体活力造成的 \[51 \]。大西洋鲑饲喂高含量 n - 3
HUFA 的饲料时,能提高其对 Vibrio salmonicida 和
Aeromonas salmonicida 感染的抵抗力 \[52 \]。同样缺乏
n - 3 PUFA 饲料的金头鲷、虹鳟易感染细菌,降低对病毒侵袭的抵抗力 \[51,53 \]。但也有在斑点叉尾鱼回 \[54 \]饲料中添加富含 n - 3 HUFA 的鲱鱼油,鱼类却易感爱德华氏菌,金头鲷 \[51 \]溶菌酶活力不受饲料中 n - 3 HUFA 的升高影响的相反报道。所以有关 n - 3 HUFA 对鱼类免疫力和抗病力的影响机理还有待于进一步研究和探讨。
3 免疫增强剂在未来水产养殖中的研究方向
1) 免疫增强剂的给予时间。预防是免疫增强剂的主要作用,在动物产生应激、生产性能受损或受病原菌侵害之前应用较好。水产动物免疫系统随个体发育而不断完善,不同阶段的使用效果有待验证。
2) 免疫增强剂的给予途径、剂量、周期。上述免疫增强剂的效果多通过注射表现出来,但最经济实用的方法是将其作为饲料添加剂使用,用最低浓度的免疫增强剂,在最短的时间内取得最佳的免疫效果是最好的。因此探索新的给予途径,选择适宜的剂量和周期是亟待解决的问题。
3) 免疫增强剂的应用范围。水产动物种属、
个体间存在着很大差异,免疫系统的差异直接影响免疫增强剂的作用机制和使用效果,今后应扩大免疫增强剂在水产动物的不同品种上的使用研究,不仅研究免疫增强剂对细菌性病原的免疫增强作用,还要探究对病毒和寄生虫引起的疾病是否也能发挥其免疫增强作用。
4) 免疫增强剂的可得性。有些免疫增强剂
(如脂多糖、葡聚糖等 )虽然使用效果显著,但存在着来源、提取或合成等问题,所以应选用易得且有效的免疫增强剂,其中酵母细胞壁、壳聚糖是首选。酵母细胞壁是一种全新的天然绿色添加剂,
是生产啤酒酵母过程中由可溶性物质提取的一种特殊副产品,方便易得,其活性成分为葡聚糖
5017 %、甘露寡糖 616 %、糖蛋白 2210 %。自然界中每年生物合成的甲壳素有数十亿吨,利用废弃物虾、蟹壳等生产具有免疫活性的壳聚糖作为饲料免疫增强剂有广阔的前景。
5) 目前对免疫增强剂作用机理的研究较少,
多停留在作用效果上。今后应着重研究不同免疫增强剂的组合效应如维生素 C 和葡聚糖、维生素
E和 n - 3HUFA 等,以及免疫增强剂是如何通过内分泌调控物质代谢和免疫功能来促进生长,提高抗病能力,以实现免疫增强剂在水产养殖中的合理应用。
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