浙 江 农 业 学 报 Acta Agriculturae Zhejiangensis 16 (1),25～ 29,2004
免 疫 增 强 剂 对 中 华 绒 螯 蟹 免 疫 功 能 的 影 响沈 锦 玉,刘 问,曹 铮,尹 文 林,沈 智 华,钱 冬,吴 颖 蕾
(浙 江 省 淡 水 水 产 研 究 所,浙 江 湖 州 313001)
摘 要,用 3 种 不 同 免 疫 增 强 剂 多 糖 (laminarin),灭 活 细 菌 苗,壳 聚 多 糖 (chitosan) 注 射 (分 别 为 A,B,C 组,对照 为 D 组 )和 添 加 饵 料 饲 喂 中 华 绒 螯 蟹 (多 糖 为 E组,灭 活 细 菌 苗 为 F 组,壳 聚 多 糖 为 G组,对 照 为 H 组 ),
在 不 同 时 间 取 样 测 定 中 华 绒 螯 蟹 血 清 中 非 特 异 性 免 疫 指 标 的 变 化 及 中 华 绒 螯 蟹 的 免 疫 保 护 率 。 结 果 表 明,
注 射 后 48 h,A,B,C组 中 华 绒 螯 蟹 血 清 中 溶 菌 酶 活 力 分 别 为 0,185,0,234,0,233,对 照 组 为 0,094,经 t 检 验,
差 异 不 显 著 ;超 氧 化 物 歧 化 酶 (SOD)的 活 力 分 别 为 283,2,263,5,289,8,对 照 组 为 120,15,经 t 检 验,A,B 组 血清 中 SOD 活 力 差 异 极 显 著,C 组 差 异 显 著 。 口 服 免 疫 增 强 剂 后 第 9 天,血 清 中 溶 菌 酶,超 氧 化 物 歧 化 酶
(SOD)的 活 力 明 显 高 于 对 照 组,经 t 检 验,各 组 血 清 中 溶 菌 酶 活 力 与 对 照 相 比,差 异 极 显 著 ;SOD 的 活 力 与 对照 相 比,E组 差 异 极 显 著,F,G组 差 异 显 著 。 注 射 免 疫 增 强 剂 组 蟹 的 免 疫 保 护 率 达 75 %,而 口 服 免 疫 增 强 剂组 与 对 照 组 相 比 较,蟹 的 免 疫 保 护 率 没 有 明 显 的 差 异 。 壳 聚 糖 经 生 产 性 试 用,能 较 好 地 预 防 病 害 的 发 生,中华 绒 螯 蟹 成 活 率 比 对 照 组 提 高 10 %以 上 。
关 键 词,中 华 绒 螯 蟹 ;免 疫 增 强 剂 ;非 特 异 性 免 疫 ;溶 菌 酶 ;SOD
中 图 分 类 号,S966,16 文 献 标 识 码,A 文 章 编 号,1004 - 1524(2004) 01 - 0025 - 05
Effect of immunity2stimulants on immunity function of Eriocheir sinensis
SHEN Jin2yu,LIU Wen,CAO Zhen,YIN Wen2lin,SHEN Zhi2hua,QIAN Dong,WU Ying2lei
( Zhejiang Institute of Feshwater Fisheries,Huzhou 313001,China)
Abstract,The indices of non2specific immunity of freshwater crab,Eriocheir sinensis,injected or fed with laminarin(A),
Aeromonas hydrophila bacterin (B) and chitosan (C) were measured,After the 48 h of post2injecting,lysozyme activi2
ties of three experimental groups (A,B,and C) were 0,185,0,234 and 0,233,respectively,while the control group
(D) was 0,094,There were no significant differences between experimental and the control group by using t test,SOD
activities of three experimental groups were 283,2,263,5 and 289,8,respectively,while the control group was 120,15.
There were highly significant differences between A and D,and B and D,but there was no significant difference between
C and D,These results indicated that the three immunity2stimulants might significantly elevate the non2specific immunity
of crab,After the 9 days of post2feeding with medicated diet,the lysozyme activities of experimental group were higher
than those of the control group,There was highly significant difference between experimental group and the control group
by using t2test,The SOD activities of experimental group were also higher than those of the control group,There was high2
ly significant difference between E group and the control group (D),whereas there were significant differences between F
and the control group,and G group and the control group,The crab fed by immunity2stimulants could significantly in2
crease the non2specific immunity of crab,The chitosan used in the fields could efficiently prevent the occurrence of crab
disease and increased the survival rate of crab by > 10 % compared with the control group.
Key words,Eriocheir sinensis ; immunity2stimulants ; non2specific immunity ; lysozyme ; SOD
收 稿 日 期,2003 - 07 - 28
基 金 项 目,浙 江 省 科 技 厅 重 点 项 目 (991102312)
作 者 简 介,沈 锦 玉 (1963 - ),女,浙 江 湖 州 人,副 研 究 员,从 事 水 生 动 物 病 害 防 治 研 究 。
1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House,All rights reserved,http://www.cnki.net
近 几 年,中 华 绒 螯 蟹 ( Eriocheir sinensis ) 已成 为 我 国 名 特 优 水 产 养 殖 的 主 要 品 种 之 一,但是 细 菌 性 与 病 毒 性 等 疾 病 不 断 发 生 \[1～ 3 \],严 重影 响 生 产 。 蟹 病 防 治 已 成 为 当 务 之 急,除 常 规药 物 防 治 外,针 对 甲 壳 类 不 具 备 特 异 性 免 疫 系统 的 生 理 特 点,可 以 采 用 免 疫 增 强 剂 来 启 动 和调 节 中 华 绒 螯 蟹 非 特 异 性 免 疫,提 高 其 自 身 免疫 能 力 。 目 前 国 内 外 鱼 用 免 疫 增 强 剂 的 研 究 比较 活 跃 \[4～ 5 \],对 甲 壳 动 物 的 免 疫 增 强 剂 也 有 不少 研 究 \[6～ 8 \]。 中 国 对 虾,南 美 白 对 虾 等 甲 壳 类注 射 或 服 用 含 多 糖 等 成 分 的 免 疫 增 强 剂 后,可刺 激 其 免 疫 系 统,提 高 防 御 能 力,达 到 防 病 治病,提 高 成 活 率 的 目 的 。 但 免 疫 增 强 剂 对 中 华绒 螯 蟹 的 非 特 异 性 免 疫 的 研 究 尚 未 见 报 道 。 本试 验 采 用 3 种 免 疫 增 强 剂 通 过 注 射 或 作 为 饲 料添 加 剂 饲 喂 中 华 绒 螯 蟹,测 定 其 对 中 华 绒 螯 蟹血 清 中 溶 菌 酶,超 氧 化 物 歧 化 酶 (SOD) 及 免 疫 保护 率 的 影 响,从 而 筛 选 合 适 的 免 疫 增 强 剂,为 甲壳 类 的 病 害 防 治 提 供 科 学 依 据 。
1 材 料 与 方 法
1,1 材 料健 康 中 华 绒 螯 蟹 购 自 浙 江 湖 州 某 养 蟹 场,
体 重 50～ 70 g,饲 养 于 1 m3 的 水 泥 池 中,水 温 26
～ 28 ℃,每 池 饲 养 15 只 。 每 组 3 只 池,池 内 放 适量 喜 旱 莲 子 草,瓦 片 等,每 天 投 喂 2 次 约 占 体 重
5 %的 蟹 配 合 饲 料 。 暂 养 1 周 后 供 试 验 用 。
1,2 试 验 处 理
1,2,1 注 射 免 疫 增 强 剂
4 个 处 理 组,A 组 为 多 糖 ( laminarin,购 自
Sigma 公 司 ),配 成 1 %的 生 理 盐 水 溶 液,每 100 g
体 重 的 蟹 注 射 0,2 ml ;B 组 为 中 华 绒 螯 蟹 的 细 菌灭 活 苗 (CL99920),细 菌 在 大 豆 胰 蛋 白 胨 培 养 液
(TSB)中,经 200 r/ min,28 ℃ 的 摇 床 培 养 24 h,加
0,2 %福 尔 马 林 灭 活 24 h,离 心 5 000 r/ min,20
min,用 无 菌 生 理 盐 水 洗 涤 2 次,以 109 cfu/ ml 浓度,每 100 g 体 重 蟹 注 射 0,2 ml ;C组 为 壳 聚 多 糖
(chitosan),1 % Chitosan 溶 解 于 0,5 %醋 酸 无 菌生 理 盐 水,pH 调 至 6,8,0,2 ml/ 100g 蟹 体 重 ;D
组 为 对 照 组,注 射 生 理 盐 水 0,2 ml/ 100g 蟹 体重 。 各 组 中 华 绒 螯 蟹 分 别 在 注 射 后 3,6,24,48,
72,96 h 取 样 3 只,附 肢 取 血,待 血 液 凝 固 后,取血 清,待 测 。
1,2,2 口 服 免 疫 增 强 剂
4 个 处 理 组,E 组 为 多 糖,药 物 终 浓 度 为 1
g/ kg 体 重,以 体 重 5 %的 投 饵 率,每 50 kg 饵 料中 的 添 加 量 为 25 g ; F 组 为 菌 苗 (同 B 组 ),添 加量 为 1 %。 G组 为 壳 聚 多 糖,以 1 %的 溶 液 拌 于饲 料 中,终 浓 度 为 0,2 % ; H 组 为 基 础 饵 料 (对 照组 ) 。 基 础 饵 料 购 自 浙 江 湖 州 饲 料 厂 。 制 备 各组 饵 料 时,将 添 加 物 直 接 加 入 基 础 饵 料 中,用 绞肉 机 挤 压 成 型,日 光 下 晒 干 或 烘 干 。 各 组 中 华绒 螯 蟹 连 续 口 服 1 月,分 别 在 口 服 后 第 3 天 开始 取 样,每 组 取 样 3 只,每 3 天 测 1 次,共 测 7
次,血 清 制 备 同 1,2,1 节 。
1,3 测 定 方 法
1,3,1 溶 菌 酶 活 力以 溶 壁 微 球 菌 ( Micrococcus lysoleiticus ) (购自 中 科 院 微 生 物 所 菌 种 室 ) 冻 干 粉 为 底 物,按
Hultmark 等 人 \[9 \]的 方 法 进 行 。 将 底 物 用 0,1
mol/ L,pH为 6,4 的 磷 酸 钾 盐 缓 冲 液 配 成 底 物 悬液 (OD570≈ 0,3) 。 取 3 m1 该 悬 液 50μ l,待 测 血清 于 试 管 中 混 匀,测 其 Ao 值 。 然 后 将 试 液 移 入
37 ℃ 水 浴 中 保 温 30 min,取 出 后 立 刻 置 于 冰 浴 中
10 min 以 终 止 反 应,测 其 A 值 。 溶 菌 活 力 U 按 下式 计 算,U = (Ao - A) / A。 式 中,U 为 溶 菌 活 力 ;
Ao 为 反 应 前 光 密 度 值 ;A 为 反 应 后 光 密 度 值 。
1,3,2 超 氧 化 物 歧 化 酶 (SOD)活 力参 照 邓 碧 玉 等 \[10\]的 方 法 进 行 。 测 定 时,将
50 mmol/ L pH为 8,3 的 磷 酸 缓 冲 液 4,5 ml 与 50
mmol/ L 连 苯 三 酚 10μ l 混 合 并 迅 速 摇 匀,于 直 径
1 cm的 比 色 杯,在 325 nm波 长 下 每 间 隔 20 s 测 光密 度 值 A 一 次,要 求 自 氧 化 速 率 每 分 钟 OD325值变 化 约 0,07。 酶 活 性 测 定 方 法 与 此 相 同,在 加 入连 苯 三 酚 前,加 入 待 测 的 血 清 50μ l,室 温 下 混 匀,
测 得 数 据 按 下 式 计 算 酶 活 性,
酶 活 性 = (0,07 - A325/ min) / (0,07 × 50 %) ×
100 %× 反 应 液 体 积 × 样 液 稀 释 倍 数 / 样 液 体 积酶 活 单 位 定 义,每 ml 反 应 液 中,每 min 抑 制连 苯 三 酚 自 氧 化 速 率 达 50 %的 酶 量 为 1 个 酶 活单 位 (U/ ml) 。
·62· 浙 江 农 业 学 报 第 16 卷 (2004)
1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House,All rights reserved,http://www.cnki.net
1,3,3 免 疫 保 护 率中 华 绒 螯 蟹 注 射 免 疫 增 强 剂 2 d 或 口 服 21
d 后,用 中 华 绒 螯 蟹 致 病 菌 嗜 水 气 单 胞 菌
CL99920 以 1 × 107,1 × 106 个 / m1 菌 含 量 注 射 蟹的 第 三 步 足 基 部,注 射 量 0,1 m1/ 只,每 组 8 只,
对 照 组 注 射 无 菌 生 理 盐 水,剂 量 同 试 验 组,饲 养水 温 26～ 27 ℃ 。 免 疫 保 护 率 = (对 照 组 死 亡 率
- 免 疫 组 死 亡 率 ) / 对 照 组 死 亡 率 × 100 %。
1,4 免 疫 增 强 剂 的 应 用 试 验将 壳 聚 糖 添 加 在 饲 料 中,浓 度 为 0,2 %,在疾 病 流 行 季 节,投 喂 未 给 发 病 蟹 的 中 华 绒 螯 蟹,
连 续 投 喂 9 d,隔 7 d 再 投 喂 。 试 验 分 别 在 上 海崇 明 及 浙 江 湖 州 的 养 蟹 场 进 行 。
2 结 果
2,1 注 射 不 同 免 疫 增 强 剂 对 中 华 绒 螯 蟹 免 疫功 能 的 影 响中 华 绒 螯 蟹 注 射 3 种 免 疫 增 强 剂 后,溶 菌酶 活 力,SOD 活 力 测 定 结 果 见 表 1。 血 清 中 溶 菌活 力 随 时 间 延 长 逐 渐 增 高,至 48 h 达 到 最 高 值,
至 72 h 其 活 力 减 弱 。 经 t 检 验,差 异 不 显 著 。
SOD 的 活 力 与 溶 菌 酶 的 结 果 相 似,48 h 时 最 高,
随 后 逐 渐 下 降,3 种 免 疫 增 强 剂 组 比 对 照 组 明 显表 1 注 射 免 疫 增 强 剂 对 中 华 绒 螯 蟹 血 清 中 溶 菌 酶 和超 氧 化 物 歧 化 酶 活 力 的 影 响
Table 1 Effects of injecting immunity2stimulants on lysozyme
and SOD activity in crab serum
测 定 项 目 及 时 间 / h A B C D
溶 菌 酶 酶 活 力
3 0,074 0,143 0,102 0,061
6 0,188 0,160 0,180 0,074
24 0,130 0,136 0,194 0,137
48 0,185 0,234 0,233 0,092
72 0,088 0,139 0,119 0,086
96 0,059 0,091 0,058 0,113
t 检 验 t < t0,05 t < t0,05 t < t0,05
超 氧 化 物 歧 化 酶 活 力
3 151,5 158,1 138,3 105,4
6 256,8 223,9 250,3 121,3
24 274,6 261,5 230,5 150,3
48 283,2 263,4 289,8 118,5
72 250,3 191,1 164,6 109,6
96 191,2 138,3 158,0 115,8
t 检 验 t > t0,01 t > t0,01 t0,01 >t >t0,05
注,酶 活 单 位 见 1,3 节 。
提 高,经 t 检 验,A,B 组 血 清 中 SOD 活 力 与 对 照相 比,差 异 极 显 著,C 组 差 异 显 著 。
从 表 2 结 果 可 以 看 出,注 射 免 疫 增 强 剂 组 蟹的 死 亡 率 低 于 对 照 组,说 明 中 华 绒 螯 蟹 对 细 菌 的攻 击 具 有 明 显 的 保 护 作 用,免 疫 保 护 率 为 75 %。
表 2 注 射 免 疫 增 强 剂 后 各 处 理 组 的 保 护 率 试 验
Table 2 Protecting test of various treatments after injecting
immunity2stimulants
处 理 细 菌浓 度 /
cfu· ml - 1
试 验总 数 /
只不 同 死 亡 时 间 (h)的 累 计 死 亡 数
24 48 72 96
死 亡率 / %
免 疫保 护率 / %
A 107 8 0 2 2 2 25,0 75,0
106 8 0 0 0 0 0
B 107 8 1 3 3 3 25,5 74,5
106 8 0 0 0 0 0
C 107 8 1 2 2 2 25,0 75,0
106 8 0 0 0 0 0
D 107 8 7 8 8 8 100
106 8 0 0 0 0 0
2,2 口 服 不 同 免 疫 增 强 剂 对 中 华 绒 螯 蟹 免 疫功 能 的 影 响中 华 绒 螯 蟹 经 口 服 免 疫 增 强 剂 后,血 清 中 溶菌 酶 及 SOD 的 活 力 比 注 射 组 提 高 慢,至 第 9 天 酶活 性 明 显 高 于 对 照 组,经 t 检 验,各 组 血 清 中 溶 菌酶 活 力 与 对 照 相 比,差 异 极 显 著 ;SOD 的 活 力 与对 照 相 比,E组 差 异 极 显 著,F,G组 差 异 显 著 。
表 3 口 服 免 疫 增 强 剂 对 中 华 绒 螯 蟹 血 清 中 溶 菌 酶 和超 氧 化 物 歧 化 酶 活 力 的 影 响
Table 3 Effects of oral immunity2stimulants on lysozyme and
SOD activity in crab serum
测 定 项 目 及 时 间 / d E F G H
溶 菌 酶 活 力
3 0,090 0,085 0,076 0,059
6 0,134 0,073 0,120 0,037
9 0,188 0,182 0,177 0,069
12 0,175 0,161 0,199 0,019
15 0,150 0,14 0,139 0,017
18 0,169 0,11 0,117 0,027
21 0,112 0,172 0,152 0,084
t 检 验 t > t0,01 t > t0,01 t > t0,01
超 氧 化 物 歧 化 酶 活 力
3 135,9 131,2 106,8 101,0
6 151,4 146,6 139,9 87,3
9 144,1 138,9 178,6 104,5
12 110,4 116,8 108,3 99,7
15 127,5 110,4 109,8 102,3
18 139,4 121,5 165,9 113,5
21 140,3 118,9 172,7 88,6
t 检 验 t > t0,01 t0,01 > t > t0,05 t0,01 > t > t0,05
·72·沈 锦 玉 等,免 疫 增 强 剂 对 中 华 绒 螯 蟹 免 疫 功 能 的 影 响
1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House,All rights reserved,http://www.cnki.net
从 表 4 结 果 可 以 看 出,口 服 免 疫 增 强 剂 组蟹 的 死 亡 率 与 对 照 组 相 同,说 明 口 服 免 疫 增 强剂 后 中 华 绒 螯 蟹 对 强 毒 攻 击 没 有 明 显 保 护 作用 。
表 4 口 服 免 疫 增 强 剂 后 各 处 理 组 的 保 护 率 试 验
Table 4 Protecting test of various treatments after oral immu2
nity2stimulants
处 理 细 菌浓 度 /
cfu· ml - 1
试 验总 数 /
只不 同 死 亡 时 间 (h)的 累 计 死 亡 数
24 48 72 96
死 亡率 / %
E 107 8 2 6 6 8 100
106 8 0 0 0 0 0
F 107 8 4 6 8 8 100
106 8 0 0 0 0 0
G 107 8 3 5 8 8 100
106 8 0 0 0 0 0
H 107 8 8 8 8 8 100
106 8 0 0 0 0 0
2,3 口 服 免 疫 增 强 剂 的 应 用 试 验上 海 崇 明 某 养 殖 场,总 面 积 约 133 hm2,其中 53,3 hm2 养 殖 池 的 中 华 绒 螯 蟹 投 喂 含 壳 聚 糖的 配 合 饲 料,整 个 养 殖 过 程 中,投 喂 组 中 华 绒 螯蟹 的 成 活 率 比 对 照 组 提 高 约 15 %。 浙 江 湖 州 某养 蟹 场 总 面 积 约 26 hm2,其 中 5,7 hm2 投 喂 含 壳聚 糖 的 饲 料,与 对 照 组 相 比,中 华 绒 螯 蟹 的 生 长情 况 较 好,病 害 发 生 率 下 降,成 活 率 提 高 约
12 %。 说 明 免 疫 增 强 剂 如 壳 聚 糖 能 较 好 地 调 节非 特 异 性 免 疫,增 强 中 华 绒 螯 蟹 对 疾 病 的 抵 抗力,减 少 病 害 的 发 生,提 高 中 华 绒 螯 蟹 的 成 活率 。
3 讨 论抗 菌 素 是 目 前 水 生 动 物 防 治 病 害 的 常 用 药物,但 易 带 来 药 物 残 留 等 问 题 。 另 外,多 次 使 用会 产 生 耐 药 性 菌 株 和 塘 泥 污 染 的 危 害 。 最 近,
国 内 对 这 类 药 物 的 使 用 作 了 严 格 的 限 制 \[11 \]。 因此,开 展 免 疫 激 活 剂 在 水 产 养 殖 业 上 应 用 的 研究,具 有 更 广 阔 的 前 景 。
本 研 究 中 应 用 的 A 组 为 微 生 物 多 糖 类 β 21,
3 葡 聚 糖 (laminarin) 作 为 阳 性 对 照,葡 聚 糖 的 免疫 增 强 效 果 已 得 广 泛 研 究,并 且 对 不 同 水 生 动物 具 有 广 谱 的 免 疫 增 强 作 用 \[12 \]。 B 组 为 全 菌苗,全 菌 苗 的 主 要 作 用 是 细 胞 壁 中 粘 多 糖 (LPS)
的 糖 苷 键,主 要 作 用 于 嗜 中 性 白 细 胞 和 巨 噬 细胞,还 能 促 进 鱼 类 IgM 的 生 成 。 对 虾 口 服 弧 菌疫 苗 后 产 量 可 提 高 8 % ～ 10 %,死 亡 率 减少 \[13～ 14 \]。 C 组 为 壳 聚 糖,壳 聚 糖 是 一 种 肽 聚糖 。 它 能 促 进 对 虾 苗 的 生 长,并 具 有 抗 菌 防 病作 用 \[8 \]。 经 试 验 证 实,3 种 不 同 物 质 β 21,3 葡 聚糖,灭 活 细 菌 苗,壳 聚 多 糖 作 为 免 疫 增 强 剂 通 过注 射 或 添 加 入 饲 料 中 饲 喂 中 华 绒 螯 蟹,血 清 中溶 菌 酶,超 氧 化 物 歧 化 酶 (SOD)的 活 性 明 显 高 于对 照 组,均 可 作 为 免 疫 增 强 剂,体 现 出 类 似 的 生物 学 活 性,具 有 刺 激 中 华 绒 螯 蟹 的 非 特 异 性 免疫 功 能 的 作 用,增 强 了 防 御 系 统 。 而 β 21,3 葡 聚糖 为 购 自 Sigma 公 司 的 免 疫 增 强 剂,价 格 昂 贵 ;
灭 活 细 菌 苗 易 制 备,壳 聚 多 糖 来 源 丰 富,价 格 合理,为 广 大 养 殖 户 所 接 受 。 因 此,灭 活 菌 苗 和 壳聚 多 糖 可 作 为 免 疫 增 强 剂 开 发,可 以 在 中 华 绒螯 蟹 养 殖 生 产 中 得 以 应 用 。
从 表 1 与 表 3 中 可 看 出,注 射 法 比 药 饵 法的 效 果 要 好,作 用 快,在 更 短 的 时 间 内 出 现 明 显的 效 果 。 但 这 种 方 法 操 作 繁 琐 且 费 用 高,一 时尚 难 应 用 于 规 模 化 生 产 中 。 而 通 过 口 服 药 饵法,出 现 的 效 应 时 间 较 长,给 药 途 径 在 生 产 实 践上 更 为 实 用,操 作 方 便,成 本 低,便 于 在 大 面 积养 殖 中 使 用,是 施 以 免 疫 激 活 剂 较 理 想 的 方 法 。
免 疫 增 强 剂 的 给 药 时 间 极 其 重 要,它 不 同于 抗 生 素 用 于 疾 病 的 发 生 时 期 或 初 期 。 免 疫 增强 剂 的 主 要 作 用 在 于 调 节 或 改 善 机 体 的 免 疫 功能,即 当 机 体 的 免 疫 功 能 下 降 或 被 抑 制 时,免 疫增 强 剂 就 能 提 高 机 体 的 免 疫 能 力 。 给 药 时 间 的长 短 也 是 免 疫 增 强 剂 发 挥 作 用 的 一 个 关 键 因素 。 从 表 1 可 知,注 射 48 h 后,溶 菌 酶 和 SOD 活力 明 显 提 高,而 用 药 饵 饲 喂 中 华 绒 螯 蟹 9 d 后,
既 能 明 显 提 高 SOD,又 能 显 著 增 强 溶 菌 酶 活 力,
从 而 提 高 了 中 华 绒 螯 蟹 的 非 特 异 性 免 疫 能 力,
21 d 时 的 效 果 与 9 d 时 的 相 似,无 明 显 差 别 。 因此,作 者 认 为 这 些 免 疫 增 强 剂 如 多 糖,全 菌 苗 和壳 聚 糖 按 一 定 的 量 加 入 饲 料 中 饲 喂 中 华 绒 螯蟹,可 达 到 理 想 效 果,且 一 个 疗 程 的 最 佳 时 间 为
9 d。 经 生 产 单 位 试 用,壳 聚 糖 能 较 好 地 预 防 病害 的 发 生,提 高 养 殖 成 活 率,可 以 在 水 产 养 殖 业
·82· 浙 江 农 业 学 报 第 16 卷 (2004)
1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House,All rights reserved,http://www.cnki.net
中 推 广 应 用 。
注 射 免 疫 增 强 剂 后,第 二 天 测 定 其 免 疫 保护 率 为 75 %。 而 口 服 免 疫 增 强 剂,经 病 原 菌 攻击 后,免 疫 增 强 剂 组 的 死 亡 率 与 对 照 组 没 有 明显 差 异,一 是 可 能 细 菌 攻 击 的 时 间 不 合 适 ;二 是可 能 没 有 准 确 掌 握 攻 击 菌 的 浓 度,即 应 该 在 107
与 106 之 间 找 到 一 个 更 合 适 的 浓 度 ;三 是 可 能 口服 免 疫 增 强 剂 虽 能 提 高 非 特 异 性 免 疫,但 其 作用 较 小,不 足 以 抵 抗 强 毒 力 菌 的 一 次 性 攻 击 。
关 于 这 方 面 的 问 题 有 待 进 一 步 研 究 。
参 考 文 献,
\[1 \] 姜 静 颖,邢 殿 楼,王 斌,等,池 塘 养 殖 中 华 绒 螯 蟹 幼 蟹 的一 种 球 状 病 毒 粒 子 的 电 镜 观 察 \[J \],大 连 水 产 学 院 学 报,
1996,11 (1),51 - 53.
\[2 \] 陆 宏 达,范 丽 萍,薛 美,中 华 绒 螯 蟹 小 核 糖 核 酸 病 毒 病 及其 组 织 病 理 学 \[J \],水 产 学 报,1999,23 (1),61 - 68.
\[3 \] 沈 锦 玉,尹 文 林,钱 冬,等,中 华 绒 螯 蟹,腹 水 病,及,抖 抖病,并 发 病 病 原 的 研 究 \[J \],中 国 水 产 科 学,2000,7 (3),89
- 92.
\[4 \] Fletcher TC,Non2specific defense mechanisms of fish \[ J \],
Developmental and Cooparative Immunology Suppl,1982,10
(2),123 - 132.
\[5 \] 吴 志 新,陈 强,陈 昌 福,左 旋 咪 唑 对 异 育 银 鲫 免 疫 促 进 作用 的 初 步 研 究 \[J \],华 中 农 业 大 学 学 报,1998,17 (4),378
- 381.
\[6 \] 王 雷,李 光 友,毛 远 兴,等,口 服 免 疫 型 药 物 对 养 殖 中 国对 虾 病 害 防 治 作 用 的 研 究 \[J \],海 洋 与 湖 沼,1994,25 (5),
486 - 491.
\[7 \] 刘 恒,李 光 友,免 疫 多 糖 对 养 殖 南 美 白 对 虾 作 用 的 研 究
\[J \],海 洋 与 湖 沼,1998,29(2),113 - 117.
\[8 \] 庄 承 纪,刘 劲 科,杨 清 友,等,壳 多 糖 对 罗 氏 沼 虾,斑 节 对虾 苗 生 长 和 抗 菌 防 病 作 用 研 究 \[J \],湛 江 海 洋 大 学 学 报,
1998,18 (3),29 - 34.
\[9 \] Hultmark D,Insect immuneity,purifyication and properties of
three inducible bactericidal proteins from hemolymph of im2
muneized pupae of Hyalophera cecropia,Eur J Biochem,
1980,106,7 - 16.
\[10 \] 邓 碧 玉,袁 勤,李 文 杰,等,改 良 后 的 连 苯 三 酚 自 氧 化 测定 超 氧 化 物 歧 化 酶 活 性 的 方 法 \[J \],生 物 化 学 与 生 物 物理 进 展,1991,18(2),163 - 165.
\[11 \] 周 德 庆,李 晓 川,李 兆 新,等,无 公 害 食 品 水 产 品 中 渔 药残 留 限 量 \[J \],中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 (NY 5070
- 2002),2002,361 - 369.
\[12 \] Di Luzio NR,Immunopharmacology of glucan,a broad spec2
trum enhancer of host defence mechanisms \[ J \],Trends
Pharmacol Sci,1983,4,344 - 347.
\[13 \] Sakai M,Atsuta S,Kobayashi M,The activation of leucocytes
in rainbow trout,Oncorhynchus mykiss,by oral administration
of Clostridium butyricum bacterin\[A\],Shariff JR,Subasinghe
RP,Diseases in Asian Aquaculture Ⅱ \[ C \],Manila,Fish
Health Section,Asian Fisheries Society,1995,427 - 431.
\[14 \] Sung HH,Song YL,Kou GH,Potential uses of bacterin to
prevent shrimp vibriosis\[J \],Fish Shellfish Immunol,1991,
1,311 - 312.
(责 任 编 辑 袁 醉 敏 )
·92·沈 锦 玉 等,免 疫 增 强 剂 对 中 华 绒 螯 蟹 免 疫 功 能 的 影 响
1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House,All rights reserved,http://www.cnki.net
免 疫 增 强 剂 对 中 华 绒 螯 蟹 免 疫 功 能 的 影 响沈 锦 玉,刘 问,曹 铮,尹 文 林,沈 智 华,钱 冬,吴 颖 蕾
(浙 江 省 淡 水 水 产 研 究 所,浙 江 湖 州 313001)
摘 要,用 3 种 不 同 免 疫 增 强 剂 多 糖 (laminarin),灭 活 细 菌 苗,壳 聚 多 糖 (chitosan) 注 射 (分 别 为 A,B,C 组,对照 为 D 组 )和 添 加 饵 料 饲 喂 中 华 绒 螯 蟹 (多 糖 为 E组,灭 活 细 菌 苗 为 F 组,壳 聚 多 糖 为 G组,对 照 为 H 组 ),
在 不 同 时 间 取 样 测 定 中 华 绒 螯 蟹 血 清 中 非 特 异 性 免 疫 指 标 的 变 化 及 中 华 绒 螯 蟹 的 免 疫 保 护 率 。 结 果 表 明,
注 射 后 48 h,A,B,C组 中 华 绒 螯 蟹 血 清 中 溶 菌 酶 活 力 分 别 为 0,185,0,234,0,233,对 照 组 为 0,094,经 t 检 验,
差 异 不 显 著 ;超 氧 化 物 歧 化 酶 (SOD)的 活 力 分 别 为 283,2,263,5,289,8,对 照 组 为 120,15,经 t 检 验,A,B 组 血清 中 SOD 活 力 差 异 极 显 著,C 组 差 异 显 著 。 口 服 免 疫 增 强 剂 后 第 9 天,血 清 中 溶 菌 酶,超 氧 化 物 歧 化 酶
(SOD)的 活 力 明 显 高 于 对 照 组,经 t 检 验,各 组 血 清 中 溶 菌 酶 活 力 与 对 照 相 比,差 异 极 显 著 ;SOD 的 活 力 与 对照 相 比,E组 差 异 极 显 著,F,G组 差 异 显 著 。 注 射 免 疫 增 强 剂 组 蟹 的 免 疫 保 护 率 达 75 %,而 口 服 免 疫 增 强 剂组 与 对 照 组 相 比 较,蟹 的 免 疫 保 护 率 没 有 明 显 的 差 异 。 壳 聚 糖 经 生 产 性 试 用,能 较 好 地 预 防 病 害 的 发 生,中华 绒 螯 蟹 成 活 率 比 对 照 组 提 高 10 %以 上 。
关 键 词,中 华 绒 螯 蟹 ;免 疫 增 强 剂 ;非 特 异 性 免 疫 ;溶 菌 酶 ;SOD
中 图 分 类 号,S966,16 文 献 标 识 码,A 文 章 编 号,1004 - 1524(2004) 01 - 0025 - 05
Effect of immunity2stimulants on immunity function of Eriocheir sinensis
SHEN Jin2yu,LIU Wen,CAO Zhen,YIN Wen2lin,SHEN Zhi2hua,QIAN Dong,WU Ying2lei
( Zhejiang Institute of Feshwater Fisheries,Huzhou 313001,China)
Abstract,The indices of non2specific immunity of freshwater crab,Eriocheir sinensis,injected or fed with laminarin(A),
Aeromonas hydrophila bacterin (B) and chitosan (C) were measured,After the 48 h of post2injecting,lysozyme activi2
ties of three experimental groups (A,B,and C) were 0,185,0,234 and 0,233,respectively,while the control group
(D) was 0,094,There were no significant differences between experimental and the control group by using t test,SOD
activities of three experimental groups were 283,2,263,5 and 289,8,respectively,while the control group was 120,15.
There were highly significant differences between A and D,and B and D,but there was no significant difference between
C and D,These results indicated that the three immunity2stimulants might significantly elevate the non2specific immunity
of crab,After the 9 days of post2feeding with medicated diet,the lysozyme activities of experimental group were higher
than those of the control group,There was highly significant difference between experimental group and the control group
by using t2test,The SOD activities of experimental group were also higher than those of the control group,There was high2
ly significant difference between E group and the control group (D),whereas there were significant differences between F
and the control group,and G group and the control group,The crab fed by immunity2stimulants could significantly in2
crease the non2specific immunity of crab,The chitosan used in the fields could efficiently prevent the occurrence of crab
disease and increased the survival rate of crab by > 10 % compared with the control group.
Key words,Eriocheir sinensis ; immunity2stimulants ; non2specific immunity ; lysozyme ; SOD
收 稿 日 期,2003 - 07 - 28
基 金 项 目,浙 江 省 科 技 厅 重 点 项 目 (991102312)
作 者 简 介,沈 锦 玉 (1963 - ),女,浙 江 湖 州 人,副 研 究 员,从 事 水 生 动 物 病 害 防 治 研 究 。
1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House,All rights reserved,http://www.cnki.net
近 几 年,中 华 绒 螯 蟹 ( Eriocheir sinensis ) 已成 为 我 国 名 特 优 水 产 养 殖 的 主 要 品 种 之 一,但是 细 菌 性 与 病 毒 性 等 疾 病 不 断 发 生 \[1～ 3 \],严 重影 响 生 产 。 蟹 病 防 治 已 成 为 当 务 之 急,除 常 规药 物 防 治 外,针 对 甲 壳 类 不 具 备 特 异 性 免 疫 系统 的 生 理 特 点,可 以 采 用 免 疫 增 强 剂 来 启 动 和调 节 中 华 绒 螯 蟹 非 特 异 性 免 疫,提 高 其 自 身 免疫 能 力 。 目 前 国 内 外 鱼 用 免 疫 增 强 剂 的 研 究 比较 活 跃 \[4～ 5 \],对 甲 壳 动 物 的 免 疫 增 强 剂 也 有 不少 研 究 \[6～ 8 \]。 中 国 对 虾,南 美 白 对 虾 等 甲 壳 类注 射 或 服 用 含 多 糖 等 成 分 的 免 疫 增 强 剂 后,可刺 激 其 免 疫 系 统,提 高 防 御 能 力,达 到 防 病 治病,提 高 成 活 率 的 目 的 。 但 免 疫 增 强 剂 对 中 华绒 螯 蟹 的 非 特 异 性 免 疫 的 研 究 尚 未 见 报 道 。 本试 验 采 用 3 种 免 疫 增 强 剂 通 过 注 射 或 作 为 饲 料添 加 剂 饲 喂 中 华 绒 螯 蟹,测 定 其 对 中 华 绒 螯 蟹血 清 中 溶 菌 酶,超 氧 化 物 歧 化 酶 (SOD) 及 免 疫 保护 率 的 影 响,从 而 筛 选 合 适 的 免 疫 增 强 剂,为 甲壳 类 的 病 害 防 治 提 供 科 学 依 据 。
1 材 料 与 方 法
1,1 材 料健 康 中 华 绒 螯 蟹 购 自 浙 江 湖 州 某 养 蟹 场,
体 重 50～ 70 g,饲 养 于 1 m3 的 水 泥 池 中,水 温 26
～ 28 ℃,每 池 饲 养 15 只 。 每 组 3 只 池,池 内 放 适量 喜 旱 莲 子 草,瓦 片 等,每 天 投 喂 2 次 约 占 体 重
5 %的 蟹 配 合 饲 料 。 暂 养 1 周 后 供 试 验 用 。
1,2 试 验 处 理
1,2,1 注 射 免 疫 增 强 剂
4 个 处 理 组,A 组 为 多 糖 ( laminarin,购 自
Sigma 公 司 ),配 成 1 %的 生 理 盐 水 溶 液,每 100 g
体 重 的 蟹 注 射 0,2 ml ;B 组 为 中 华 绒 螯 蟹 的 细 菌灭 活 苗 (CL99920),细 菌 在 大 豆 胰 蛋 白 胨 培 养 液
(TSB)中,经 200 r/ min,28 ℃ 的 摇 床 培 养 24 h,加
0,2 %福 尔 马 林 灭 活 24 h,离 心 5 000 r/ min,20
min,用 无 菌 生 理 盐 水 洗 涤 2 次,以 109 cfu/ ml 浓度,每 100 g 体 重 蟹 注 射 0,2 ml ;C组 为 壳 聚 多 糖
(chitosan),1 % Chitosan 溶 解 于 0,5 %醋 酸 无 菌生 理 盐 水,pH 调 至 6,8,0,2 ml/ 100g 蟹 体 重 ;D
组 为 对 照 组,注 射 生 理 盐 水 0,2 ml/ 100g 蟹 体重 。 各 组 中 华 绒 螯 蟹 分 别 在 注 射 后 3,6,24,48,
72,96 h 取 样 3 只,附 肢 取 血,待 血 液 凝 固 后,取血 清,待 测 。
1,2,2 口 服 免 疫 增 强 剂
4 个 处 理 组,E 组 为 多 糖,药 物 终 浓 度 为 1
g/ kg 体 重,以 体 重 5 %的 投 饵 率,每 50 kg 饵 料中 的 添 加 量 为 25 g ; F 组 为 菌 苗 (同 B 组 ),添 加量 为 1 %。 G组 为 壳 聚 多 糖,以 1 %的 溶 液 拌 于饲 料 中,终 浓 度 为 0,2 % ; H 组 为 基 础 饵 料 (对 照组 ) 。 基 础 饵 料 购 自 浙 江 湖 州 饲 料 厂 。 制 备 各组 饵 料 时,将 添 加 物 直 接 加 入 基 础 饵 料 中,用 绞肉 机 挤 压 成 型,日 光 下 晒 干 或 烘 干 。 各 组 中 华绒 螯 蟹 连 续 口 服 1 月,分 别 在 口 服 后 第 3 天 开始 取 样,每 组 取 样 3 只,每 3 天 测 1 次,共 测 7
次,血 清 制 备 同 1,2,1 节 。
1,3 测 定 方 法
1,3,1 溶 菌 酶 活 力以 溶 壁 微 球 菌 ( Micrococcus lysoleiticus ) (购自 中 科 院 微 生 物 所 菌 种 室 ) 冻 干 粉 为 底 物,按
Hultmark 等 人 \[9 \]的 方 法 进 行 。 将 底 物 用 0,1
mol/ L,pH为 6,4 的 磷 酸 钾 盐 缓 冲 液 配 成 底 物 悬液 (OD570≈ 0,3) 。 取 3 m1 该 悬 液 50μ l,待 测 血清 于 试 管 中 混 匀,测 其 Ao 值 。 然 后 将 试 液 移 入
37 ℃ 水 浴 中 保 温 30 min,取 出 后 立 刻 置 于 冰 浴 中
10 min 以 终 止 反 应,测 其 A 值 。 溶 菌 活 力 U 按 下式 计 算,U = (Ao - A) / A。 式 中,U 为 溶 菌 活 力 ;
Ao 为 反 应 前 光 密 度 值 ;A 为 反 应 后 光 密 度 值 。
1,3,2 超 氧 化 物 歧 化 酶 (SOD)活 力参 照 邓 碧 玉 等 \[10\]的 方 法 进 行 。 测 定 时,将
50 mmol/ L pH为 8,3 的 磷 酸 缓 冲 液 4,5 ml 与 50
mmol/ L 连 苯 三 酚 10μ l 混 合 并 迅 速 摇 匀,于 直 径
1 cm的 比 色 杯,在 325 nm波 长 下 每 间 隔 20 s 测 光密 度 值 A 一 次,要 求 自 氧 化 速 率 每 分 钟 OD325值变 化 约 0,07。 酶 活 性 测 定 方 法 与 此 相 同,在 加 入连 苯 三 酚 前,加 入 待 测 的 血 清 50μ l,室 温 下 混 匀,
测 得 数 据 按 下 式 计 算 酶 活 性,
酶 活 性 = (0,07 - A325/ min) / (0,07 × 50 %) ×
100 %× 反 应 液 体 积 × 样 液 稀 释 倍 数 / 样 液 体 积酶 活 单 位 定 义,每 ml 反 应 液 中,每 min 抑 制连 苯 三 酚 自 氧 化 速 率 达 50 %的 酶 量 为 1 个 酶 活单 位 (U/ ml) 。
·62· 浙 江 农 业 学 报 第 16 卷 (2004)
1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House,All rights reserved,http://www.cnki.net
1,3,3 免 疫 保 护 率中 华 绒 螯 蟹 注 射 免 疫 增 强 剂 2 d 或 口 服 21
d 后,用 中 华 绒 螯 蟹 致 病 菌 嗜 水 气 单 胞 菌
CL99920 以 1 × 107,1 × 106 个 / m1 菌 含 量 注 射 蟹的 第 三 步 足 基 部,注 射 量 0,1 m1/ 只,每 组 8 只,
对 照 组 注 射 无 菌 生 理 盐 水,剂 量 同 试 验 组,饲 养水 温 26～ 27 ℃ 。 免 疫 保 护 率 = (对 照 组 死 亡 率
- 免 疫 组 死 亡 率 ) / 对 照 组 死 亡 率 × 100 %。
1,4 免 疫 增 强 剂 的 应 用 试 验将 壳 聚 糖 添 加 在 饲 料 中,浓 度 为 0,2 %,在疾 病 流 行 季 节,投 喂 未 给 发 病 蟹 的 中 华 绒 螯 蟹,
连 续 投 喂 9 d,隔 7 d 再 投 喂 。 试 验 分 别 在 上 海崇 明 及 浙 江 湖 州 的 养 蟹 场 进 行 。
2 结 果
2,1 注 射 不 同 免 疫 增 强 剂 对 中 华 绒 螯 蟹 免 疫功 能 的 影 响中 华 绒 螯 蟹 注 射 3 种 免 疫 增 强 剂 后,溶 菌酶 活 力,SOD 活 力 测 定 结 果 见 表 1。 血 清 中 溶 菌活 力 随 时 间 延 长 逐 渐 增 高,至 48 h 达 到 最 高 值,
至 72 h 其 活 力 减 弱 。 经 t 检 验,差 异 不 显 著 。
SOD 的 活 力 与 溶 菌 酶 的 结 果 相 似,48 h 时 最 高,
随 后 逐 渐 下 降,3 种 免 疫 增 强 剂 组 比 对 照 组 明 显表 1 注 射 免 疫 增 强 剂 对 中 华 绒 螯 蟹 血 清 中 溶 菌 酶 和超 氧 化 物 歧 化 酶 活 力 的 影 响
Table 1 Effects of injecting immunity2stimulants on lysozyme
and SOD activity in crab serum
测 定 项 目 及 时 间 / h A B C D
溶 菌 酶 酶 活 力
3 0,074 0,143 0,102 0,061
6 0,188 0,160 0,180 0,074
24 0,130 0,136 0,194 0,137
48 0,185 0,234 0,233 0,092
72 0,088 0,139 0,119 0,086
96 0,059 0,091 0,058 0,113
t 检 验 t < t0,05 t < t0,05 t < t0,05
超 氧 化 物 歧 化 酶 活 力
3 151,5 158,1 138,3 105,4
6 256,8 223,9 250,3 121,3
24 274,6 261,5 230,5 150,3
48 283,2 263,4 289,8 118,5
72 250,3 191,1 164,6 109,6
96 191,2 138,3 158,0 115,8
t 检 验 t > t0,01 t > t0,01 t0,01 >t >t0,05
注,酶 活 单 位 见 1,3 节 。
提 高,经 t 检 验,A,B 组 血 清 中 SOD 活 力 与 对 照相 比,差 异 极 显 著,C 组 差 异 显 著 。
从 表 2 结 果 可 以 看 出,注 射 免 疫 增 强 剂 组 蟹的 死 亡 率 低 于 对 照 组,说 明 中 华 绒 螯 蟹 对 细 菌 的攻 击 具 有 明 显 的 保 护 作 用,免 疫 保 护 率 为 75 %。
表 2 注 射 免 疫 增 强 剂 后 各 处 理 组 的 保 护 率 试 验
Table 2 Protecting test of various treatments after injecting
immunity2stimulants
处 理 细 菌浓 度 /
cfu· ml - 1
试 验总 数 /
只不 同 死 亡 时 间 (h)的 累 计 死 亡 数
24 48 72 96
死 亡率 / %
免 疫保 护率 / %
A 107 8 0 2 2 2 25,0 75,0
106 8 0 0 0 0 0
B 107 8 1 3 3 3 25,5 74,5
106 8 0 0 0 0 0
C 107 8 1 2 2 2 25,0 75,0
106 8 0 0 0 0 0
D 107 8 7 8 8 8 100
106 8 0 0 0 0 0
2,2 口 服 不 同 免 疫 增 强 剂 对 中 华 绒 螯 蟹 免 疫功 能 的 影 响中 华 绒 螯 蟹 经 口 服 免 疫 增 强 剂 后,血 清 中 溶菌 酶 及 SOD 的 活 力 比 注 射 组 提 高 慢,至 第 9 天 酶活 性 明 显 高 于 对 照 组,经 t 检 验,各 组 血 清 中 溶 菌酶 活 力 与 对 照 相 比,差 异 极 显 著 ;SOD 的 活 力 与对 照 相 比,E组 差 异 极 显 著,F,G组 差 异 显 著 。
表 3 口 服 免 疫 增 强 剂 对 中 华 绒 螯 蟹 血 清 中 溶 菌 酶 和超 氧 化 物 歧 化 酶 活 力 的 影 响
Table 3 Effects of oral immunity2stimulants on lysozyme and
SOD activity in crab serum
测 定 项 目 及 时 间 / d E F G H
溶 菌 酶 活 力
3 0,090 0,085 0,076 0,059
6 0,134 0,073 0,120 0,037
9 0,188 0,182 0,177 0,069
12 0,175 0,161 0,199 0,019
15 0,150 0,14 0,139 0,017
18 0,169 0,11 0,117 0,027
21 0,112 0,172 0,152 0,084
t 检 验 t > t0,01 t > t0,01 t > t0,01
超 氧 化 物 歧 化 酶 活 力
3 135,9 131,2 106,8 101,0
6 151,4 146,6 139,9 87,3
9 144,1 138,9 178,6 104,5
12 110,4 116,8 108,3 99,7
15 127,5 110,4 109,8 102,3
18 139,4 121,5 165,9 113,5
21 140,3 118,9 172,7 88,6
t 检 验 t > t0,01 t0,01 > t > t0,05 t0,01 > t > t0,05
·72·沈 锦 玉 等,免 疫 增 强 剂 对 中 华 绒 螯 蟹 免 疫 功 能 的 影 响
1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House,All rights reserved,http://www.cnki.net
从 表 4 结 果 可 以 看 出,口 服 免 疫 增 强 剂 组蟹 的 死 亡 率 与 对 照 组 相 同,说 明 口 服 免 疫 增 强剂 后 中 华 绒 螯 蟹 对 强 毒 攻 击 没 有 明 显 保 护 作用 。
表 4 口 服 免 疫 增 强 剂 后 各 处 理 组 的 保 护 率 试 验
Table 4 Protecting test of various treatments after oral immu2
nity2stimulants
处 理 细 菌浓 度 /
cfu· ml - 1
试 验总 数 /
只不 同 死 亡 时 间 (h)的 累 计 死 亡 数
24 48 72 96
死 亡率 / %
E 107 8 2 6 6 8 100
106 8 0 0 0 0 0
F 107 8 4 6 8 8 100
106 8 0 0 0 0 0
G 107 8 3 5 8 8 100
106 8 0 0 0 0 0
H 107 8 8 8 8 8 100
106 8 0 0 0 0 0
2,3 口 服 免 疫 增 强 剂 的 应 用 试 验上 海 崇 明 某 养 殖 场,总 面 积 约 133 hm2,其中 53,3 hm2 养 殖 池 的 中 华 绒 螯 蟹 投 喂 含 壳 聚 糖的 配 合 饲 料,整 个 养 殖 过 程 中,投 喂 组 中 华 绒 螯蟹 的 成 活 率 比 对 照 组 提 高 约 15 %。 浙 江 湖 州 某养 蟹 场 总 面 积 约 26 hm2,其 中 5,7 hm2 投 喂 含 壳聚 糖 的 饲 料,与 对 照 组 相 比,中 华 绒 螯 蟹 的 生 长情 况 较 好,病 害 发 生 率 下 降,成 活 率 提 高 约
12 %。 说 明 免 疫 增 强 剂 如 壳 聚 糖 能 较 好 地 调 节非 特 异 性 免 疫,增 强 中 华 绒 螯 蟹 对 疾 病 的 抵 抗力,减 少 病 害 的 发 生,提 高 中 华 绒 螯 蟹 的 成 活率 。
3 讨 论抗 菌 素 是 目 前 水 生 动 物 防 治 病 害 的 常 用 药物,但 易 带 来 药 物 残 留 等 问 题 。 另 外,多 次 使 用会 产 生 耐 药 性 菌 株 和 塘 泥 污 染 的 危 害 。 最 近,
国 内 对 这 类 药 物 的 使 用 作 了 严 格 的 限 制 \[11 \]。 因此,开 展 免 疫 激 活 剂 在 水 产 养 殖 业 上 应 用 的 研究,具 有 更 广 阔 的 前 景 。
本 研 究 中 应 用 的 A 组 为 微 生 物 多 糖 类 β 21,
3 葡 聚 糖 (laminarin) 作 为 阳 性 对 照,葡 聚 糖 的 免疫 增 强 效 果 已 得 广 泛 研 究,并 且 对 不 同 水 生 动物 具 有 广 谱 的 免 疫 增 强 作 用 \[12 \]。 B 组 为 全 菌苗,全 菌 苗 的 主 要 作 用 是 细 胞 壁 中 粘 多 糖 (LPS)
的 糖 苷 键,主 要 作 用 于 嗜 中 性 白 细 胞 和 巨 噬 细胞,还 能 促 进 鱼 类 IgM 的 生 成 。 对 虾 口 服 弧 菌疫 苗 后 产 量 可 提 高 8 % ～ 10 %,死 亡 率 减少 \[13～ 14 \]。 C 组 为 壳 聚 糖,壳 聚 糖 是 一 种 肽 聚糖 。 它 能 促 进 对 虾 苗 的 生 长,并 具 有 抗 菌 防 病作 用 \[8 \]。 经 试 验 证 实,3 种 不 同 物 质 β 21,3 葡 聚糖,灭 活 细 菌 苗,壳 聚 多 糖 作 为 免 疫 增 强 剂 通 过注 射 或 添 加 入 饲 料 中 饲 喂 中 华 绒 螯 蟹,血 清 中溶 菌 酶,超 氧 化 物 歧 化 酶 (SOD)的 活 性 明 显 高 于对 照 组,均 可 作 为 免 疫 增 强 剂,体 现 出 类 似 的 生物 学 活 性,具 有 刺 激 中 华 绒 螯 蟹 的 非 特 异 性 免疫 功 能 的 作 用,增 强 了 防 御 系 统 。 而 β 21,3 葡 聚糖 为 购 自 Sigma 公 司 的 免 疫 增 强 剂,价 格 昂 贵 ;
灭 活 细 菌 苗 易 制 备,壳 聚 多 糖 来 源 丰 富,价 格 合理,为 广 大 养 殖 户 所 接 受 。 因 此,灭 活 菌 苗 和 壳聚 多 糖 可 作 为 免 疫 增 强 剂 开 发,可 以 在 中 华 绒螯 蟹 养 殖 生 产 中 得 以 应 用 。
从 表 1 与 表 3 中 可 看 出,注 射 法 比 药 饵 法的 效 果 要 好,作 用 快,在 更 短 的 时 间 内 出 现 明 显的 效 果 。 但 这 种 方 法 操 作 繁 琐 且 费 用 高,一 时尚 难 应 用 于 规 模 化 生 产 中 。 而 通 过 口 服 药 饵法,出 现 的 效 应 时 间 较 长,给 药 途 径 在 生 产 实 践上 更 为 实 用,操 作 方 便,成 本 低,便 于 在 大 面 积养 殖 中 使 用,是 施 以 免 疫 激 活 剂 较 理 想 的 方 法 。
免 疫 增 强 剂 的 给 药 时 间 极 其 重 要,它 不 同于 抗 生 素 用 于 疾 病 的 发 生 时 期 或 初 期 。 免 疫 增强 剂 的 主 要 作 用 在 于 调 节 或 改 善 机 体 的 免 疫 功能,即 当 机 体 的 免 疫 功 能 下 降 或 被 抑 制 时,免 疫增 强 剂 就 能 提 高 机 体 的 免 疫 能 力 。 给 药 时 间 的长 短 也 是 免 疫 增 强 剂 发 挥 作 用 的 一 个 关 键 因素 。 从 表 1 可 知,注 射 48 h 后,溶 菌 酶 和 SOD 活力 明 显 提 高,而 用 药 饵 饲 喂 中 华 绒 螯 蟹 9 d 后,
既 能 明 显 提 高 SOD,又 能 显 著 增 强 溶 菌 酶 活 力,
从 而 提 高 了 中 华 绒 螯 蟹 的 非 特 异 性 免 疫 能 力,
21 d 时 的 效 果 与 9 d 时 的 相 似,无 明 显 差 别 。 因此,作 者 认 为 这 些 免 疫 增 强 剂 如 多 糖,全 菌 苗 和壳 聚 糖 按 一 定 的 量 加 入 饲 料 中 饲 喂 中 华 绒 螯蟹,可 达 到 理 想 效 果,且 一 个 疗 程 的 最 佳 时 间 为
9 d。 经 生 产 单 位 试 用,壳 聚 糖 能 较 好 地 预 防 病害 的 发 生,提 高 养 殖 成 活 率,可 以 在 水 产 养 殖 业
·82· 浙 江 农 业 学 报 第 16 卷 (2004)
1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House,All rights reserved,http://www.cnki.net
中 推 广 应 用 。
注 射 免 疫 增 强 剂 后,第 二 天 测 定 其 免 疫 保护 率 为 75 %。 而 口 服 免 疫 增 强 剂,经 病 原 菌 攻击 后,免 疫 增 强 剂 组 的 死 亡 率 与 对 照 组 没 有 明显 差 异,一 是 可 能 细 菌 攻 击 的 时 间 不 合 适 ;二 是可 能 没 有 准 确 掌 握 攻 击 菌 的 浓 度,即 应 该 在 107
与 106 之 间 找 到 一 个 更 合 适 的 浓 度 ;三 是 可 能 口服 免 疫 增 强 剂 虽 能 提 高 非 特 异 性 免 疫,但 其 作用 较 小,不 足 以 抵 抗 强 毒 力 菌 的 一 次 性 攻 击 。
关 于 这 方 面 的 问 题 有 待 进 一 步 研 究 。
参 考 文 献,
\[1 \] 姜 静 颖,邢 殿 楼,王 斌,等,池 塘 养 殖 中 华 绒 螯 蟹 幼 蟹 的一 种 球 状 病 毒 粒 子 的 电 镜 观 察 \[J \],大 连 水 产 学 院 学 报,
1996,11 (1),51 - 53.
\[2 \] 陆 宏 达,范 丽 萍,薛 美,中 华 绒 螯 蟹 小 核 糖 核 酸 病 毒 病 及其 组 织 病 理 学 \[J \],水 产 学 报,1999,23 (1),61 - 68.
\[3 \] 沈 锦 玉,尹 文 林,钱 冬,等,中 华 绒 螯 蟹,腹 水 病,及,抖 抖病,并 发 病 病 原 的 研 究 \[J \],中 国 水 产 科 学,2000,7 (3),89
- 92.
\[4 \] Fletcher TC,Non2specific defense mechanisms of fish \[ J \],
Developmental and Cooparative Immunology Suppl,1982,10
(2),123 - 132.
\[5 \] 吴 志 新,陈 强,陈 昌 福,左 旋 咪 唑 对 异 育 银 鲫 免 疫 促 进 作用 的 初 步 研 究 \[J \],华 中 农 业 大 学 学 报,1998,17 (4),378
- 381.
\[6 \] 王 雷,李 光 友,毛 远 兴,等,口 服 免 疫 型 药 物 对 养 殖 中 国对 虾 病 害 防 治 作 用 的 研 究 \[J \],海 洋 与 湖 沼,1994,25 (5),
486 - 491.
\[7 \] 刘 恒,李 光 友,免 疫 多 糖 对 养 殖 南 美 白 对 虾 作 用 的 研 究
\[J \],海 洋 与 湖 沼,1998,29(2),113 - 117.
\[8 \] 庄 承 纪,刘 劲 科,杨 清 友,等,壳 多 糖 对 罗 氏 沼 虾,斑 节 对虾 苗 生 长 和 抗 菌 防 病 作 用 研 究 \[J \],湛 江 海 洋 大 学 学 报,
1998,18 (3),29 - 34.
\[9 \] Hultmark D,Insect immuneity,purifyication and properties of
three inducible bactericidal proteins from hemolymph of im2
muneized pupae of Hyalophera cecropia,Eur J Biochem,
1980,106,7 - 16.
\[10 \] 邓 碧 玉,袁 勤,李 文 杰,等,改 良 后 的 连 苯 三 酚 自 氧 化 测定 超 氧 化 物 歧 化 酶 活 性 的 方 法 \[J \],生 物 化 学 与 生 物 物理 进 展,1991,18(2),163 - 165.
\[11 \] 周 德 庆,李 晓 川,李 兆 新,等,无 公 害 食 品 水 产 品 中 渔 药残 留 限 量 \[J \],中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 (NY 5070
- 2002),2002,361 - 369.
\[12 \] Di Luzio NR,Immunopharmacology of glucan,a broad spec2
trum enhancer of host defence mechanisms \[ J \],Trends
Pharmacol Sci,1983,4,344 - 347.
\[13 \] Sakai M,Atsuta S,Kobayashi M,The activation of leucocytes
in rainbow trout,Oncorhynchus mykiss,by oral administration
of Clostridium butyricum bacterin\[A\],Shariff JR,Subasinghe
RP,Diseases in Asian Aquaculture Ⅱ \[ C \],Manila,Fish
Health Section,Asian Fisheries Society,1995,427 - 431.
\[14 \] Sung HH,Song YL,Kou GH,Potential uses of bacterin to
prevent shrimp vibriosis\[J \],Fish Shellfish Immunol,1991,
1,311 - 312.
(责 任 编 辑 袁 醉 敏 )
·92·沈 锦 玉 等,免 疫 增 强 剂 对 中 华 绒 螯 蟹 免 疫 功 能 的 影 响
1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House,All rights reserved,http://www.cnki.net
