大 口 黑 鲈 肝 细 胞 中 恩 诺 沙 星 的 消 除 及 其 代 谢 酶 活 性 的 测 定王 翔 凌,杨 先 乐 1,2,林 茂 3,喻 文 娟 1,张 宁 1,张 书 俊 1
(11 上 海 水 产 大 学 农 业 部 渔 业 动 植 物 病 原 库,上 海 200090 ; 21 上 海 高 校 水 产 养 殖 学 E2研 究 院,上 海 200090 ; 31 集 美 大 学 水产 学 院,福 建 厦 门 361021)
摘 要,建 立 了 反 相 高 效 液 相 色 谱 法 检 测 大 口 黑 鲈 ( Micropterus sal moides) 原 代 肝 细 胞 中 恩 诺 沙 星 ( Enrofloxacin,EF) 代 谢情 况 的 方 法,并 通 过 其 代 谢 产 物 环 丙 沙 星 (Ciprofloxacin,CF)来 间 接 反 映 恩 诺 沙 星 N - 脱 乙 基 酶 的 活 性 。 采 用 二 氯 甲 烷提 取 细 胞 中 的 药 物,正 己 烷 去 脂,反 相 高 效 液 相 色 谱 法 测 定 其 中 的 药 物 浓 度 。 经 测 得 该 方 法 样 品 回 收 率 均 大 于
80128 %,日 间 变 异 系 数 小 于 5154 %。 通 过 EF 与 大 口 黑 鲈 肝 细 胞 进 行 孵 育,发 现 EF 在 细 胞 中 的 消 除 方 程 为 C =
50e - 01000 8 t,消 除 半 衰 期 ( T1/ 2)为 86163 h,消 除 速 率 常 数 ( K) 为 8 × 10 - 4/ h。 对 孵 育 过 程 中 的 酶 活 研 究 发 现 最 佳 孵 育 时间 为 45 min,其 酶 活 性 为 0125μ g/ (min· mg),酶 动 力 学 参 数 中 最 大 反 应 速 率 ( V max)为 0129μ g/ (min· mg),米 氏 常 数 ( Km)
为 22137μ g/ mL,内 在 清 除 率 ( Clint)为 0101 mL/ (min· mg) 。 结 果 表 明,该 酶 与 底 物 结 合 力 不 强,酶 促 反 应 强 度 较 弱,EF
在 大 口 黑 鲈 肝 细 胞 中 的 代 谢 较 缓 慢 。 [中 国 水 产 科 学,2007,14 (6),1 004 - 1 009 ]
关 键 词,大 口 黑 鲈 ;肝 细 胞 ;恩 诺 沙 星 ;反 相 高 效 液 相 色 谱 法 ;消 除 ;酶 活中 图 分 类 号,S94 文 献 标 识 码,A 文 章 编 号,1005 - 8737 - (2007) 06 - 1004 - 06
收 稿 日 期,2007 - 04 - 21 ; 修 订 日 期,2007 - 07 - 20.
基 金 项 目,国 家 自 然 科 学 基 金 项 目 (30371109) ;上 海 市 教 委 E - 研 究 院 建 设 资 助 项 目 ( E03009) ;上 海 市 重 点 学 科 建 设 资 助 项 目 ( Y1101),
作 者 简 介,王 翔 凌 (1979 - ),女,博 士 研 究 生,主 要 从 事 水 产 动 物 疾 病 与 药 理 学 研 究,Tel,021 - 65710870,E2mail,nancywxl @eyou,com
通 讯 作 者,杨 先 乐,Tel,021 - 65710503 ; E2mail,xlyang @shfu,edu,cn
细 胞 色 素 P450 是 肝 微 粒 体 混 合 功 能 氧 化 酶 中最 重 要 的 一 族,在 外 源 性 和 内 源 性 物 质 代 谢 中 起 着极 其 重 要 的 作 用 [1 - 2 ] 。 恩 诺 沙 星 ( Enrofloxacin,EF)
的 代 谢 反 应 为 典 型 的 P450 酶 代 谢 反 应 [3 ],代 谢 酶为 N2脱 乙 基 酶,其 主 要 活 性 代 谢 产 物 为 环 丙 沙 星
(Ciprofloxacin,CF) (图 1) [4 ] 。 EF 作 为 第 三 代 氟 喹诺 酮 类 药 物,由 于 其 广 谱 抗 菌 特 性,曾 在 兽 医 和 水 产上 得 到 了 广 泛 的 应 用 [5 ] 。 目 前 该 药 由 于 其 残 留 问题,在 有 些 水 产 动 物 体 内 已 被 禁 用,因 此 关 于 该 药 在水 产 动 物 体 内 的 代 谢 及 消 除 问 题 已 经 引 起 了 人 们 的重 视 。
图 1 EF 的 氧 化 脱 乙 基
Fig11 Oxidative deethylation of EF
目 前 对 药 物 残 留 问 题 的 研 究 主 要 是 通 过 其 在 动物 体 内 的 代 谢 情 况 来 反 应,EF 在 家 禽,家 畜 以 及 海水 鲈 体 内 的 代 谢 研 究 已 有 报 道 [3 - 6 ],而 在 体 外 研 究
EF 的 代 谢 及 其 代 谢 酶 的 活 性 从 而 能 够 省 时 经 济 地反 应 药 物 的 残 留 状 况 目 前 尚 未 见 报 道 。 有 关 体 外 测定 P450 酶 活 性 的 报 道 多 数 是 以 肝 微 粒 体 为 反 应 体系 [7 - 8 ],但 用 靶 动 物 大 口 黑 鲈 的 肝 细 胞 进 行 药 物 代谢 的 研 究 尚 未 见 报 道 。 在 细 胞 中 研 究 药 物 代 谢 及 相关 酶 活 能 够 排 除 体 内 各 种 因 素 对 该 研 究 的 影 响,全面 真 实 地 反 应 药 物 代 谢,因 此 本 实 验 采 用 反 相 高 效第 14 卷 第 6 期
2 0 0 7 年 1 1 月
中 国 水 产 科 学
Journal of Fishery Sciences of China
Vol,14 No,6
November 2007
液 相 色 谱 ( RP - HPLC) 法 测 定 了 抗 菌 药 物 EF 在 大口 黑 鲈 ( M icropterus sal moi des) 肝 细 胞 中 代 谢 情 况从 而 间 接 反 映 代 谢 酶 的 活 性,并 建 立 了 N2脱 乙 基 酶的 基 础 酶 活 模 型,同 时 该 研 究 也 能 够 为 该 酶 所 属 的
P450 家 族 或 亚 家 族 的 酶 活 研 究 提 供 理 论 基 础,为 水产 品 的 药 物 残 留 监 控 提 供 理 论 基 础,对 该 酶 的 实 际应 用 方 面 具 有 一 定 的 指 导 意 义 。
1 材 料 和 方 法
111 材 料大 口 黑 鲈 原 代 肝 细 胞,由 本 实 验 室 (农 业 部 渔 业动 植 物 病 原 库 )其 他 人 员 协 助 提 供,以 M199 与 L15
混 合 培 养 基 (1∶ 1)置 于 28 ℃,5 %CO2下 培 养 。
112 药 品 及 试 剂
EF 标 准 品 (含 量 98 %),CF 标 准 品 (含 量
99103 %),均 由 SIGMA 公 司 提 供 ;二 氯 甲 烷,正 己烷,四 丁 基 溴 化 铵,氯 化 钠,磷 酸 氢 二 钠,磷 酸 二 氢钠,磷 酸,肝 素 钠 等 均 为 国 产 分 析 纯,由 中 国 医 药 集团 上 海 化 学 试 剂 有 限 公 司 提 供 ;乙 腈 为 美 国 Fisher
色 谱 纯 。
113 高 效 液 相 色 谱 仪 及 色 谱 条 件
Agilent 1100 型 高 效 液 相 色 谱 ( HPLC)仪 (色 谱 柱类 型,ZORBAX SB2C18,416 × 150 mm,5μ m,) ;可 变 波长 紫 外 检 测 器 ;流 动 相 ∶ 乙 腈 ∶ pH 714 磷 酸 钠 缓 冲 液
(含 015 %四 丁 基 溴 化 铵 ) = 5∶ 95 (V/ V),用 H3 PO4调
pH至 310,过 滤 脱 气 后 现 用 ;流 速 110 mL/ min ;柱 温
40 ℃ ;紫 外 检 测 波 长 276 nm ;进 样 量 20μ L。
114 制 样 方 法取 细 胞,倒 掉 培 养 基,用 D2Hank’ s 液 轻 洗 细 胞
2～ 3次,不 要 破 坏 细 胞 层 。 将 细 胞 轻 轻 吹 打 后 用 D2
Hank’ s 液 稀 释 成 一 定 浓 度,计 数 。 参 考 王 翔 凌 等 [9 ]
所 报 道 的 该 类 药 物 的 提 取 方 法,取 1 mL 该 细 胞 于 离心 管 中 加 入 一 定 量 的 所 需 浓 度 的 EF 或 CF,将 制 得 的细 胞 样 品 于 漩 涡 混 合 器 上 混 合 2 min,再 根 据 所 取 细胞 量 按 1∶ 4 (V/ V) 分 别 加 入 二 氯 甲 烷,混 合 2 min,液体 快 速 混 合 器 上 中 速 混 合 10 min,8 000 r/ min 离 心
10 min,弃 去 上 层 水 相,将 下 层 有 机 相 倒 入 7 mL 具塞 离 心 管 中,将 残 渣 再 次 加 入 以 上 试 剂,试 剂 量 减半,重 复 以 上 操 作 步 骤,进 行 第 二 次 萃 取,合 并 两 次有 机 相,用 样 品 蒸 干 仪 在 45 ℃ 恒 温 中 蒸 干 。 蒸 残 物用 015 mL 流 动 相 溶 解,漩 涡 混 合 器 上 混 匀 2 min,
加 入 1 mL 正 己 烷 去 脂,液 体 快 速 混 合 器 上 混 匀
10 min,8 000 r/ min 离 心 10 min,吸 取 下 层 液 体
20μ L 进 样,进 行 HPLC 测 定 。
115 定 量 方 法 的 建 立
11511 标 准 曲 线 的 制 备 及 线 性 范 围 的 测 定 将 一系 列 不 同 浓 度 的 EF 或 CF 标 准 液 依 次 加 入 到 各 空白 细 胞 中,制 得 含 药 物 质 量 浓 度 分 别 为 0102,0105、
011,015,215,5,10,20,50,100,200μ g/ mL 的 细 胞样 品,按 114 中 所 述 方 法 制 样,进 行 HPLC 检 测 。
以 药 物 标 准 品 在 空 白 样 品 中 的 质 量 浓 度 ( Ci ) 为 横坐 标,以 药 物 峰 面 积 ( A i)为 纵 坐 标,分 别 绘 制 EF 和
CF 在 细 胞 中 的 标 准 曲 线 并 且 得 出 回 归 方 程,根 据 各样 品 标 准 曲 线 的 相 关 系 数 估 计 细 胞 样 品 中 EF 和
CF 定 量 的 线 性 范 围 。
11512 最 低 检 测 限 ( LOD) 的 测 定 将 细 胞 样 品 标准 曲 线 范 围 内 的 最 低 浓 度 的 EF 和 CF 标 准 液 依 次稀 释 成 呈 梯 度 降 低 的 一 系 列 标 准 液 并 加 入 到 空 白 细胞 样 品 中,按 114 中 所 述 方 法 制 样,进 行 HPLC 检测 。 以 信 噪 比 ≥ 3 的 最 低 浓 度 作 为 样 品 中 EF 和 CF
的 最 低 检 测 限 (LOD) 。
11513 回 收 率 和 变 异 系 数 的 测 定 取 空 白 样 品,添加 适 量 药 物 标 准 液,配 制 成 分 别 含 EF 或 CF 浓 度 为
0102,20,200μ g/ mL 的 细 胞 样 品,日 内 每 个 浓 度 设置 5 个 样 品 (日 内 ),在 不 同 时 间 重 复 以 上 操 作 5 次
(日 间 ),进 行 HPLC 检 测 。 分 别 求 得 细 胞 样 品 中 EF
或 CF 峰 面 积 A,可 得 日 内 变 异 系 数 ( Intra - day
CV)和 日 间 变 异 系 数 ( Inter - day CV) 。 同 时 将 一定 量 的 标 准 液 用 流 动 相 配 成 对 应 的 水 平 做 HPLC
分 析,可 得 以 上 6 种 浓 度 的 EF 或 CF 标 准 液 的 峰 面积 (B) 。 根 据 公 式 A/ B × 100 %即 可 得 各 空 白 样 品中 添 加 EF 或 CF 的 回 收 率 (Recovery) 。
116 大 口 黑 鲈 原 代 肝 细 胞 中 恩 诺 沙 星 的 代 谢 及 脱乙 基 酶 活 的 测 定
11611 大 口 黑 鲈 原 代 肝 细 胞 的 获 取 参 照 文 献
[10 ]的 方 法,待 培 养 的 大 口 黑 鲈 原 代 肝 细 胞 状 态 良 好时,倒 掉 原 有 的 培 养 基,用 pH 714 的 PBS缓 冲 液 清 洗
2～ 3 遍,刮 取 细 胞,加 入 适 量 PBS 缓 冲 液,500 r/ min,
离 心 5 min,弃 上 层,下 层 用 pH 714 的 缓 冲 液 将 细 胞稀 释 到 密 度 约 2 × 106 ind/ mL,即 可 用 于 实 验 。
11612 恩 诺 沙 星 的 体 外 温 孵 实 验 在 状 态 良 好 的大 口 黑 鲈 原 代 肝 细 胞 中 加 入 EF 的 标 准 品,使 其 终浓 度 为 50μ g/ mL,37 ℃ 摇 床 振 荡,分 别 孵 育 0,15、
30,45,60,90 min ;另 取 细 胞 与 浓 度 为 5,10,20,50、
100μ g/ mL 的 EF 共 孵 育 45 min。 每 点 设 5 个 平 行样,按 114 中 所 述 方 法 制 样,测 得 孵 育 后 EF 和 CF
第 6 期 王 翔 凌 等,大 口 黑 鲈 肝 细 胞 中 恩 诺 沙 星 的 消 除 及 其 代 谢 酶 活 性 的 测 定 1005
的 峰 面 积,每 个 时 间 点 设 5 个 平 行 样,按 114 中 所 述方 法 制 样,进 行 HPLC 检 测,根 据 标 准 曲 线 计 算 EF
和 CF 浓 度 。 Lowry 法 [11 ]测 定 细 胞 中 蛋 白 含 量,则
EF 脱 乙 基 酶 的 活 性 以 酶 促 反 应 速 率,即 每 mg 蛋 白单 位 时 间 内 的 CF 生 成 量 [μ g/ (min· mg) ]表 示 。
117 数 据 处 理数 据 处 理 中 利 用 SPSS(1115)进 行 显 著 性 分 析,
采 用 one2way ANOVA (单 因 素 方 差 分 析 ) 中 的 Dun2
can 检 验 进 行 多 重 比 较,当 P < 0105 时 认 为 差 异 显著 。 消 除 方 程 采 用 Ci = C0e - k t公 式 经 非 线 性 过 程处 理,Ci表 示 药 物 浓 度,C0表 示 初 始 浓 度,k 表 示 消除 速 率 常 数 。 药 酶 反 应 动 态 图 采 用 Excel 软 件 绘制 ;参 照 林 茂 等 [12 ]所 采 用 的 Lineweaver2Burk 方 程式 作 图 反 映 药 酶 动 力 学,并 计 算 酶 动 力 学 参 数,其 公式 为,
1
V =
Km
V max ×
1
[ S ] +
1
V max,Clint =
V max
Km
其 中 Km 为 米 氏 常 数,V max为 最 大 反 应 速 率,
Clint为 内 在 清 除 率 。
2 结 果 与 分 析
211 色 谱 条 件 的 确 定优 化 流 动 相 组 成,p H 和 流 速 等 条 件 后,EF 和
CF 药 物 峰 峰 形 较 好 且 能 完 全 分 离,并 且 与 杂 质 峰 完全 分 开 。 CF 保 留 时 间 在 4191 min 左 右,EF 保 留 时间 在 6173 min 左 右,空 白 样 品 提 取 液 在 上 述 保 留 时间 无 干 扰 峰 出 现 (图 2) 。
图 2 恩 诺 沙 星 ( EF)及 环 丙 沙 星 (CF)在 大 口 黑 鲈 肝 细 胞 中 的 色 谱 图
A,空 白 细 胞 提 取 液 ;B,含 EF 10μ g/ mL 的 细 胞 提 取 液 ;C,EF 与 细 胞 孵 育 45 min
Fig12 HPLC chromatogram for EF and CF in Micropterus sal moides hepatocytes
A,HPLC chromatogram from cells free of EF and CF ;B,HPLC chromatogram of EF (10μ g/ mL) extracted from cell ;C,HPLC chromatogram of
EF incubated with cell for 45 minutes.
212 定 量 方 法
21211 标 准 曲 线 及 线 性 范 围 标 准 曲 线 的 药 物 浓度 线 性 范 围,回 归 方 程 及 相 关 系 数 如 下 ( A i 表 示 药物 与 内 标 峰 面 积 比,Ci 表 示 药 物 标 准 品 在 空 白 细 胞中 的 浓 度 ),EF 0102～ 200μ g/ mL,A i = 140113 Ci -
57148,R = 01999 9 ; CF 0102～ 200μ g/ mL,A i =
95178 Ci - 93115,R = 01999 8。
21212 最 低 检 测 限 ( LOD) 经 测 得 EF 在 细 胞 中的 LOD 为 0105μ g/ mL,CF 在 细 胞 中 的 LOD 为
0102μ g/ mL 。
21213 回 收 率 和 变 异 系 数 按 114 制 样 方 法 操 作后,由 表 1 可 见 。 测 得 各 样 品 中 平 均 回 收 率 均 大 于
(80128 ± 4144) %,测 得 的 日 内 变 异 系 数 不 大 于
5113 %,日 间 变 异 系 数 不 大 于 5154 %。 所 得 数 据 表明 此 方 法 的 重 现 性 好,精 密 度 高 。
表 1 空 白 细 胞 中 添 加 EF和 CF时 回 收 率 及 变 异 系 数
Tab11 Recoveries and CV of EF and CF to Micropterus salmoides Hepatocytes n = 5 ; X ± SD ; %
质 量 浓 度
(μ g· mL - 1)
EF CF
回 收 率
Recovery rate
变 异 系 数 CV
日 内
Intra2day
日 间
Inter2day
回 收 率
Recovery rate
变 异 系 数 CV
日 内
Intra2day
日 间
Inter2day
0102 82170 ± 4144 4107 5137 80128 ± 4144 5113 5154
20 83119 ± 4137 3144 5125 85188 ± 4166 4134 5143
200 91154 ± 4124 3111 4163 90173 ± 3160 3127 3197
1006 中 国 水 产 科 学 第 14 卷
213 恩 诺 沙 星 体 外 温 孵 的 结 果
21311 恩 诺 沙 星 在 大 口 黑 鲈 肝 细 胞 中 的 消 除 EF
与 大 口 黑 鲈 原 代 肝 细 胞 孵 育 一 定 时 间 后,( CEF) 和
( CCF)的 量 随 孵 育 时 间 的 变 化 情 况 即 药 时 曲 线 如 图
3,可 知 EF 的 量 随 孵 育 时 间 的 延 长 在 由 快 到 慢 的 降低,而 CF 的 生 成 量 则 是 在 由 快 到 慢 的 升 高,到
90 min时 二 者 几 乎 趋 于 平 稳 状 态,但 二 者 在 大 口 黑鲈 肝 细 胞 中 的 变 化 均 为 非 线 性,曲 线 拟 合 得 消 除 方程 为 C = 50e - 01000 8 t,相 关 指 数 ( R2) 为 0171,消 除速 率 常 数 ( K) 为 8 × 10 - 4/ h,消 除 半 衰 期 ( T1/ 2) 为
86163 h。
图 3 大 口 黑 鲈 肝 细 胞 中 EF 代 谢 的 药 时 曲 线 ( n = 5,X
± SD)
Fig13 Concentration of EF time curve in Micropterus
sal moides hepatocytes( n = 5,X ± SD)
21312 孵 育 时 间 对 恩 诺 沙 星 脱 乙 基 酶 活 的 影 响
底 物 EF 与 大 口 黑 鲈 原 代 肝 细 胞 孵 育 后,其 代 谢 该药 物 的 酶 EF 脱 乙 基 酶 的 活 性 随 孵 育 时 间 的 变 化 如图 4 所 示 。
可 看 出 虽 然 随 着 孵 育 时 间 的 延 长,CF 的 生 成 量在 升 高,但 升 高 的 速 度 却 在 变 小,因 此 由 酶 活 性 公 式可 知 其 酶 活 却 在 降 低,尤 其 在 45 min 后 下 降 较 明显 。 通 过 显 著 性 比 较 分 析 可 看 出 当 孵 育 时 间 为
45 min时,其 酶 活 性 最 高 为 0125μ g/ ( min· mg) 。 因此 可 知 在 该 条 件 下 底 物 与 细 胞 孵 育 的 最 佳 时 间 为
45 min。
21313 恩 诺 沙 星 在 大 口 黑 鲈 肝 细 胞 中 的 酶 动 力 学
EF 与 大 口 黑 鲈 原 代 肝 细 胞 孵 育 45 min 后,通 过
HPLC 法 检 测 EF 剩 余 浓 度 (Ct)和 CF 生 成 量 (C n),
根 据 Linewaver2Burk 作 图,其 酶 促 反 应 动 力 学 方 程为,1/ V = 78135 × 1/ [ S ] + 31501 7 ( R2 = 019211),
如 图 5。 根 据 方 程 计 算 酶 动 力 学 参 数,其 最 大 反 应速 率 V max为 0129μ g/ ( min· mg),米 氏 常 数 Km 为
22137μ g/ mL,内 在 清 除 率 Clint为 0101 mL/ ( min·
mg) 。
图 4 大 口 黑 鲈 肝 细 胞 中 EF - N - 脱 乙 基 酶 的 酶 活 与 CF
浓 度 曲 线 ( n = 5,X ± SD)
Fig14 The curve for EF - N - deethylase activity and CF
concentration in Micropterus sal moides hepatocytes
( n = 5,X ± SD)
图 5 大 口 黑 鲈 肝 细 胞 中 EF 脱 乙 基 酶 的 lineweaver2Burk
作 图 ( n = 5,X ± SD)
Fig15 The lineweaver2Burk plot for EF deethylase activity in
Micropterus salmoides hepatocytes( n = 5,X ± SD)
3 讨 论
311 色 谱 条 件 的 优 化在 色 谱 条 件 的 确 定 中,流 动 相 的 组 成 曾 尝 试 选 用过 甲 醇,但 是 基 线 不 易 平 稳,并 且 柱 压 较 高,不 利 于 测样 。 通 过 对 EF 标 准 液 在 HPLC上 进 行 波 谱 扫 描 发 现其 最 大 吸 收 波 长 为 276 nm,因 此 本 实 验 条 件 下 选 定
276 nm 做 为 紫 外 检 测 波 长 。 在 流 动 相 的 配 比 中 也 做第 6 期 王 翔 凌 等,大 口 黑 鲈 肝 细 胞 中 恩 诺 沙 星 的 消 除 及 其 代 谢 酶 活 性 的 测 定 1007
了 不 少 的 尝 试,直 至 两 峰 得 到 良 好 分 离 。 由 于 EF 是两 性 物 质,在 流 动 相 中 易 解 离,对 组 份 的 保 留 时 间 和峰 形 都 会 造 成 不 良 影 响,在 流 动 相 中 加 入 四 丁 基 溴 化铵,用 以 消 除 色 谱 柱 中 十 八 烷 基 键 合 硅 胶 的 硅 羟 基 对
EF 碱 性 基 团 的 吸 附 作 用,同 时 将 流 动 相 pH 调 至 310
左 右,以 抑 制 药 物 解 离 或 改 变 峰 形 。
312 研 究 体 系 的 选 择 及 药 物 的 分 离 提 取 及 检 测药 物 体 外 代 谢 的 研 究 中 反 应 体 系 的 选 择 是 影 响结 果 准 确 性 的 首 要 因 素,目 前 为 止,主 要 用 到 的 有 亚细 胞 结 构,cDNA 表 达 的 P450 酶 以 及 肝 细 胞 和 肝 切片 等,但 经 过 与 文 献 [ 13 - 14 ]比 较 发 现,由 于 肝 细 胞技 术 的 发 展,使 用 完 整 的 细 胞 进 行 研 究 能 够 更 加 符合 药 物 在 体 内 的 代 谢 情 况,从 而 更 加 准 确 地 推 测 药物 在 体 内 的 实 际 代 谢,也 使 得 肝 细 胞 在 体 外 代 谢 方面 有 了 一 定 的 应 用 。 因 此 本 实 验 中 选 用 的 是 的 优 于鱼 的 肝 微 粒 体 等 亚 细 胞 结 构 或 其 他 反 应 体 系 的 的 肝细 胞 来 研 究 药 物 代 谢,更 能 反 应 真 实 情 况 。
实 验 过 程 中 曾 用 甲 醇,乙 腈 或 三 氯 醋 酸 直 接 提取,回 收 率 均 不 够 理 想 且 杂 质 较 多 。 本 实 验 最 终 采用 了 二 氯 甲 烷 作 为 萃 取 剂,去 除 细 胞 中 蛋 白 的 效 果较 好 且 回 收 率,变 异 系 数 等 均 能 符 合 要 求,且 二 氯 甲烷 沸 点 较 低 (40 ℃ ),极 易 吹 干,因 此 二 氯 甲 烷 是 较理 想 的 萃 取 剂 。 另 外 在 样 品 吹 干 后,将 其 浓 缩 2 倍,
以 降 低 药 物 在 细 胞 中 的 最 低 检 测 限 。
313 恩 诺 沙 星 在 大 口 黑 鲈 肝 细 胞 中 的 代 谢
EF 与 大 口 黑 鲈 肝 细 胞 温 孵 后,从 HPLC 图 上可 见 EF 被 迅 速 代 谢 形 成 代 谢 物 CF,随 着 时 间 的 延长,EF 在 大 口 黑 鲈 肝 细 胞 中 呈 非 线 性 消 除,与 此 同时 其 脱 乙 基 代 谢 物 CF 呈 非 线 性 增 加,当 给 药 后
90 min时,CF 几 乎 处 于 饱 和 状 态 。 Intorre 等 [3 ]研究 了 EF 在 黑 鲈 体 内 代 谢 及 消 除 情 况,发 现 在 体 内的 代 谢 产 物 同 样 为 CF,说 明 代 谢 该 药 物 的 P450 酶活 性 在 体 内 外 存 在 一 致 性 。 另 外,体 内 研 究 发 现 代谢 产 物 CF 主 要 出 现 在 肝 脏 中,其 次 是 血 浆 中,而 皮肤 和 肌 肉 很 少 出 现,说 明 该 代 谢 酶 主 要 存 在 于 肝 脏中,因 此 选 取 该 酶 含 量 较 高 的 肝 细 胞 作 为 体 外 实 验材 料,具 有 一 定 的 可 操 作 性 。 EF 在 体 外 的 消 除 半 衰期 为 86163 h,而 在 体 内 的 消 除 半 衰 期 为 25 h,体 内消 除 速 率 常 数 为 0103/ h,体 外 消 除 速 率 常 数 为 8 ×
10 - 4/ h,体 内 外 药 物 的 消 除 速 度 存 在 着 一 定 的 差别,差 别 的 存 在 是 由 于 多 种 因 素 造 成 的,如 体 内 外 环境 的 差 异,体 内 给 药 的 剂 量 以 及 体 外 药 物 与 细 胞 孵育 时 的 浓 度 等,因 此 关 于 体 内 外 药 物 代 谢 的 相 关 性尚 需 大 量 的 实 验 来 验 证 或 推 断,以 使 体 外 实 验 更 具有 实 际 意 义 。 体 外 研 究 方 法 便 于 控 制,操 作 简 便,代谢 体 系 较 纯 净,易 于 对 代 谢 产 物 进 行 分 离 提 取,可 以在 较 短 的 时 间 内 得 到 较 为 明 确 的 结 果,适 用 于 非 常重 要 的 Ⅰ 相 代 谢 产 物 的 研 究,能 够 为 药 物 的 结 构 改造 及 临 床 给 药 [15 ]提 供 依 据 。
314 EF在 细 胞 中 的 代 谢 及 其 基 础 酶 活 模 型本 试 验 中,选 用 鱼 类 常 用 抗 菌 药 EF 来 研 究 其代 谢 活 性,不 仅 为 该 药 在 细 胞 内 的 代 谢 提 供 了 一 定的 价 值,而 且 通 过 测 定 细 胞 中 蛋 白 含 量 后,用 EF 的代 谢 产 物 CF 的 产 量 来 反 映 酶 活 性 的 方 法 简 单 易行,是 测 定 P450 酶 活 性 所 常 用 的 方 法 。 关 于 P450
酶 的 活 性 的 诱 导 和 抑 制 已 引 起 医 药 界 的 关 注 [15 ],建立 一 种 高 效 而 简 便 的 酶 活 性 检 测 方 法 尤 为 重 要 。
EF 与 大 口 黑 鲈 在 37 ℃ 下 振 荡,孵 育 时 间 为
45 min,其 酶 活 最 高,因 此 在 该 条 件 下 可 选 定 最 佳 孵育 时 间 为 45 min。 通 过 对 酶 动 力 学 的 研 究 发 现
Vmax 为 0129μ g/ ( min· mg),内 在 清 除 率 Clint 为
0101 mL/ (min· mg),说 明 该 酶 在 大 口 黑 鲈 肝 细 胞 中的 基 础 酶 活 一 般,由 于 药 物 间 代 谢 的 相 互 作 用 是 影 响药 物 在 体 内 浓 度 水 平 的 一 个 重 要 因 素 [16 ],因 此 关 于对 该 酶 的 诱 导 和 抑 制 的 作 用 有 待 于 进 一 步 的 研 究 。
有 研 究 初 步 证 实 EF 脱 乙 基 酶 属 于 CYP3A 亚家 族 [17 ],该 家 族 的 P450 酶 不 仅 可 代 谢 一 些 内 源 性激 素 (如 氢 化 考 的 松,雌 激 素 等 ) 和 某 些 饮 食 中 的 有害 污 染 物,还 参 与 了 许 多 环 境 致 癌 剂 以 及 包 括 多 种常 用 化 疗 药 物 在 内 的 人 体 中 50 %以 上 的 药 物 代谢 [18 - 19 ],因 此 通 过 对 EF 脱 乙 基 酶 的 基 础 酶 活 模 型的 研 究 能 够 为 该 代 谢 酶 所 属 的 P450 家 族 或 亚 家 族作 为 环 境 毒 理 学 的 生 物 标 志 物 和 水 域 环 境 的 指 示 剂的 研 究 提 供 一 定 的 理 论 基 础 ;另 外 通 过 该 药 在 细 胞中 代 谢 的 研 究 能 够 了 解 该 药 在 水 产 动 物 体 内 作 用 机理 与 消 除 规 律,进 而 对 该 药 的 残 留 监 控 有 一 定 的 指导 意 义 。
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Elimination of enrofloxacin and detection of metabolic enzyme activity in Mi2
cropterus salmoides hepatocytes
WAN G Xiang2ling1,YAN G Xian2le1,2,L IN Mao3,YU Wen2juan1,ZHAN G Ning1,ZHAN G Shu2jun1
(11Aquatic Pathogen Collection Center of Ministry of Agriculture,Shanghai Fisheries University,Shanghai 200090,China ; 21E2In2
stitute of Shanghai Municipal Education Commission,Shanghai 200090,China ; 31Fisheries College,Jimei University,Xiamen
361021,China)
Abstract,In order to study the metabolism of enrofloxacin ( EF) and reflect the EF deethylase activity,En2
rofloxacin ( EF) and ciprofloxacin (CF) in M icropterus sal moi des hepatocytes were detected by reversed2
phase high performance liquid chromatography ( RP2HPLC),The medicine was extracted by dichloro2
methane from cell and the cell was degreased by hexane,The mean recovery rates were higher than 80128 %
and inter2day CV were all lower than 5154 % for all samples,When EF was incubated with M icropterus
sal moi des hepatocytes,the elimination equations for EF was C = 50e - 01000 8 t,elimination half life ( T1/ 2) and
elimination rate constant ( K) were 86163 h and 8 × 10 - 4/ h respectively,The best incubation time was 45 min
and the highest enzyme activity was 0125μ g/ (min· mg) at that time,Enzymatic parameters of maximum rate
( V max ) was 0129μ g/ (min· mg),the michaelis constant ( Km) and internal clearance rate( Clint) were 22137μ g/
mL and 0101 mL/ (min· mg),respectively,The results showed that the affinity between EF and EF deethy2
lase enzyme in M icropterus sal moi des hepatocytes and the intensity for enzymatic reaction were very low.
In additional,the metabolism for EF i n vit ro was slow,[Journal of Fishery Sciences of China,2007,14 (6),
1 004 - 1 009 ]
Key words,M icropterus sal moi des ;hepatocytes ;enrofloxacin ;RP2HPLC ;elimination ;enzyme activity
Corresponding author,YAN G Xian2le,E2mail,xlyang @shfu,edu,cn
第 6 期 王 翔 凌 等,大 口 黑 鲈 肝 细 胞 中 恩 诺 沙 星 的 消 除 及 其 代 谢 酶 活 性 的 测 定 1009
(11 上 海 水 产 大 学 农 业 部 渔 业 动 植 物 病 原 库,上 海 200090 ; 21 上 海 高 校 水 产 养 殖 学 E2研 究 院,上 海 200090 ; 31 集 美 大 学 水产 学 院,福 建 厦 门 361021)
摘 要,建 立 了 反 相 高 效 液 相 色 谱 法 检 测 大 口 黑 鲈 ( Micropterus sal moides) 原 代 肝 细 胞 中 恩 诺 沙 星 ( Enrofloxacin,EF) 代 谢情 况 的 方 法,并 通 过 其 代 谢 产 物 环 丙 沙 星 (Ciprofloxacin,CF)来 间 接 反 映 恩 诺 沙 星 N - 脱 乙 基 酶 的 活 性 。 采 用 二 氯 甲 烷提 取 细 胞 中 的 药 物,正 己 烷 去 脂,反 相 高 效 液 相 色 谱 法 测 定 其 中 的 药 物 浓 度 。 经 测 得 该 方 法 样 品 回 收 率 均 大 于
80128 %,日 间 变 异 系 数 小 于 5154 %。 通 过 EF 与 大 口 黑 鲈 肝 细 胞 进 行 孵 育,发 现 EF 在 细 胞 中 的 消 除 方 程 为 C =
50e - 01000 8 t,消 除 半 衰 期 ( T1/ 2)为 86163 h,消 除 速 率 常 数 ( K) 为 8 × 10 - 4/ h。 对 孵 育 过 程 中 的 酶 活 研 究 发 现 最 佳 孵 育 时间 为 45 min,其 酶 活 性 为 0125μ g/ (min· mg),酶 动 力 学 参 数 中 最 大 反 应 速 率 ( V max)为 0129μ g/ (min· mg),米 氏 常 数 ( Km)
为 22137μ g/ mL,内 在 清 除 率 ( Clint)为 0101 mL/ (min· mg) 。 结 果 表 明,该 酶 与 底 物 结 合 力 不 强,酶 促 反 应 强 度 较 弱,EF
在 大 口 黑 鲈 肝 细 胞 中 的 代 谢 较 缓 慢 。 [中 国 水 产 科 学,2007,14 (6),1 004 - 1 009 ]
关 键 词,大 口 黑 鲈 ;肝 细 胞 ;恩 诺 沙 星 ;反 相 高 效 液 相 色 谱 法 ;消 除 ;酶 活中 图 分 类 号,S94 文 献 标 识 码,A 文 章 编 号,1005 - 8737 - (2007) 06 - 1004 - 06
收 稿 日 期,2007 - 04 - 21 ; 修 订 日 期,2007 - 07 - 20.
基 金 项 目,国 家 自 然 科 学 基 金 项 目 (30371109) ;上 海 市 教 委 E - 研 究 院 建 设 资 助 项 目 ( E03009) ;上 海 市 重 点 学 科 建 设 资 助 项 目 ( Y1101),
作 者 简 介,王 翔 凌 (1979 - ),女,博 士 研 究 生,主 要 从 事 水 产 动 物 疾 病 与 药 理 学 研 究,Tel,021 - 65710870,E2mail,nancywxl @eyou,com
通 讯 作 者,杨 先 乐,Tel,021 - 65710503 ; E2mail,xlyang @shfu,edu,cn
细 胞 色 素 P450 是 肝 微 粒 体 混 合 功 能 氧 化 酶 中最 重 要 的 一 族,在 外 源 性 和 内 源 性 物 质 代 谢 中 起 着极 其 重 要 的 作 用 [1 - 2 ] 。 恩 诺 沙 星 ( Enrofloxacin,EF)
的 代 谢 反 应 为 典 型 的 P450 酶 代 谢 反 应 [3 ],代 谢 酶为 N2脱 乙 基 酶,其 主 要 活 性 代 谢 产 物 为 环 丙 沙 星
(Ciprofloxacin,CF) (图 1) [4 ] 。 EF 作 为 第 三 代 氟 喹诺 酮 类 药 物,由 于 其 广 谱 抗 菌 特 性,曾 在 兽 医 和 水 产上 得 到 了 广 泛 的 应 用 [5 ] 。 目 前 该 药 由 于 其 残 留 问题,在 有 些 水 产 动 物 体 内 已 被 禁 用,因 此 关 于 该 药 在水 产 动 物 体 内 的 代 谢 及 消 除 问 题 已 经 引 起 了 人 们 的重 视 。
图 1 EF 的 氧 化 脱 乙 基
Fig11 Oxidative deethylation of EF
目 前 对 药 物 残 留 问 题 的 研 究 主 要 是 通 过 其 在 动物 体 内 的 代 谢 情 况 来 反 应,EF 在 家 禽,家 畜 以 及 海水 鲈 体 内 的 代 谢 研 究 已 有 报 道 [3 - 6 ],而 在 体 外 研 究
EF 的 代 谢 及 其 代 谢 酶 的 活 性 从 而 能 够 省 时 经 济 地反 应 药 物 的 残 留 状 况 目 前 尚 未 见 报 道 。 有 关 体 外 测定 P450 酶 活 性 的 报 道 多 数 是 以 肝 微 粒 体 为 反 应 体系 [7 - 8 ],但 用 靶 动 物 大 口 黑 鲈 的 肝 细 胞 进 行 药 物 代谢 的 研 究 尚 未 见 报 道 。 在 细 胞 中 研 究 药 物 代 谢 及 相关 酶 活 能 够 排 除 体 内 各 种 因 素 对 该 研 究 的 影 响,全面 真 实 地 反 应 药 物 代 谢,因 此 本 实 验 采 用 反 相 高 效第 14 卷 第 6 期
2 0 0 7 年 1 1 月
中 国 水 产 科 学
Journal of Fishery Sciences of China
Vol,14 No,6
November 2007
液 相 色 谱 ( RP - HPLC) 法 测 定 了 抗 菌 药 物 EF 在 大口 黑 鲈 ( M icropterus sal moi des) 肝 细 胞 中 代 谢 情 况从 而 间 接 反 映 代 谢 酶 的 活 性,并 建 立 了 N2脱 乙 基 酶的 基 础 酶 活 模 型,同 时 该 研 究 也 能 够 为 该 酶 所 属 的
P450 家 族 或 亚 家 族 的 酶 活 研 究 提 供 理 论 基 础,为 水产 品 的 药 物 残 留 监 控 提 供 理 论 基 础,对 该 酶 的 实 际应 用 方 面 具 有 一 定 的 指 导 意 义 。
1 材 料 和 方 法
111 材 料大 口 黑 鲈 原 代 肝 细 胞,由 本 实 验 室 (农 业 部 渔 业动 植 物 病 原 库 )其 他 人 员 协 助 提 供,以 M199 与 L15
混 合 培 养 基 (1∶ 1)置 于 28 ℃,5 %CO2下 培 养 。
112 药 品 及 试 剂
EF 标 准 品 (含 量 98 %),CF 标 准 品 (含 量
99103 %),均 由 SIGMA 公 司 提 供 ;二 氯 甲 烷,正 己烷,四 丁 基 溴 化 铵,氯 化 钠,磷 酸 氢 二 钠,磷 酸 二 氢钠,磷 酸,肝 素 钠 等 均 为 国 产 分 析 纯,由 中 国 医 药 集团 上 海 化 学 试 剂 有 限 公 司 提 供 ;乙 腈 为 美 国 Fisher
色 谱 纯 。
113 高 效 液 相 色 谱 仪 及 色 谱 条 件
Agilent 1100 型 高 效 液 相 色 谱 ( HPLC)仪 (色 谱 柱类 型,ZORBAX SB2C18,416 × 150 mm,5μ m,) ;可 变 波长 紫 外 检 测 器 ;流 动 相 ∶ 乙 腈 ∶ pH 714 磷 酸 钠 缓 冲 液
(含 015 %四 丁 基 溴 化 铵 ) = 5∶ 95 (V/ V),用 H3 PO4调
pH至 310,过 滤 脱 气 后 现 用 ;流 速 110 mL/ min ;柱 温
40 ℃ ;紫 外 检 测 波 长 276 nm ;进 样 量 20μ L。
114 制 样 方 法取 细 胞,倒 掉 培 养 基,用 D2Hank’ s 液 轻 洗 细 胞
2～ 3次,不 要 破 坏 细 胞 层 。 将 细 胞 轻 轻 吹 打 后 用 D2
Hank’ s 液 稀 释 成 一 定 浓 度,计 数 。 参 考 王 翔 凌 等 [9 ]
所 报 道 的 该 类 药 物 的 提 取 方 法,取 1 mL 该 细 胞 于 离心 管 中 加 入 一 定 量 的 所 需 浓 度 的 EF 或 CF,将 制 得 的细 胞 样 品 于 漩 涡 混 合 器 上 混 合 2 min,再 根 据 所 取 细胞 量 按 1∶ 4 (V/ V) 分 别 加 入 二 氯 甲 烷,混 合 2 min,液体 快 速 混 合 器 上 中 速 混 合 10 min,8 000 r/ min 离 心
10 min,弃 去 上 层 水 相,将 下 层 有 机 相 倒 入 7 mL 具塞 离 心 管 中,将 残 渣 再 次 加 入 以 上 试 剂,试 剂 量 减半,重 复 以 上 操 作 步 骤,进 行 第 二 次 萃 取,合 并 两 次有 机 相,用 样 品 蒸 干 仪 在 45 ℃ 恒 温 中 蒸 干 。 蒸 残 物用 015 mL 流 动 相 溶 解,漩 涡 混 合 器 上 混 匀 2 min,
加 入 1 mL 正 己 烷 去 脂,液 体 快 速 混 合 器 上 混 匀
10 min,8 000 r/ min 离 心 10 min,吸 取 下 层 液 体
20μ L 进 样,进 行 HPLC 测 定 。
115 定 量 方 法 的 建 立
11511 标 准 曲 线 的 制 备 及 线 性 范 围 的 测 定 将 一系 列 不 同 浓 度 的 EF 或 CF 标 准 液 依 次 加 入 到 各 空白 细 胞 中,制 得 含 药 物 质 量 浓 度 分 别 为 0102,0105、
011,015,215,5,10,20,50,100,200μ g/ mL 的 细 胞样 品,按 114 中 所 述 方 法 制 样,进 行 HPLC 检 测 。
以 药 物 标 准 品 在 空 白 样 品 中 的 质 量 浓 度 ( Ci ) 为 横坐 标,以 药 物 峰 面 积 ( A i)为 纵 坐 标,分 别 绘 制 EF 和
CF 在 细 胞 中 的 标 准 曲 线 并 且 得 出 回 归 方 程,根 据 各样 品 标 准 曲 线 的 相 关 系 数 估 计 细 胞 样 品 中 EF 和
CF 定 量 的 线 性 范 围 。
11512 最 低 检 测 限 ( LOD) 的 测 定 将 细 胞 样 品 标准 曲 线 范 围 内 的 最 低 浓 度 的 EF 和 CF 标 准 液 依 次稀 释 成 呈 梯 度 降 低 的 一 系 列 标 准 液 并 加 入 到 空 白 细胞 样 品 中,按 114 中 所 述 方 法 制 样,进 行 HPLC 检测 。 以 信 噪 比 ≥ 3 的 最 低 浓 度 作 为 样 品 中 EF 和 CF
的 最 低 检 测 限 (LOD) 。
11513 回 收 率 和 变 异 系 数 的 测 定 取 空 白 样 品,添加 适 量 药 物 标 准 液,配 制 成 分 别 含 EF 或 CF 浓 度 为
0102,20,200μ g/ mL 的 细 胞 样 品,日 内 每 个 浓 度 设置 5 个 样 品 (日 内 ),在 不 同 时 间 重 复 以 上 操 作 5 次
(日 间 ),进 行 HPLC 检 测 。 分 别 求 得 细 胞 样 品 中 EF
或 CF 峰 面 积 A,可 得 日 内 变 异 系 数 ( Intra - day
CV)和 日 间 变 异 系 数 ( Inter - day CV) 。 同 时 将 一定 量 的 标 准 液 用 流 动 相 配 成 对 应 的 水 平 做 HPLC
分 析,可 得 以 上 6 种 浓 度 的 EF 或 CF 标 准 液 的 峰 面积 (B) 。 根 据 公 式 A/ B × 100 %即 可 得 各 空 白 样 品中 添 加 EF 或 CF 的 回 收 率 (Recovery) 。
116 大 口 黑 鲈 原 代 肝 细 胞 中 恩 诺 沙 星 的 代 谢 及 脱乙 基 酶 活 的 测 定
11611 大 口 黑 鲈 原 代 肝 细 胞 的 获 取 参 照 文 献
[10 ]的 方 法,待 培 养 的 大 口 黑 鲈 原 代 肝 细 胞 状 态 良 好时,倒 掉 原 有 的 培 养 基,用 pH 714 的 PBS缓 冲 液 清 洗
2～ 3 遍,刮 取 细 胞,加 入 适 量 PBS 缓 冲 液,500 r/ min,
离 心 5 min,弃 上 层,下 层 用 pH 714 的 缓 冲 液 将 细 胞稀 释 到 密 度 约 2 × 106 ind/ mL,即 可 用 于 实 验 。
11612 恩 诺 沙 星 的 体 外 温 孵 实 验 在 状 态 良 好 的大 口 黑 鲈 原 代 肝 细 胞 中 加 入 EF 的 标 准 品,使 其 终浓 度 为 50μ g/ mL,37 ℃ 摇 床 振 荡,分 别 孵 育 0,15、
30,45,60,90 min ;另 取 细 胞 与 浓 度 为 5,10,20,50、
100μ g/ mL 的 EF 共 孵 育 45 min。 每 点 设 5 个 平 行样,按 114 中 所 述 方 法 制 样,测 得 孵 育 后 EF 和 CF
第 6 期 王 翔 凌 等,大 口 黑 鲈 肝 细 胞 中 恩 诺 沙 星 的 消 除 及 其 代 谢 酶 活 性 的 测 定 1005
的 峰 面 积,每 个 时 间 点 设 5 个 平 行 样,按 114 中 所 述方 法 制 样,进 行 HPLC 检 测,根 据 标 准 曲 线 计 算 EF
和 CF 浓 度 。 Lowry 法 [11 ]测 定 细 胞 中 蛋 白 含 量,则
EF 脱 乙 基 酶 的 活 性 以 酶 促 反 应 速 率,即 每 mg 蛋 白单 位 时 间 内 的 CF 生 成 量 [μ g/ (min· mg) ]表 示 。
117 数 据 处 理数 据 处 理 中 利 用 SPSS(1115)进 行 显 著 性 分 析,
采 用 one2way ANOVA (单 因 素 方 差 分 析 ) 中 的 Dun2
can 检 验 进 行 多 重 比 较,当 P < 0105 时 认 为 差 异 显著 。 消 除 方 程 采 用 Ci = C0e - k t公 式 经 非 线 性 过 程处 理,Ci表 示 药 物 浓 度,C0表 示 初 始 浓 度,k 表 示 消除 速 率 常 数 。 药 酶 反 应 动 态 图 采 用 Excel 软 件 绘制 ;参 照 林 茂 等 [12 ]所 采 用 的 Lineweaver2Burk 方 程式 作 图 反 映 药 酶 动 力 学,并 计 算 酶 动 力 学 参 数,其 公式 为,
1
V =
Km
V max ×
1
[ S ] +
1
V max,Clint =
V max
Km
其 中 Km 为 米 氏 常 数,V max为 最 大 反 应 速 率,
Clint为 内 在 清 除 率 。
2 结 果 与 分 析
211 色 谱 条 件 的 确 定优 化 流 动 相 组 成,p H 和 流 速 等 条 件 后,EF 和
CF 药 物 峰 峰 形 较 好 且 能 完 全 分 离,并 且 与 杂 质 峰 完全 分 开 。 CF 保 留 时 间 在 4191 min 左 右,EF 保 留 时间 在 6173 min 左 右,空 白 样 品 提 取 液 在 上 述 保 留 时间 无 干 扰 峰 出 现 (图 2) 。
图 2 恩 诺 沙 星 ( EF)及 环 丙 沙 星 (CF)在 大 口 黑 鲈 肝 细 胞 中 的 色 谱 图
A,空 白 细 胞 提 取 液 ;B,含 EF 10μ g/ mL 的 细 胞 提 取 液 ;C,EF 与 细 胞 孵 育 45 min
Fig12 HPLC chromatogram for EF and CF in Micropterus sal moides hepatocytes
A,HPLC chromatogram from cells free of EF and CF ;B,HPLC chromatogram of EF (10μ g/ mL) extracted from cell ;C,HPLC chromatogram of
EF incubated with cell for 45 minutes.
212 定 量 方 法
21211 标 准 曲 线 及 线 性 范 围 标 准 曲 线 的 药 物 浓度 线 性 范 围,回 归 方 程 及 相 关 系 数 如 下 ( A i 表 示 药物 与 内 标 峰 面 积 比,Ci 表 示 药 物 标 准 品 在 空 白 细 胞中 的 浓 度 ),EF 0102～ 200μ g/ mL,A i = 140113 Ci -
57148,R = 01999 9 ; CF 0102～ 200μ g/ mL,A i =
95178 Ci - 93115,R = 01999 8。
21212 最 低 检 测 限 ( LOD) 经 测 得 EF 在 细 胞 中的 LOD 为 0105μ g/ mL,CF 在 细 胞 中 的 LOD 为
0102μ g/ mL 。
21213 回 收 率 和 变 异 系 数 按 114 制 样 方 法 操 作后,由 表 1 可 见 。 测 得 各 样 品 中 平 均 回 收 率 均 大 于
(80128 ± 4144) %,测 得 的 日 内 变 异 系 数 不 大 于
5113 %,日 间 变 异 系 数 不 大 于 5154 %。 所 得 数 据 表明 此 方 法 的 重 现 性 好,精 密 度 高 。
表 1 空 白 细 胞 中 添 加 EF和 CF时 回 收 率 及 变 异 系 数
Tab11 Recoveries and CV of EF and CF to Micropterus salmoides Hepatocytes n = 5 ; X ± SD ; %
质 量 浓 度
(μ g· mL - 1)
EF CF
回 收 率
Recovery rate
变 异 系 数 CV
日 内
Intra2day
日 间
Inter2day
回 收 率
Recovery rate
变 异 系 数 CV
日 内
Intra2day
日 间
Inter2day
0102 82170 ± 4144 4107 5137 80128 ± 4144 5113 5154
20 83119 ± 4137 3144 5125 85188 ± 4166 4134 5143
200 91154 ± 4124 3111 4163 90173 ± 3160 3127 3197
1006 中 国 水 产 科 学 第 14 卷
213 恩 诺 沙 星 体 外 温 孵 的 结 果
21311 恩 诺 沙 星 在 大 口 黑 鲈 肝 细 胞 中 的 消 除 EF
与 大 口 黑 鲈 原 代 肝 细 胞 孵 育 一 定 时 间 后,( CEF) 和
( CCF)的 量 随 孵 育 时 间 的 变 化 情 况 即 药 时 曲 线 如 图
3,可 知 EF 的 量 随 孵 育 时 间 的 延 长 在 由 快 到 慢 的 降低,而 CF 的 生 成 量 则 是 在 由 快 到 慢 的 升 高,到
90 min时 二 者 几 乎 趋 于 平 稳 状 态,但 二 者 在 大 口 黑鲈 肝 细 胞 中 的 变 化 均 为 非 线 性,曲 线 拟 合 得 消 除 方程 为 C = 50e - 01000 8 t,相 关 指 数 ( R2) 为 0171,消 除速 率 常 数 ( K) 为 8 × 10 - 4/ h,消 除 半 衰 期 ( T1/ 2) 为
86163 h。
图 3 大 口 黑 鲈 肝 细 胞 中 EF 代 谢 的 药 时 曲 线 ( n = 5,X
± SD)
Fig13 Concentration of EF time curve in Micropterus
sal moides hepatocytes( n = 5,X ± SD)
21312 孵 育 时 间 对 恩 诺 沙 星 脱 乙 基 酶 活 的 影 响
底 物 EF 与 大 口 黑 鲈 原 代 肝 细 胞 孵 育 后,其 代 谢 该药 物 的 酶 EF 脱 乙 基 酶 的 活 性 随 孵 育 时 间 的 变 化 如图 4 所 示 。
可 看 出 虽 然 随 着 孵 育 时 间 的 延 长,CF 的 生 成 量在 升 高,但 升 高 的 速 度 却 在 变 小,因 此 由 酶 活 性 公 式可 知 其 酶 活 却 在 降 低,尤 其 在 45 min 后 下 降 较 明显 。 通 过 显 著 性 比 较 分 析 可 看 出 当 孵 育 时 间 为
45 min时,其 酶 活 性 最 高 为 0125μ g/ ( min· mg) 。 因此 可 知 在 该 条 件 下 底 物 与 细 胞 孵 育 的 最 佳 时 间 为
45 min。
21313 恩 诺 沙 星 在 大 口 黑 鲈 肝 细 胞 中 的 酶 动 力 学
EF 与 大 口 黑 鲈 原 代 肝 细 胞 孵 育 45 min 后,通 过
HPLC 法 检 测 EF 剩 余 浓 度 (Ct)和 CF 生 成 量 (C n),
根 据 Linewaver2Burk 作 图,其 酶 促 反 应 动 力 学 方 程为,1/ V = 78135 × 1/ [ S ] + 31501 7 ( R2 = 019211),
如 图 5。 根 据 方 程 计 算 酶 动 力 学 参 数,其 最 大 反 应速 率 V max为 0129μ g/ ( min· mg),米 氏 常 数 Km 为
22137μ g/ mL,内 在 清 除 率 Clint为 0101 mL/ ( min·
mg) 。
图 4 大 口 黑 鲈 肝 细 胞 中 EF - N - 脱 乙 基 酶 的 酶 活 与 CF
浓 度 曲 线 ( n = 5,X ± SD)
Fig14 The curve for EF - N - deethylase activity and CF
concentration in Micropterus sal moides hepatocytes
( n = 5,X ± SD)
图 5 大 口 黑 鲈 肝 细 胞 中 EF 脱 乙 基 酶 的 lineweaver2Burk
作 图 ( n = 5,X ± SD)
Fig15 The lineweaver2Burk plot for EF deethylase activity in
Micropterus salmoides hepatocytes( n = 5,X ± SD)
3 讨 论
311 色 谱 条 件 的 优 化在 色 谱 条 件 的 确 定 中,流 动 相 的 组 成 曾 尝 试 选 用过 甲 醇,但 是 基 线 不 易 平 稳,并 且 柱 压 较 高,不 利 于 测样 。 通 过 对 EF 标 准 液 在 HPLC上 进 行 波 谱 扫 描 发 现其 最 大 吸 收 波 长 为 276 nm,因 此 本 实 验 条 件 下 选 定
276 nm 做 为 紫 外 检 测 波 长 。 在 流 动 相 的 配 比 中 也 做第 6 期 王 翔 凌 等,大 口 黑 鲈 肝 细 胞 中 恩 诺 沙 星 的 消 除 及 其 代 谢 酶 活 性 的 测 定 1007
了 不 少 的 尝 试,直 至 两 峰 得 到 良 好 分 离 。 由 于 EF 是两 性 物 质,在 流 动 相 中 易 解 离,对 组 份 的 保 留 时 间 和峰 形 都 会 造 成 不 良 影 响,在 流 动 相 中 加 入 四 丁 基 溴 化铵,用 以 消 除 色 谱 柱 中 十 八 烷 基 键 合 硅 胶 的 硅 羟 基 对
EF 碱 性 基 团 的 吸 附 作 用,同 时 将 流 动 相 pH 调 至 310
左 右,以 抑 制 药 物 解 离 或 改 变 峰 形 。
312 研 究 体 系 的 选 择 及 药 物 的 分 离 提 取 及 检 测药 物 体 外 代 谢 的 研 究 中 反 应 体 系 的 选 择 是 影 响结 果 准 确 性 的 首 要 因 素,目 前 为 止,主 要 用 到 的 有 亚细 胞 结 构,cDNA 表 达 的 P450 酶 以 及 肝 细 胞 和 肝 切片 等,但 经 过 与 文 献 [ 13 - 14 ]比 较 发 现,由 于 肝 细 胞技 术 的 发 展,使 用 完 整 的 细 胞 进 行 研 究 能 够 更 加 符合 药 物 在 体 内 的 代 谢 情 况,从 而 更 加 准 确 地 推 测 药物 在 体 内 的 实 际 代 谢,也 使 得 肝 细 胞 在 体 外 代 谢 方面 有 了 一 定 的 应 用 。 因 此 本 实 验 中 选 用 的 是 的 优 于鱼 的 肝 微 粒 体 等 亚 细 胞 结 构 或 其 他 反 应 体 系 的 的 肝细 胞 来 研 究 药 物 代 谢,更 能 反 应 真 实 情 况 。
实 验 过 程 中 曾 用 甲 醇,乙 腈 或 三 氯 醋 酸 直 接 提取,回 收 率 均 不 够 理 想 且 杂 质 较 多 。 本 实 验 最 终 采用 了 二 氯 甲 烷 作 为 萃 取 剂,去 除 细 胞 中 蛋 白 的 效 果较 好 且 回 收 率,变 异 系 数 等 均 能 符 合 要 求,且 二 氯 甲烷 沸 点 较 低 (40 ℃ ),极 易 吹 干,因 此 二 氯 甲 烷 是 较理 想 的 萃 取 剂 。 另 外 在 样 品 吹 干 后,将 其 浓 缩 2 倍,
以 降 低 药 物 在 细 胞 中 的 最 低 检 测 限 。
313 恩 诺 沙 星 在 大 口 黑 鲈 肝 细 胞 中 的 代 谢
EF 与 大 口 黑 鲈 肝 细 胞 温 孵 后,从 HPLC 图 上可 见 EF 被 迅 速 代 谢 形 成 代 谢 物 CF,随 着 时 间 的 延长,EF 在 大 口 黑 鲈 肝 细 胞 中 呈 非 线 性 消 除,与 此 同时 其 脱 乙 基 代 谢 物 CF 呈 非 线 性 增 加,当 给 药 后
90 min时,CF 几 乎 处 于 饱 和 状 态 。 Intorre 等 [3 ]研究 了 EF 在 黑 鲈 体 内 代 谢 及 消 除 情 况,发 现 在 体 内的 代 谢 产 物 同 样 为 CF,说 明 代 谢 该 药 物 的 P450 酶活 性 在 体 内 外 存 在 一 致 性 。 另 外,体 内 研 究 发 现 代谢 产 物 CF 主 要 出 现 在 肝 脏 中,其 次 是 血 浆 中,而 皮肤 和 肌 肉 很 少 出 现,说 明 该 代 谢 酶 主 要 存 在 于 肝 脏中,因 此 选 取 该 酶 含 量 较 高 的 肝 细 胞 作 为 体 外 实 验材 料,具 有 一 定 的 可 操 作 性 。 EF 在 体 外 的 消 除 半 衰期 为 86163 h,而 在 体 内 的 消 除 半 衰 期 为 25 h,体 内消 除 速 率 常 数 为 0103/ h,体 外 消 除 速 率 常 数 为 8 ×
10 - 4/ h,体 内 外 药 物 的 消 除 速 度 存 在 着 一 定 的 差别,差 别 的 存 在 是 由 于 多 种 因 素 造 成 的,如 体 内 外 环境 的 差 异,体 内 给 药 的 剂 量 以 及 体 外 药 物 与 细 胞 孵育 时 的 浓 度 等,因 此 关 于 体 内 外 药 物 代 谢 的 相 关 性尚 需 大 量 的 实 验 来 验 证 或 推 断,以 使 体 外 实 验 更 具有 实 际 意 义 。 体 外 研 究 方 法 便 于 控 制,操 作 简 便,代谢 体 系 较 纯 净,易 于 对 代 谢 产 物 进 行 分 离 提 取,可 以在 较 短 的 时 间 内 得 到 较 为 明 确 的 结 果,适 用 于 非 常重 要 的 Ⅰ 相 代 谢 产 物 的 研 究,能 够 为 药 物 的 结 构 改造 及 临 床 给 药 [15 ]提 供 依 据 。
314 EF在 细 胞 中 的 代 谢 及 其 基 础 酶 活 模 型本 试 验 中,选 用 鱼 类 常 用 抗 菌 药 EF 来 研 究 其代 谢 活 性,不 仅 为 该 药 在 细 胞 内 的 代 谢 提 供 了 一 定的 价 值,而 且 通 过 测 定 细 胞 中 蛋 白 含 量 后,用 EF 的代 谢 产 物 CF 的 产 量 来 反 映 酶 活 性 的 方 法 简 单 易行,是 测 定 P450 酶 活 性 所 常 用 的 方 法 。 关 于 P450
酶 的 活 性 的 诱 导 和 抑 制 已 引 起 医 药 界 的 关 注 [15 ],建立 一 种 高 效 而 简 便 的 酶 活 性 检 测 方 法 尤 为 重 要 。
EF 与 大 口 黑 鲈 在 37 ℃ 下 振 荡,孵 育 时 间 为
45 min,其 酶 活 最 高,因 此 在 该 条 件 下 可 选 定 最 佳 孵育 时 间 为 45 min。 通 过 对 酶 动 力 学 的 研 究 发 现
Vmax 为 0129μ g/ ( min· mg),内 在 清 除 率 Clint 为
0101 mL/ (min· mg),说 明 该 酶 在 大 口 黑 鲈 肝 细 胞 中的 基 础 酶 活 一 般,由 于 药 物 间 代 谢 的 相 互 作 用 是 影 响药 物 在 体 内 浓 度 水 平 的 一 个 重 要 因 素 [16 ],因 此 关 于对 该 酶 的 诱 导 和 抑 制 的 作 用 有 待 于 进 一 步 的 研 究 。
有 研 究 初 步 证 实 EF 脱 乙 基 酶 属 于 CYP3A 亚家 族 [17 ],该 家 族 的 P450 酶 不 仅 可 代 谢 一 些 内 源 性激 素 (如 氢 化 考 的 松,雌 激 素 等 ) 和 某 些 饮 食 中 的 有害 污 染 物,还 参 与 了 许 多 环 境 致 癌 剂 以 及 包 括 多 种常 用 化 疗 药 物 在 内 的 人 体 中 50 %以 上 的 药 物 代谢 [18 - 19 ],因 此 通 过 对 EF 脱 乙 基 酶 的 基 础 酶 活 模 型的 研 究 能 够 为 该 代 谢 酶 所 属 的 P450 家 族 或 亚 家 族作 为 环 境 毒 理 学 的 生 物 标 志 物 和 水 域 环 境 的 指 示 剂的 研 究 提 供 一 定 的 理 论 基 础 ;另 外 通 过 该 药 在 细 胞中 代 谢 的 研 究 能 够 了 解 该 药 在 水 产 动 物 体 内 作 用 机理 与 消 除 规 律,进 而 对 该 药 的 残 留 监 控 有 一 定 的 指导 意 义 。
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Elimination of enrofloxacin and detection of metabolic enzyme activity in Mi2
cropterus salmoides hepatocytes
WAN G Xiang2ling1,YAN G Xian2le1,2,L IN Mao3,YU Wen2juan1,ZHAN G Ning1,ZHAN G Shu2jun1
(11Aquatic Pathogen Collection Center of Ministry of Agriculture,Shanghai Fisheries University,Shanghai 200090,China ; 21E2In2
stitute of Shanghai Municipal Education Commission,Shanghai 200090,China ; 31Fisheries College,Jimei University,Xiamen
361021,China)
Abstract,In order to study the metabolism of enrofloxacin ( EF) and reflect the EF deethylase activity,En2
rofloxacin ( EF) and ciprofloxacin (CF) in M icropterus sal moi des hepatocytes were detected by reversed2
phase high performance liquid chromatography ( RP2HPLC),The medicine was extracted by dichloro2
methane from cell and the cell was degreased by hexane,The mean recovery rates were higher than 80128 %
and inter2day CV were all lower than 5154 % for all samples,When EF was incubated with M icropterus
sal moi des hepatocytes,the elimination equations for EF was C = 50e - 01000 8 t,elimination half life ( T1/ 2) and
elimination rate constant ( K) were 86163 h and 8 × 10 - 4/ h respectively,The best incubation time was 45 min
and the highest enzyme activity was 0125μ g/ (min· mg) at that time,Enzymatic parameters of maximum rate
( V max ) was 0129μ g/ (min· mg),the michaelis constant ( Km) and internal clearance rate( Clint) were 22137μ g/
mL and 0101 mL/ (min· mg),respectively,The results showed that the affinity between EF and EF deethy2
lase enzyme in M icropterus sal moi des hepatocytes and the intensity for enzymatic reaction were very low.
In additional,the metabolism for EF i n vit ro was slow,[Journal of Fishery Sciences of China,2007,14 (6),
1 004 - 1 009 ]
Key words,M icropterus sal moi des ;hepatocytes ;enrofloxacin ;RP2HPLC ;elimination ;enzyme activity
Corresponding author,YAN G Xian2le,E2mail,xlyang @shfu,edu,cn
第 6 期 王 翔 凌 等,大 口 黑 鲈 肝 细 胞 中 恩 诺 沙 星 的 消 除 及 其 代 谢 酶 活 性 的 测 定 1009
