第 4卷 第 5期
2 0 0 8年 1 0月南 方 水 产
South China Fisheries Science
Vol14,No15
Oct1,2008
收 稿 日 期,2008202222; 修 回 日 期,2008207229
资 助 项 目,江 苏 省 省 级 海 洋 渔 业 开 发 项 目 (2007) ; 江 苏 省 水 产 三 项 工 程 项 目 ( PJ2005251)
作 者 简 介,黄 鸿 兵 (1979 - ),男,研 究 实 习 员,从 事 水 产 品 加 工 与 质 量 安 全 研 究,E2mail,nanjingrice@ yahoo1com1cn
通 讯 作 者,吴 光 红,E2mail,wuguangh@ jlonline1com
恩 诺 沙 星 与 中 华 绒 螯 蟹 血 浆 蛋 白 结 合 率 的 研 究黄 鸿 兵 1,吴 光 红 1,张 静 波 2,陈 颐 3
(11江 苏 省 淡 水 水 产 研 究 所,江 苏 南 京 210017; 21南 京 农 业 大 学 农 业 部 农 畜 产 品 加 工 与 质 量 控 制 重 点 开 放 实 验 室,
江 苏 南 京 210095; 31盐 城 市 产 品 质 量 监 督 检 验 所,江 苏 盐 城 224005)
摘 要,为 探 索 养 殖 过 程 中 恩 诺 沙 星 ( Enrofloxacin,ENR) 施 用 于 中 华 绒 螯 蟹 ( E riocheir sinensis) 中 的 药 效 情 况,
文 章 通 过 静 置 平 衡 透 析 法 分 析 研 究 了 恩 诺 沙 星 与 中 华 绒 螯 蟹 血 浆 的 蛋 白 结 合 率 。 试 验 测 得 的 中 华 绒 螯 蟹 血 浆 蛋白 浓 度 为 63195 ± 0129 mg· mL - 1,蛋 白 分 子 量 主 要 集 中 在 6612～ 9711 kDa之 间,恩 诺 沙 星 与 中 华 绒 螯 蟹 血 浆 蛋白 的 结 合 率 在 47139% ～ 82158%之 间 。 分 析 结 果 认 为,恩 诺 沙 星 与 中 华 绒 螯 蟹 血 浆 50%以 上 的 蛋 白 结 合 率,在中 华 绒 螯 蟹 养 殖 生 产 过 程 中 需 要 慎 重 考 虑 恩 诺 沙 星 的 有 效 药 物 浓 度 及 其 与 其 它 药 物 的 竞 争 作 用,以 能 充 分 发 挥恩 诺 沙 星 的 作 用 。
关 键 词,恩 诺 沙 星 ; 中 华 绒 螯 蟹 ; 血 浆 ; 蛋 白 结 合 率中 图 分 类 号,S948 文 献 标 识 码,A 文 章 编 号,1673 - 2227 - (2008) 05 - 0023 - 05
Study on binding capacity of Enrofloxacin ( ENR) with blood plasma
protein of Chinese m itten2handed crab,E riocheir sinensis
HUANG Hongbing1,WU Guanghong1,ZHANG J ingbo2,CHEN Yi3
(11 Freshw ater F isheries R esearch Institute of J iangsu Province,N anjing 210017,China; 21 Key L ab1 of A griculture
and A nim al P roducts P rocessing and Q uality Control,M inistry of A griculture,N anjing A gricultural U niversity,
N anjing 210095,China; 31 Yancheng Institute of Supervision & Testing on P roduct Q uality,Yancheng 224005,China)
Abstract,The binding capacity of the drug enrofloxacin with the p lasma p rotein of Chinese m itten2handed crab,Eriocheir sinensis dur2
ing feeding was investigated1 The method of fixed equilibrium dialysis test was app lied to the study on the binding of enrofloxacin with
the crab blood p lasma p rotein1 Concentration of the p lasma p roteins in Chinese m itten2handed crab was 63195 ± 0129 mg· mL - 1 1 Mo2
lecular weight of these p roteins were mainly between 6612～ 9711 kDa1 Protein binding level of enrofloxacin and crab p lasma p roteins
was 47139% ～ 82158%,showing thatmore than 50% of the drug could be bound to the p roteins1 Thus,it could be concluded that en2
rofloxacin can bind with p lasma p roteins tightly1 So,in case of using enrofloxacin alone or with other medicine,its effective concentra2
tion and competition between drugs should be considered in Chinese m itten2handed crab culture1
Key words,Enrofloxacin; Chinese m itten2handed crab; Eriocheir sinensis; p lasma; p rotein binding
大 多 数 药 物 在 体 内 的 药 理 作 用 是 药 物 与 特 异 受体 作 用 的 结 果 。 药 物 吸 收 入 血 后 会 不 同 程 度 地 与 血浆 蛋 白 结 合,按 其 与 血 浆 蛋 白 结 合 与 否 分 为 结 合 型和 游 离 型 。 这 是 一 个 迅 速,可 逆 的 过 程,很 快 达 到
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南 方 水 产
第 4卷动 态 平 衡 [ 1 ],游 离 药 物 +血 浆 蛋 白 W药 物 2血 浆 蛋白 结 合 物 。 因 而,药 物 与 血 浆 蛋 白 的 结 合 率 是 影 响药 效 的 重 要 因 素 之 一 [ 2 ]。
喹 诺 酮 类 药 物 是 一 类 广 谱,高 效,低 毒 的 抗 菌药,具 有 良 好 的 药 物 动 力 学 特 性 。 恩 诺 沙 星 对 革 兰氏 阳 性 菌 及 阴 性 菌 引 起 的 细 菌 感 染 均 有 较 强 的 抑 杀作 用 。 主 要 用 于 预 防 和 治 疗 由 嗜 水 气 单 胞 菌 A ero2
m onas hydrophila,温 和 气 单 胞 菌 A1sobria,鳗 弧 菌
V ibrio anguillarum,假 单 胞 菌 Pseudom onas sp1等 引起 的 中 华 绒 螯 蟹 病 害 黑 鳃 病,烂 肢 病,蟹 奴 病,颤抖 病 等 疾 病 [ 3 ]。 目 前,国 内 外 学 者 已 大 量 开 展 了药 物 与 血 浆 蛋 白 的 结 合 分 析,他 们 广 泛 分 析 了 药 物与 血 浆 蛋 白 的 结 合 率,结 合 常 数,血 浆 蛋 白 与 药 物结 合 位 点 数,结 合 反 应 热 力 学 函 数 及 模 型 等 [ 4 - 5 ]。
这 些 研 究 为 新 药 开 发 和 应 用 提 供 了 有 力 的 理 论 和 技术 保 障 。 ZLOTOS等 [ 6 ]详 细 研 究 了 恩 诺 沙 星 ( En2
rofloxacin,ENR),环 丙 沙 星 等 18种 喹 诺 酮 类 药 物与 牛 血 清 蛋 白,人 血 清 蛋 白,人 血 浆 的 蛋 白 结 合率 。 学 者 们 还 对 恩 诺 沙 星 [ 7 ],氧 氟 沙 星 [ 8 ],左 氟沙 星 [ 9 ],洛 美 沙 星 [ 10 ],普 利 沙 星 [ 11 ],依 诺 沙星 [ 12 ]等 喹 诺 酮 类 药 物 与 蛋 白 的 相 互 作 用 进 行 了 详细 的 光 谱 分 析 研 究 。 贾 丽 华 等 [ 13 ]研 究 了 恩 诺 沙 星与 牛 血 清 白 蛋 白 的 相 互 作 用,得 到 两 者 的 结 合 常 数为 4116 × 105 L· mol- 1,以 其 摩 尔 比 1z 1结 合 。
恩 诺 沙 星 与 中 华 绒 螯 蟹 (Chinese m itten2hand2
ed crab,E riocheir sinensis) 血 浆 蛋 白 的 相 互 作 用 及结 合 率 研 究 还 未 见 报 道,此 文 则 通 过 静 置 平 衡 透 析法 研 究 了 恩 诺 沙 星 与 中 华 绒 螯 蟹 血 浆 蛋 白 的 结 合率,旨 在 为 恩 诺 沙 星 在 中 华 绒 螯 蟹 养 殖 生 产 过 程 中提 供 用 药 指 导 。
1 材 料 与 方 法
111 实 验 试 剂 及 设 备恩 诺 沙 星 标 准 品 ( > 9917%,美 国 Sigma公 司出 品 ) ; 甲 醇 (色 谱 纯,德 国 R iedel Haen公 司 出品 ) ; 乙 腈,磷 酸,三 乙 胺 (色 谱 纯,美 国 TED IA
公 司 出 品 ) ; 流 动 相 用 水 (1812 MΩ )。
高 速 冷 冻 离 心 机 (美 国 贝 克 曼 公 司 出 品 ) ; W a2
ters2695高 效 液 相 色 谱 仪 (美 国 W ater公 司 出 品 ) ;
超 纯 水 仪 (美 国 M illipole公 司 出 品 ) ; 透 析 袋 (进 口分 装,膜 分 子 量 13 000 kDa,直 径 21 mm )。
112 样 品 制 备恩 诺 沙 星 溶 液 配 制 。 恩 诺 沙 星 用 Tris2HCl缓 冲液 (0105 mol· L - 1,pH 714,内 含 0115 mol· L - 1
NaCl) 配 制 成 50010μ g· mL - 1的 标 准 品 储 备 液,使用 按 需 要 浓 度 稀 释 。
中 华 绒 螯 蟹 血 浆 制 取 。 中 华 绒 螯 蟹 从 当 地 农 贸市 场 购 买,体 重 200 g左 右,健 康 无 疾 病,从 河 蟹背 部 心 区 开 一 小 孔,用 注 射 器 抽 取 血 淋 巴,每 只 蟹
015 mL,混 合 后 移 入 装 有 015 mL ACD 抗 凝 剂 的
eppendorf管 中,离 心 后 得 河 蟹 血 浆 。
ACD抗 凝 剂 配 方 为 柠 檬 酸 三 钠 1132 g,柠 檬酸 0144 g,无 水 葡 萄 糖 1147 g,溶 解 70～ 80 mL蒸馏 水 中,再 加 入 011～ 012 g活 性 碳,静 置 10 m in
后 过 滤 即 得 。
113 恩 诺 沙 星 浓 度 测 定药 物 浓 度 测 定 [ 14 ]。 吸 取 015 mL样 品 于 10 mL
离 心 管 中,加 入 5 mL乙 腈,旋 涡 混 合 2 m in,5 000
r· m in- 1离 心 10 m in,将 上 清 液 转 移 至 旋 转 蒸 发 瓶中 。 往 残 渣 中 加 入 5 mL乙 腈,重 复 上 述 操 作 。 旋转 蒸 发 后,准 确 加 入 1 mL流 动 相 溶 解 残 留 物,过
0122μ m滤 膜,待 测 。
色 谱 条 件 [ 14 ]。 色 谱 柱 为 Zorbax SB 2C18分 析 柱
(250 mm × 416 mm i1d1,5μ m ) ; 流 动 相 为 0105
mol· L - 1磷 酸 溶 液 (以 三 乙 胺 调 pH至 214) /乙 腈
= 86 /14 (V /V ) ; 检 测 为 荧 光 检 测 器 ; 激 发 波 长
280 nm,发 射 波 长 455 nm; 柱 温 40℃ ; 进 样 量 20
μ L; 流 速 1 mL· m in- 1。
标 准 曲 线 的 绘 制 为 准 确 配 制 5,1,015,011、
0105和 0101μ g· mL - 1的 ENR标 准 品 工 作 液 。 以 标样 浓 度 为 横 坐 标,HPLC测 得 相 应 的 峰 面 积 为 纵 坐标,绘 制 标 准 曲 线 。
回 收 率,精 密 度 和 检 测 限 的 测 定 为 分 别 向 210
mL空 白 样 本 中 加 入 浓 度 为 012μ g· mL - 1 ENR标 准液 011,012,015 mL,添 加 水 平 分 别 为 10,20、
50μ g· mL - 1 ( n = 6),旋 涡 混 匀,放 置 15 m in,然后 再 进 行 前 处 理 及 高 效 液 相 色 谱 分 析,计 算 回 收 率和 精 密 度 。 根 据 国 际 纯 粹 与 应 用 化 学 联 合 会 ( IU2
PAC) 的 定 义,此 法 的 检 测 限 定 义 为 产 生 相 应 于 3
倍 背 景 噪 音 的 标 准 偏 差 分 析 信 号 的 浓 度 值 [ 15 ]。
114 蛋 白 结 合 率 透 析 实 验采 用 平 衡 透 析 法 [ 16 ]。 将 药 物 加 至 Tris2HCl缓
第 5期
黄 鸿 兵 等,恩 诺 沙 星 与 中 华 绒 螯 蟹 血 浆 蛋 白 结 合 率 的 研 究
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冲 液 (0105 mol· L - 1,pH 714,内 含 0115 mol· L - 1
NaCl) 中,浓 度 分 别 为 012,014,110,510μ g·
mL - 1。 透 析 袋 中 装 河 蟹 新 鲜 血 浆 210 mL,袋 口 扎紧,保 证 不 漏,放 入 30 mL 广 口 玻 瓶 中,每 瓶 加
10 mL不 同 浓 度 药 物 的 缓 冲 液 。 透 析 于 4℃ 冷 柜 中进 行 ; 空 白 处 理 为 透 析 袋 外 是 110μ g· mL - 1恩 诺 沙星 溶 液,透 析 袋 内 是 0105 mol· L - 1 Tris2HCl,0115
mol· L - 1 NaCl缓 冲 液,分 别 于 静 置 平 衡 透 析 48、
72,96 h时 取 透 析 袋 内 血 浆 样 品 015 mL和 透 析 袋外 缓 冲 溶 液 样 品 015 mL,测 定 其 中 的 药 物 浓 度,
确 定 是 否 达 到 平 衡 时 间 (平 衡 时 间 点 以 空 白 处 理组 透 析 袋 内 外 浓 度 相 等 确 定 ) 后,以 前 述 血 浆 处理 方 法 测 定 药 物 浓 度 。 根 据 以 下 公 式 计 算 血 浆 蛋 白结 合 率 。
血 浆 蛋 白 结 合 率 = (血 浆 药 物 浓 度 - 透 析 液 药物 浓 度 ) × 100% /血 浆 药 物 浓 度
115 中 华 绒 螯 蟹 血 淋 巴 电 泳 实 验取 中 华 绒 螯 蟹 血 浆,制 备 成 5,10,20倍 的 稀释 液 。 电 泳 方 法 参 考 汪 家 政 和 范 明 [ 17 ]的 方 法,采用 B io2Rad公 司 M ini2p rotean Ⅱ 电 泳 仪 ; 丙 烯 酰 胺在 浓 缩 胶 中 的 百 分 比 4%,分 离 胶 中 的 百 分 比
1215% ; 浓 缩 胶 聚 合 时 间 015 h,分 离 胶 聚 合 时 间
1 h; 浓 缩 胶 电 泳 电 压 120 V,时 间 30 m in; 分 离 胶电 泳 电 压 80 V,时 间 3 h 15 m in; 011%考 马 斯 亮蓝 R2250染 色,染 色 时 间 15 m in; 脱 色 过 夜,次 日拍 取 照 片 。
116 统 计 分 析此 试 验 每 个 参 数 做 3个 重 复 (中 华 绒 螯 蟹 血浆 混 合 后 重 复 做 3次 ),取 其 平 均 值,采 用 Excel
2003统 计 分 析 实 验 参 数,并 用 SAS 812进 行 单 因素 方 差 分 析 (One2W ay ANOVA)。
2 结 果 与 分 析
211 恩 诺 沙 星 标 准 曲 线,回 收 率,相 对 标 准 偏 差以 标 准 样 品 浓 度 为 X,以 HPLC测 得 相 应 的 峰面 积 为 Y,求 出 ENR的 回 归 方 程 是 Y = 1241254X +
01161,相 关 性 系 数 是 0199999。 结 果 表 明,ENR
在 0101～ 5μ g· mL - 1范 围 内 线 性 良 好,可 以 满 足 定量 分 析 的 需 要 。
添 加 ENR 10,20和 50μ g· g- 1时,回 收 率 为
85% [相 对 标 准 偏 差 ( RSD ) 为 7% ],86%
(RSD为 3% ),82% (RSD为 5% )。 据 定 义 得 出
ENR的 检 测 限 低 于 1 ng· g- 1。 方 法 的 准 确 度 和 精 密度 均 符 合 残 留 分 析 的 要 求 。
212 透 析 平 衡 时 间 确 定由 图 1可 得,4℃ 条 件 下,静 置 透 析 到 48 h后时,透 析 袋 袋 内 浓 度 为 透 析 袋 外 浓 度 的 105137%、
95185%和 101148%,各 时 间 测 得 的 平 衡 率 之 间 差异 不 显 著 ( P > 0105),能 较 好 体 现 透 析 袋 内 外 的浓 度 平 衡 。 所 以,蛋 白 结 合 率 实 验 部 分 取 样 时 间 主要 为 48,72,96 h。
图 1 不 同 透 析 时 间 下 恩 诺 沙 星 (110μ g· mL - 1 )
的 透 析 平 衡 程 度
Fig11 Equilibrium rate of enrofloxacin solution at
different dialysis time
213 恩 诺 沙 星 与 中 华 绒 螯 蟹 血 浆 蛋 白 结 合 率 的 研 究
表 1显 示 恩 诺 沙 星 与 中 华 绒 螯 蟹 血 浆 蛋 白 结 合率 分 布 在 47139% ～ 82158%之 间 。 透 析 时 间 48和
72 h时,结 合 率 随 着 恩 诺 沙 星 浓 度 的 增 大 有 减 小的 趋 势,但 在 透 析 96 h时,各 浓 度 间 差 异 不 明 显 。
恩 诺 沙 星 浓 度 012μ g· mL - 1,透 析 96 h时,结 合 率显 著 小 于 其 它 透 析 时 间 的 结 合 率 。 其 它 浓 度 条 件下,结 合 率 随 透 析 时 间 不 发 生 显 著 变 化 ( P >
0105)。
214 中 华 绒 螯 蟹 血 浆 蛋 白 组 分 的 研 究通 过 测 定 中 华 绒 螯 蟹 血 浆 在 280 nm处 的 紫 外光 密 度 可 计 算 得,试 验 中 中 华 绒 螯 蟹 血 浆 蛋 白 浓 度为 63195 ± 0129 mg· mL - 1。 从 电 泳 图 谱 (图 2) 可知,中 华 绒 螯 蟹 血 浆 蛋 白 的 分 子 量 主 要 集 中 在 6612
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南 方 水 产
第 4卷表 1 恩 诺 沙 星 与 中 华 绒 螯 蟹 血 浆 蛋 白 的 结 合 率
Tab11 B ind ing of ENR w ith pla sma prote in in E1sinensis
结 合 率 /%
p rotein bind data
透 析 袋 外 药 物 初 始 浓 度 /μ g· mL - 1 ( n = 3) concentration of drug outside dialysis bag
012 014 110 510
透 析 时 间
dialysis
time
48 h
83184 78155 651679 491222
83133 68117 591272 481974
80158 65170 541095 431971
平 均 值 ± 标 准 差 82158 ± 1175a 70181 ± 6182 59168 ± 5180 47139 ± 2196
72 h
82168 69126 571524 551981
84129 67176 521303 541295
80114 72143 591662
平 均 值 ± 标 准 差 82137 ± 2109a 69182 ± 2138 56150 ± 3179 55114 ± 5101
96 h
72141 67111 621742 571579
69167 59139 601765 521226
62122 61141 631939 491021
平 均 值 ± 标 准 差 68110 ± 3193b 62164 ± 1164 62148 ± 1159 52194 ± 2109
注,表 格 中 字 母 相 同 表 示 同 一 浓 度,不 同 时 间 之 间 差 异 不 显 著,显 著 性 水 平 P > 0105
Note,Same superscrip t letters mean no difference in the same row,otherwise,significant difference,P > 01051
～ 9711 kDa之 间,在 5倍 稀 释 泳 道 中 可 以 看 到 在上 述 分 子 量 范 围 以 外 的 其 它 蛋 白,从 最 小 的 10
kDa左 右 到 最 大 100 kDa左 右 不 等 。 10和 20倍 稀释 液 电 泳 后,泳 道 中 仅 能 看 到 2条 分 子 量 6612～
9711 kDa之 间 的 蛋 白,其 它 蛋 白 则 由 于 浓 度 过 稀而 观 察 不 到 。
3 讨 论
(1) 血 浆 中 与 药 物 结 合 的 主 要 是 血 清 白 蛋 白
(分 子 量 66 000 kDa左 右 ) [ 1,18 ]。 中 华 绒 螯 蟹 血 浆蛋 白 分 子 量 主 要 在 6612～ 9711 kDa之 间 。 试 验 中采 用 的 透 析 膜 (截 留 分 子 量 13 kDa) 能 达 到 阻 止蛋 白 进 出,保 证 恩 诺 沙 星 (分 子 量 35914 g· mol- 1 )
和 水 在 透 析 袋 内 外 的 自 由 迁 移 。
(2) 平 衡 透 析 法 是 结 合 率 分 析 的 传 统 方 法,
比 较 可 靠 和 经 济 实 用 。 ZLOTOS等 [ 6 ]研 究 发 现 药 物
/蛋 白 物 质 的 量 浓 度 比 例 0101条 件 下,恩 诺 沙 星 与人 血 清 蛋 白 ( HSA ) 结 合 率 为 ( 3416 ± 516 ) %
(连 续 超 滤 法 ) 和 ( 40 ± 2) % (不 连 续 超 滤 法 )。
KAARTINEN等 [ 19 ]研 究 发 现 恩 诺 沙 星 与 奶 山 羊 血 浆蛋 白 的 结 合 率 为 36% ～ 45% (体 外 实 验 )。 此 试 验得 到 的 结 合 率 结 果 高 于 文 献 中 蛋 白 结 合 率 的 主 要 原因,① 血 清 蛋 白 的 活 性 。 OLSEN等 [ 20 ]研 究 发 现 血清 蛋 白 结 合 稳 定 剂 后 与 药 物 的 蛋 白 结 合 率 大 幅 提图 2 中 华 绒 螯 蟹 血 浆 蛋 白 电 泳 图 谱
11标 准 蛋 白 ; 2110倍 稀 释 血 浆 ; 3120倍 稀 释 血 浆 ; 4～ 515倍 稀 释 血 浆
Fig12 Electrophoretic figure of p lasma p rotein in E1sinensis
11standard p roteins; 21p lasma ( × 10) ; 31p lasma ( × 20) ;
4～ 51p lasma ( × 5) 1
高 。 ② 药 物 浓 度 与 蛋 白 浓 度 的 比 例 。 此 试 验 所 用 的药 物 /蛋 白 物 质 的 量 比 例 约 在 01002～ 0105之 间,
符 合 实 际 生 产 中 的 用 药 情 况,在 该 浓 度 下,血 浆 蛋白 质 只 有 一 个 位 点 会 与 药 物 发 生 结 合 作 用 。 试 验 中的 结 合 率 数 据 主 要 分 布 在 47139% ～ 70181%,而出 现 的 82158%和 82137% 2个 高 数 值,可 能 是 因
第 5期
黄 鸿 兵 等,恩 诺 沙 星 与 中 华 绒 螯 蟹 血 浆 蛋 白 结 合 率 的 研 究
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为 药 物 数 量 偏 少,蛋 白 充 分 结 合 的 结 果 ; 随 着 取 样次 数 的 增 多,蛋 白 数 量 减 少 要 多 于 药 物 数 量,结 合率 趋 于 稳 定 。 ③ 结 合 率 测 定 方 法 上 的 差 异 。 更 快 捷的 连 续 超 滤 法,表 面 响 应 传 感 器 等 方 法 与 此 试 验 所得 的 结 合 率 结 果 有 一 定 的 一 致 性,结 果 差 异 来 自 仪器,透 析 膜 对 药 物 的 吸 附 等 多 方 面 。
(3) 已 有 一 些 恩 诺 沙 星 在 中 华 绒 螯 蟹 体 内 的药 物 动 力 学 研 究 见 于 报 道 [ 14 ]。 此 试 验 针 对 恩 诺 沙星 与 中 华 绒 螯 蟹 血 浆 蛋 白 结 合 率 开 展 的 研 究 发 现,
结 合 率 主 要 在 47139% ～ 82158%之 间,试 验 要 高于 恩 诺 沙 星 与 其 它 畜 禽 类 血 浆 蛋 白 的 结 合 率 20%
～ 50%。 恩 诺 沙 星 与 犬 血 浆 蛋 白 的 结 合 率 仅 有
27%左 右 [ 21 ]。 原 因 可 能 是,① 中 华 绒 螯 蟹 血 浆 中蛋 白 浓 度 较 高,蛋 白 种 类 比 较 丰 富,除 血 清 蛋 白外,还 有 其 它 可 能 与 恩 诺 沙 星 结 合 的 蛋 白,这 会 增大 恩 诺 沙 星 与 血 浆 蛋 白 的 结 合 率 ; ② 文 献 使 用 的 是试 剂 级 血 清 白 蛋 白,而 血 浆 则 是 新 鲜 制 取 所 得,两者 活 性 上 存 在 一 定 的 差 异 [ 20 ]。
药 物 与 血 浆 蛋 白 结 合 率 过 高 和 过 低 都 不 利 于 药效 的 发 挥 [ 22 ]。 药 物 可 以 通 过 与 血 浆 蛋 白 结 合 而 被带 到 作 用 点,然 后 解 离 成 游 离 态 发 挥 药 效 。 此 试 验发 现 恩 诺 沙 星 与 中 华 绒 螯 蟹 血 浆 蛋 白 有 50%以 上的 结 合 率 。 用 药 初 始 阶 段,恩 诺 沙 星 会 较 多 与 血 浆蛋 白 结 合,因 而 实 际 游 离 态 的 药 物 浓 度 要 低 于 用 药浓 度,药 效 会 偏 低 ; 从 另 一 个 角 度 来 看,游 离 态 药物 代 谢 以 后,结 合 态 恩 诺 沙 星 的 释 放 又 会 使 药 物 的药 效 时 间 延 长 。 因 此,在 实 际 生 产 过 程 中,需 要 综合 考 虑 药 物 的 有 效 浓 度,药 效 时 间,必 要 情 况 下 要考 虑 与 其 它 药 物 的 搭 配 使 用,达 到 有 效 治 疗 的 目的 。
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2 0 0 8年 1 0月南 方 水 产
South China Fisheries Science
Vol14,No15
Oct1,2008
收 稿 日 期,2008202222; 修 回 日 期,2008207229
资 助 项 目,江 苏 省 省 级 海 洋 渔 业 开 发 项 目 (2007) ; 江 苏 省 水 产 三 项 工 程 项 目 ( PJ2005251)
作 者 简 介,黄 鸿 兵 (1979 - ),男,研 究 实 习 员,从 事 水 产 品 加 工 与 质 量 安 全 研 究,E2mail,nanjingrice@ yahoo1com1cn
通 讯 作 者,吴 光 红,E2mail,wuguangh@ jlonline1com
恩 诺 沙 星 与 中 华 绒 螯 蟹 血 浆 蛋 白 结 合 率 的 研 究黄 鸿 兵 1,吴 光 红 1,张 静 波 2,陈 颐 3
(11江 苏 省 淡 水 水 产 研 究 所,江 苏 南 京 210017; 21南 京 农 业 大 学 农 业 部 农 畜 产 品 加 工 与 质 量 控 制 重 点 开 放 实 验 室,
江 苏 南 京 210095; 31盐 城 市 产 品 质 量 监 督 检 验 所,江 苏 盐 城 224005)
摘 要,为 探 索 养 殖 过 程 中 恩 诺 沙 星 ( Enrofloxacin,ENR) 施 用 于 中 华 绒 螯 蟹 ( E riocheir sinensis) 中 的 药 效 情 况,
文 章 通 过 静 置 平 衡 透 析 法 分 析 研 究 了 恩 诺 沙 星 与 中 华 绒 螯 蟹 血 浆 的 蛋 白 结 合 率 。 试 验 测 得 的 中 华 绒 螯 蟹 血 浆 蛋白 浓 度 为 63195 ± 0129 mg· mL - 1,蛋 白 分 子 量 主 要 集 中 在 6612～ 9711 kDa之 间,恩 诺 沙 星 与 中 华 绒 螯 蟹 血 浆 蛋白 的 结 合 率 在 47139% ～ 82158%之 间 。 分 析 结 果 认 为,恩 诺 沙 星 与 中 华 绒 螯 蟹 血 浆 50%以 上 的 蛋 白 结 合 率,在中 华 绒 螯 蟹 养 殖 生 产 过 程 中 需 要 慎 重 考 虑 恩 诺 沙 星 的 有 效 药 物 浓 度 及 其 与 其 它 药 物 的 竞 争 作 用,以 能 充 分 发 挥恩 诺 沙 星 的 作 用 。
关 键 词,恩 诺 沙 星 ; 中 华 绒 螯 蟹 ; 血 浆 ; 蛋 白 结 合 率中 图 分 类 号,S948 文 献 标 识 码,A 文 章 编 号,1673 - 2227 - (2008) 05 - 0023 - 05
Study on binding capacity of Enrofloxacin ( ENR) with blood plasma
protein of Chinese m itten2handed crab,E riocheir sinensis
HUANG Hongbing1,WU Guanghong1,ZHANG J ingbo2,CHEN Yi3
(11 Freshw ater F isheries R esearch Institute of J iangsu Province,N anjing 210017,China; 21 Key L ab1 of A griculture
and A nim al P roducts P rocessing and Q uality Control,M inistry of A griculture,N anjing A gricultural U niversity,
N anjing 210095,China; 31 Yancheng Institute of Supervision & Testing on P roduct Q uality,Yancheng 224005,China)
Abstract,The binding capacity of the drug enrofloxacin with the p lasma p rotein of Chinese m itten2handed crab,Eriocheir sinensis dur2
ing feeding was investigated1 The method of fixed equilibrium dialysis test was app lied to the study on the binding of enrofloxacin with
the crab blood p lasma p rotein1 Concentration of the p lasma p roteins in Chinese m itten2handed crab was 63195 ± 0129 mg· mL - 1 1 Mo2
lecular weight of these p roteins were mainly between 6612～ 9711 kDa1 Protein binding level of enrofloxacin and crab p lasma p roteins
was 47139% ～ 82158%,showing thatmore than 50% of the drug could be bound to the p roteins1 Thus,it could be concluded that en2
rofloxacin can bind with p lasma p roteins tightly1 So,in case of using enrofloxacin alone or with other medicine,its effective concentra2
tion and competition between drugs should be considered in Chinese m itten2handed crab culture1
Key words,Enrofloxacin; Chinese m itten2handed crab; Eriocheir sinensis; p lasma; p rotein binding
大 多 数 药 物 在 体 内 的 药 理 作 用 是 药 物 与 特 异 受体 作 用 的 结 果 。 药 物 吸 收 入 血 后 会 不 同 程 度 地 与 血浆 蛋 白 结 合,按 其 与 血 浆 蛋 白 结 合 与 否 分 为 结 合 型和 游 离 型 。 这 是 一 个 迅 速,可 逆 的 过 程,很 快 达 到
24
南 方 水 产
第 4卷动 态 平 衡 [ 1 ],游 离 药 物 +血 浆 蛋 白 W药 物 2血 浆 蛋白 结 合 物 。 因 而,药 物 与 血 浆 蛋 白 的 结 合 率 是 影 响药 效 的 重 要 因 素 之 一 [ 2 ]。
喹 诺 酮 类 药 物 是 一 类 广 谱,高 效,低 毒 的 抗 菌药,具 有 良 好 的 药 物 动 力 学 特 性 。 恩 诺 沙 星 对 革 兰氏 阳 性 菌 及 阴 性 菌 引 起 的 细 菌 感 染 均 有 较 强 的 抑 杀作 用 。 主 要 用 于 预 防 和 治 疗 由 嗜 水 气 单 胞 菌 A ero2
m onas hydrophila,温 和 气 单 胞 菌 A1sobria,鳗 弧 菌
V ibrio anguillarum,假 单 胞 菌 Pseudom onas sp1等 引起 的 中 华 绒 螯 蟹 病 害 黑 鳃 病,烂 肢 病,蟹 奴 病,颤抖 病 等 疾 病 [ 3 ]。 目 前,国 内 外 学 者 已 大 量 开 展 了药 物 与 血 浆 蛋 白 的 结 合 分 析,他 们 广 泛 分 析 了 药 物与 血 浆 蛋 白 的 结 合 率,结 合 常 数,血 浆 蛋 白 与 药 物结 合 位 点 数,结 合 反 应 热 力 学 函 数 及 模 型 等 [ 4 - 5 ]。
这 些 研 究 为 新 药 开 发 和 应 用 提 供 了 有 力 的 理 论 和 技术 保 障 。 ZLOTOS等 [ 6 ]详 细 研 究 了 恩 诺 沙 星 ( En2
rofloxacin,ENR),环 丙 沙 星 等 18种 喹 诺 酮 类 药 物与 牛 血 清 蛋 白,人 血 清 蛋 白,人 血 浆 的 蛋 白 结 合率 。 学 者 们 还 对 恩 诺 沙 星 [ 7 ],氧 氟 沙 星 [ 8 ],左 氟沙 星 [ 9 ],洛 美 沙 星 [ 10 ],普 利 沙 星 [ 11 ],依 诺 沙星 [ 12 ]等 喹 诺 酮 类 药 物 与 蛋 白 的 相 互 作 用 进 行 了 详细 的 光 谱 分 析 研 究 。 贾 丽 华 等 [ 13 ]研 究 了 恩 诺 沙 星与 牛 血 清 白 蛋 白 的 相 互 作 用,得 到 两 者 的 结 合 常 数为 4116 × 105 L· mol- 1,以 其 摩 尔 比 1z 1结 合 。
恩 诺 沙 星 与 中 华 绒 螯 蟹 (Chinese m itten2hand2
ed crab,E riocheir sinensis) 血 浆 蛋 白 的 相 互 作 用 及结 合 率 研 究 还 未 见 报 道,此 文 则 通 过 静 置 平 衡 透 析法 研 究 了 恩 诺 沙 星 与 中 华 绒 螯 蟹 血 浆 蛋 白 的 结 合率,旨 在 为 恩 诺 沙 星 在 中 华 绒 螯 蟹 养 殖 生 产 过 程 中提 供 用 药 指 导 。
1 材 料 与 方 法
111 实 验 试 剂 及 设 备恩 诺 沙 星 标 准 品 ( > 9917%,美 国 Sigma公 司出 品 ) ; 甲 醇 (色 谱 纯,德 国 R iedel Haen公 司 出品 ) ; 乙 腈,磷 酸,三 乙 胺 (色 谱 纯,美 国 TED IA
公 司 出 品 ) ; 流 动 相 用 水 (1812 MΩ )。
高 速 冷 冻 离 心 机 (美 国 贝 克 曼 公 司 出 品 ) ; W a2
ters2695高 效 液 相 色 谱 仪 (美 国 W ater公 司 出 品 ) ;
超 纯 水 仪 (美 国 M illipole公 司 出 品 ) ; 透 析 袋 (进 口分 装,膜 分 子 量 13 000 kDa,直 径 21 mm )。
112 样 品 制 备恩 诺 沙 星 溶 液 配 制 。 恩 诺 沙 星 用 Tris2HCl缓 冲液 (0105 mol· L - 1,pH 714,内 含 0115 mol· L - 1
NaCl) 配 制 成 50010μ g· mL - 1的 标 准 品 储 备 液,使用 按 需 要 浓 度 稀 释 。
中 华 绒 螯 蟹 血 浆 制 取 。 中 华 绒 螯 蟹 从 当 地 农 贸市 场 购 买,体 重 200 g左 右,健 康 无 疾 病,从 河 蟹背 部 心 区 开 一 小 孔,用 注 射 器 抽 取 血 淋 巴,每 只 蟹
015 mL,混 合 后 移 入 装 有 015 mL ACD 抗 凝 剂 的
eppendorf管 中,离 心 后 得 河 蟹 血 浆 。
ACD抗 凝 剂 配 方 为 柠 檬 酸 三 钠 1132 g,柠 檬酸 0144 g,无 水 葡 萄 糖 1147 g,溶 解 70～ 80 mL蒸馏 水 中,再 加 入 011～ 012 g活 性 碳,静 置 10 m in
后 过 滤 即 得 。
113 恩 诺 沙 星 浓 度 测 定药 物 浓 度 测 定 [ 14 ]。 吸 取 015 mL样 品 于 10 mL
离 心 管 中,加 入 5 mL乙 腈,旋 涡 混 合 2 m in,5 000
r· m in- 1离 心 10 m in,将 上 清 液 转 移 至 旋 转 蒸 发 瓶中 。 往 残 渣 中 加 入 5 mL乙 腈,重 复 上 述 操 作 。 旋转 蒸 发 后,准 确 加 入 1 mL流 动 相 溶 解 残 留 物,过
0122μ m滤 膜,待 测 。
色 谱 条 件 [ 14 ]。 色 谱 柱 为 Zorbax SB 2C18分 析 柱
(250 mm × 416 mm i1d1,5μ m ) ; 流 动 相 为 0105
mol· L - 1磷 酸 溶 液 (以 三 乙 胺 调 pH至 214) /乙 腈
= 86 /14 (V /V ) ; 检 测 为 荧 光 检 测 器 ; 激 发 波 长
280 nm,发 射 波 长 455 nm; 柱 温 40℃ ; 进 样 量 20
μ L; 流 速 1 mL· m in- 1。
标 准 曲 线 的 绘 制 为 准 确 配 制 5,1,015,011、
0105和 0101μ g· mL - 1的 ENR标 准 品 工 作 液 。 以 标样 浓 度 为 横 坐 标,HPLC测 得 相 应 的 峰 面 积 为 纵 坐标,绘 制 标 准 曲 线 。
回 收 率,精 密 度 和 检 测 限 的 测 定 为 分 别 向 210
mL空 白 样 本 中 加 入 浓 度 为 012μ g· mL - 1 ENR标 准液 011,012,015 mL,添 加 水 平 分 别 为 10,20、
50μ g· mL - 1 ( n = 6),旋 涡 混 匀,放 置 15 m in,然后 再 进 行 前 处 理 及 高 效 液 相 色 谱 分 析,计 算 回 收 率和 精 密 度 。 根 据 国 际 纯 粹 与 应 用 化 学 联 合 会 ( IU2
PAC) 的 定 义,此 法 的 检 测 限 定 义 为 产 生 相 应 于 3
倍 背 景 噪 音 的 标 准 偏 差 分 析 信 号 的 浓 度 值 [ 15 ]。
114 蛋 白 结 合 率 透 析 实 验采 用 平 衡 透 析 法 [ 16 ]。 将 药 物 加 至 Tris2HCl缓
第 5期
黄 鸿 兵 等,恩 诺 沙 星 与 中 华 绒 螯 蟹 血 浆 蛋 白 结 合 率 的 研 究
25
冲 液 (0105 mol· L - 1,pH 714,内 含 0115 mol· L - 1
NaCl) 中,浓 度 分 别 为 012,014,110,510μ g·
mL - 1。 透 析 袋 中 装 河 蟹 新 鲜 血 浆 210 mL,袋 口 扎紧,保 证 不 漏,放 入 30 mL 广 口 玻 瓶 中,每 瓶 加
10 mL不 同 浓 度 药 物 的 缓 冲 液 。 透 析 于 4℃ 冷 柜 中进 行 ; 空 白 处 理 为 透 析 袋 外 是 110μ g· mL - 1恩 诺 沙星 溶 液,透 析 袋 内 是 0105 mol· L - 1 Tris2HCl,0115
mol· L - 1 NaCl缓 冲 液,分 别 于 静 置 平 衡 透 析 48、
72,96 h时 取 透 析 袋 内 血 浆 样 品 015 mL和 透 析 袋外 缓 冲 溶 液 样 品 015 mL,测 定 其 中 的 药 物 浓 度,
确 定 是 否 达 到 平 衡 时 间 (平 衡 时 间 点 以 空 白 处 理组 透 析 袋 内 外 浓 度 相 等 确 定 ) 后,以 前 述 血 浆 处理 方 法 测 定 药 物 浓 度 。 根 据 以 下 公 式 计 算 血 浆 蛋 白结 合 率 。
血 浆 蛋 白 结 合 率 = (血 浆 药 物 浓 度 - 透 析 液 药物 浓 度 ) × 100% /血 浆 药 物 浓 度
115 中 华 绒 螯 蟹 血 淋 巴 电 泳 实 验取 中 华 绒 螯 蟹 血 浆,制 备 成 5,10,20倍 的 稀释 液 。 电 泳 方 法 参 考 汪 家 政 和 范 明 [ 17 ]的 方 法,采用 B io2Rad公 司 M ini2p rotean Ⅱ 电 泳 仪 ; 丙 烯 酰 胺在 浓 缩 胶 中 的 百 分 比 4%,分 离 胶 中 的 百 分 比
1215% ; 浓 缩 胶 聚 合 时 间 015 h,分 离 胶 聚 合 时 间
1 h; 浓 缩 胶 电 泳 电 压 120 V,时 间 30 m in; 分 离 胶电 泳 电 压 80 V,时 间 3 h 15 m in; 011%考 马 斯 亮蓝 R2250染 色,染 色 时 间 15 m in; 脱 色 过 夜,次 日拍 取 照 片 。
116 统 计 分 析此 试 验 每 个 参 数 做 3个 重 复 (中 华 绒 螯 蟹 血浆 混 合 后 重 复 做 3次 ),取 其 平 均 值,采 用 Excel
2003统 计 分 析 实 验 参 数,并 用 SAS 812进 行 单 因素 方 差 分 析 (One2W ay ANOVA)。
2 结 果 与 分 析
211 恩 诺 沙 星 标 准 曲 线,回 收 率,相 对 标 准 偏 差以 标 准 样 品 浓 度 为 X,以 HPLC测 得 相 应 的 峰面 积 为 Y,求 出 ENR的 回 归 方 程 是 Y = 1241254X +
01161,相 关 性 系 数 是 0199999。 结 果 表 明,ENR
在 0101～ 5μ g· mL - 1范 围 内 线 性 良 好,可 以 满 足 定量 分 析 的 需 要 。
添 加 ENR 10,20和 50μ g· g- 1时,回 收 率 为
85% [相 对 标 准 偏 差 ( RSD ) 为 7% ],86%
(RSD为 3% ),82% (RSD为 5% )。 据 定 义 得 出
ENR的 检 测 限 低 于 1 ng· g- 1。 方 法 的 准 确 度 和 精 密度 均 符 合 残 留 分 析 的 要 求 。
212 透 析 平 衡 时 间 确 定由 图 1可 得,4℃ 条 件 下,静 置 透 析 到 48 h后时,透 析 袋 袋 内 浓 度 为 透 析 袋 外 浓 度 的 105137%、
95185%和 101148%,各 时 间 测 得 的 平 衡 率 之 间 差异 不 显 著 ( P > 0105),能 较 好 体 现 透 析 袋 内 外 的浓 度 平 衡 。 所 以,蛋 白 结 合 率 实 验 部 分 取 样 时 间 主要 为 48,72,96 h。
图 1 不 同 透 析 时 间 下 恩 诺 沙 星 (110μ g· mL - 1 )
的 透 析 平 衡 程 度
Fig11 Equilibrium rate of enrofloxacin solution at
different dialysis time
213 恩 诺 沙 星 与 中 华 绒 螯 蟹 血 浆 蛋 白 结 合 率 的 研 究
表 1显 示 恩 诺 沙 星 与 中 华 绒 螯 蟹 血 浆 蛋 白 结 合率 分 布 在 47139% ～ 82158%之 间 。 透 析 时 间 48和
72 h时,结 合 率 随 着 恩 诺 沙 星 浓 度 的 增 大 有 减 小的 趋 势,但 在 透 析 96 h时,各 浓 度 间 差 异 不 明 显 。
恩 诺 沙 星 浓 度 012μ g· mL - 1,透 析 96 h时,结 合 率显 著 小 于 其 它 透 析 时 间 的 结 合 率 。 其 它 浓 度 条 件下,结 合 率 随 透 析 时 间 不 发 生 显 著 变 化 ( P >
0105)。
214 中 华 绒 螯 蟹 血 浆 蛋 白 组 分 的 研 究通 过 测 定 中 华 绒 螯 蟹 血 浆 在 280 nm处 的 紫 外光 密 度 可 计 算 得,试 验 中 中 华 绒 螯 蟹 血 浆 蛋 白 浓 度为 63195 ± 0129 mg· mL - 1。 从 电 泳 图 谱 (图 2) 可知,中 华 绒 螯 蟹 血 浆 蛋 白 的 分 子 量 主 要 集 中 在 6612
26
南 方 水 产
第 4卷表 1 恩 诺 沙 星 与 中 华 绒 螯 蟹 血 浆 蛋 白 的 结 合 率
Tab11 B ind ing of ENR w ith pla sma prote in in E1sinensis
结 合 率 /%
p rotein bind data
透 析 袋 外 药 物 初 始 浓 度 /μ g· mL - 1 ( n = 3) concentration of drug outside dialysis bag
012 014 110 510
透 析 时 间
dialysis
time
48 h
83184 78155 651679 491222
83133 68117 591272 481974
80158 65170 541095 431971
平 均 值 ± 标 准 差 82158 ± 1175a 70181 ± 6182 59168 ± 5180 47139 ± 2196
72 h
82168 69126 571524 551981
84129 67176 521303 541295
80114 72143 591662
平 均 值 ± 标 准 差 82137 ± 2109a 69182 ± 2138 56150 ± 3179 55114 ± 5101
96 h
72141 67111 621742 571579
69167 59139 601765 521226
62122 61141 631939 491021
平 均 值 ± 标 准 差 68110 ± 3193b 62164 ± 1164 62148 ± 1159 52194 ± 2109
注,表 格 中 字 母 相 同 表 示 同 一 浓 度,不 同 时 间 之 间 差 异 不 显 著,显 著 性 水 平 P > 0105
Note,Same superscrip t letters mean no difference in the same row,otherwise,significant difference,P > 01051
～ 9711 kDa之 间,在 5倍 稀 释 泳 道 中 可 以 看 到 在上 述 分 子 量 范 围 以 外 的 其 它 蛋 白,从 最 小 的 10
kDa左 右 到 最 大 100 kDa左 右 不 等 。 10和 20倍 稀释 液 电 泳 后,泳 道 中 仅 能 看 到 2条 分 子 量 6612～
9711 kDa之 间 的 蛋 白,其 它 蛋 白 则 由 于 浓 度 过 稀而 观 察 不 到 。
3 讨 论
(1) 血 浆 中 与 药 物 结 合 的 主 要 是 血 清 白 蛋 白
(分 子 量 66 000 kDa左 右 ) [ 1,18 ]。 中 华 绒 螯 蟹 血 浆蛋 白 分 子 量 主 要 在 6612～ 9711 kDa之 间 。 试 验 中采 用 的 透 析 膜 (截 留 分 子 量 13 kDa) 能 达 到 阻 止蛋 白 进 出,保 证 恩 诺 沙 星 (分 子 量 35914 g· mol- 1 )
和 水 在 透 析 袋 内 外 的 自 由 迁 移 。
(2) 平 衡 透 析 法 是 结 合 率 分 析 的 传 统 方 法,
比 较 可 靠 和 经 济 实 用 。 ZLOTOS等 [ 6 ]研 究 发 现 药 物
/蛋 白 物 质 的 量 浓 度 比 例 0101条 件 下,恩 诺 沙 星 与人 血 清 蛋 白 ( HSA ) 结 合 率 为 ( 3416 ± 516 ) %
(连 续 超 滤 法 ) 和 ( 40 ± 2) % (不 连 续 超 滤 法 )。
KAARTINEN等 [ 19 ]研 究 发 现 恩 诺 沙 星 与 奶 山 羊 血 浆蛋 白 的 结 合 率 为 36% ～ 45% (体 外 实 验 )。 此 试 验得 到 的 结 合 率 结 果 高 于 文 献 中 蛋 白 结 合 率 的 主 要 原因,① 血 清 蛋 白 的 活 性 。 OLSEN等 [ 20 ]研 究 发 现 血清 蛋 白 结 合 稳 定 剂 后 与 药 物 的 蛋 白 结 合 率 大 幅 提图 2 中 华 绒 螯 蟹 血 浆 蛋 白 电 泳 图 谱
11标 准 蛋 白 ; 2110倍 稀 释 血 浆 ; 3120倍 稀 释 血 浆 ; 4～ 515倍 稀 释 血 浆
Fig12 Electrophoretic figure of p lasma p rotein in E1sinensis
11standard p roteins; 21p lasma ( × 10) ; 31p lasma ( × 20) ;
4～ 51p lasma ( × 5) 1
高 。 ② 药 物 浓 度 与 蛋 白 浓 度 的 比 例 。 此 试 验 所 用 的药 物 /蛋 白 物 质 的 量 比 例 约 在 01002～ 0105之 间,
符 合 实 际 生 产 中 的 用 药 情 况,在 该 浓 度 下,血 浆 蛋白 质 只 有 一 个 位 点 会 与 药 物 发 生 结 合 作 用 。 试 验 中的 结 合 率 数 据 主 要 分 布 在 47139% ～ 70181%,而出 现 的 82158%和 82137% 2个 高 数 值,可 能 是 因
第 5期
黄 鸿 兵 等,恩 诺 沙 星 与 中 华 绒 螯 蟹 血 浆 蛋 白 结 合 率 的 研 究
27
为 药 物 数 量 偏 少,蛋 白 充 分 结 合 的 结 果 ; 随 着 取 样次 数 的 增 多,蛋 白 数 量 减 少 要 多 于 药 物 数 量,结 合率 趋 于 稳 定 。 ③ 结 合 率 测 定 方 法 上 的 差 异 。 更 快 捷的 连 续 超 滤 法,表 面 响 应 传 感 器 等 方 法 与 此 试 验 所得 的 结 合 率 结 果 有 一 定 的 一 致 性,结 果 差 异 来 自 仪器,透 析 膜 对 药 物 的 吸 附 等 多 方 面 。
(3) 已 有 一 些 恩 诺 沙 星 在 中 华 绒 螯 蟹 体 内 的药 物 动 力 学 研 究 见 于 报 道 [ 14 ]。 此 试 验 针 对 恩 诺 沙星 与 中 华 绒 螯 蟹 血 浆 蛋 白 结 合 率 开 展 的 研 究 发 现,
结 合 率 主 要 在 47139% ～ 82158%之 间,试 验 要 高于 恩 诺 沙 星 与 其 它 畜 禽 类 血 浆 蛋 白 的 结 合 率 20%
～ 50%。 恩 诺 沙 星 与 犬 血 浆 蛋 白 的 结 合 率 仅 有
27%左 右 [ 21 ]。 原 因 可 能 是,① 中 华 绒 螯 蟹 血 浆 中蛋 白 浓 度 较 高,蛋 白 种 类 比 较 丰 富,除 血 清 蛋 白外,还 有 其 它 可 能 与 恩 诺 沙 星 结 合 的 蛋 白,这 会 增大 恩 诺 沙 星 与 血 浆 蛋 白 的 结 合 率 ; ② 文 献 使 用 的 是试 剂 级 血 清 白 蛋 白,而 血 浆 则 是 新 鲜 制 取 所 得,两者 活 性 上 存 在 一 定 的 差 异 [ 20 ]。
药 物 与 血 浆 蛋 白 结 合 率 过 高 和 过 低 都 不 利 于 药效 的 发 挥 [ 22 ]。 药 物 可 以 通 过 与 血 浆 蛋 白 结 合 而 被带 到 作 用 点,然 后 解 离 成 游 离 态 发 挥 药 效 。 此 试 验发 现 恩 诺 沙 星 与 中 华 绒 螯 蟹 血 浆 蛋 白 有 50%以 上的 结 合 率 。 用 药 初 始 阶 段,恩 诺 沙 星 会 较 多 与 血 浆蛋 白 结 合,因 而 实 际 游 离 态 的 药 物 浓 度 要 低 于 用 药浓 度,药 效 会 偏 低 ; 从 另 一 个 角 度 来 看,游 离 态 药物 代 谢 以 后,结 合 态 恩 诺 沙 星 的 释 放 又 会 使 药 物 的药 效 时 间 延 长 。 因 此,在 实 际 生 产 过 程 中,需 要 综合 考 虑 药 物 的 有 效 浓 度,药 效 时 间,必 要 情 况 下 要考 虑 与 其 它 药 物 的 搭 配 使 用,达 到 有 效 治 疗 的 目的 。
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