第一章免疫组化与杂交组化的理论基础
Theory Basis of the
Immunohistochemistry and
Hybridohistochemistry
学习本门课程的总体要求
*1,熟悉免疫组织化学和原位 PCR的技术特点 及其原理
*2.掌握免疫组织化学染色的操作流 程
*3.熟悉免疫化学反应相关术语及其所用免疫试剂的来源和质量控制
4.了解多克隆抗体制备程序与操作要求
5.了解单克隆抗体制备原理和步骤概 论一,什么是免疫组织化学与杂交组织化学免疫组织化学与杂交组织化学是一门研究利用核素和非核素标记物作为显示剂，
通过交联物连接的抗原抗体或核苷酸碱基配对特异的反应特性，
原位显示生物体细胞或组织中各种高分子物质（蛋白质或核苷酸）等,并可在光镜或电镜上观察的示踪科学 。它是多学科的交叉产物，实用性很强。学习的目的是为了使参与选修的研究生熟悉与成功应用这项研究方法，为日后学位课题研究提供基础。
二,发展历史这项技术 本质上是一种染色及原位示踪技术,它是在酶组织化学基础上发展起来的,始于 20世纪中期 。
先后经历了,免疫荧光 标记抗体技术
（ Coons 1940年 ） ----免疫酶标 抗体技术
（ Abakane 1963） ----不标记酶抗体 （ 酶抗酶复合物 ） 技术 （ Sternberger 1970） ----胶体金免疫标记 技术和 亲和标记 技术 （ Hsu 1985）
----原位分子杂交 技术 （ Couwenhoren 1988）
----原位 PCR技术 （ Bagasrao 1993） 等阶段 。
免 疫 试 剂,自 1975 年 Kohler 和
Milstein发明了单克隆抗体制备的杂交瘤技术后,已从采用多克隆抗体转入了广泛应用单克隆抗体时代 。 目前商品供应的特异性第一抗体和交联第二抗体,绝大多数都为单克隆抗体 。
三,技术特点 （ 优点 ）
1,特异性强 专一
2,敏感性高 检测阈值达 ng或 pg水平
3,定位准确 即可定性,定位,
又可定量
4,三位一体 形态,功能和代谢三结合缺点,干扰多,易出现假阳性四,免疫组织化学染色操作步骤
（ 一 ） 组织处理与切片选择 （ 第三章 ）
（ 二 ） 免疫染色的前处理 （ 第一,二,九章等 ）
试剂准备 （ 示踪,放大,标记 ） ；消化；阻断； *（ 三 ） 免疫组化染色 （ 第四,五,六,七,八章等 ）
原理,优缺点,流程
（ 四 ） 免疫染色的后处理 （ 第八,九,三 章等 ）
增强,衬染,封固
*（ 五 ） 结果判断与对照设置 （ 第九,十章 ）
方法众多,敏感不同,程序雷同,
按需选用关键步骤,特异抗体 -----桥联抗体 ----标记抗体
（ 第一抗体 ） （ 第二抗体 ） （ 第三抗体 ）
种系必需匹配
* 原位 PCR
原理与技术类型,探针和引物,
操作流程和要求,对照设置,应用对象 (十三章 )。 核酸探针和原位杂交由组 胚 设 课 介 绍 。
多克隆抗体的制备一,相关术语的概念
1,抗原,凡具有能刺激机体免疫系统使之产生特异性免疫应答 （ 免疫原性 ）,
并能与相应免疫应答物 ----抗体或致敏淋巴细胞在体内,外发生特异性结合 （ 反应原性 ） 的物质 。
既具免疫原性又具反应原性的物质,称为,完全抗原,；只具反应原性而不具免疫原性的物质称为,半抗原,（ hepten）
颗粒性抗原与可溶性抗原特异性抗原与共同 （ 或交叉 ） 抗原组织抗原 （ 结构,分泌 ） 与胚胎抗原
2.抗原决定簇,抗原分子表面的一些特殊的化学基团,其性质、数量、空间构型与抗原的特异免疫反应有关。
3,抗原的免疫原性取决于抗原的 ① 异物性 ； ② 大分子 ； ③ 表面积 ； ④ 专一决定簇等 。
亲合层析 …… 免疫纯亲合层析柱的制备：
载体 （ sepharose） ＋亲合物 （ 免疫吸附剂 ）
（ 共价交联 ）
抗体 ----抗原；凝集素 ----糖基 （ ConA）
SPA-----IgG等
4,半抗原＋载体蛋白 →全抗原交联剂,戍二醛,碳二亚胺,重氮化,琥珀酸酐,O-羧甲基羟胺 →共价结合；
载体蛋白,HAS,BSA,多聚赖氨酸,
牛甲状腺球蛋白等；
（ 免疫原性强,易获得,交叉反应易去除 ）
交联要求,不改变半抗原的分子构型；远离半抗原的抗原决定簇；高结合率 （ 结合半抗原数目至少 20个以上 ）
5,特异性抗体 ---指由抗原激发生物机体免疫细胞产生的抗体，也可称,免疫抗体”。依制备途径，目前人工制备的特异性抗体有三类，即 多克隆抗体（ PcAb）,单克隆抗体（ McAb）
和基因工程抗体。
二,多克隆抗体 （ 抗血清 ） PcAb的 制备程序多克隆抗体 ---指由不同克隆 B细胞产生的抗体混合物 。 血清中的抗体皆是多克隆的 。
1,抗原纯化 ……… 免疫原
2,免疫动物 ……… 免疫对象
3,收集抗血清 …… 粗,混合品
4,提取 IgG……… PcAb,纯品
5,质量鉴定 …… 效价,特异性,蛋白量
6,保存与使用 …… 免疫试剂纯度 （ 杂 →纯 ）,抗血清 →r球蛋白 →IgG→特异性 IgG→IgG片段 （ Fab或 F(ab’)2）
抗体 ≠IgG
（一） 抗原提取与纯化的一般原则
1.建立检测方法 （ 定性,定量,活性 ）,示踪全过程
2.选择 抗原含量高,易获得,价廉,可大量收集的样品为 原料 ；
人 AFP…… AFP(+)肝癌病人腹水； 4～ 6月胎儿血清；孕 18天大鼠羊水 …… 鼠 AFP
波形蛋白 （ vimentin） …… 猪,牛眼晶状体角蛋白 （ keratin） …… 角化上皮肌红蛋白 （ myoglobin） …… 骨骼肌胶原 （ collagen） …… 皮肤,肌腱等
3.保持抗原分子的稳定性 ----低温,适度
pH与离子强度,抑制酶解,保护巯基
4.操作步骤简易,有效 。 方法有,（ 组织去污和破碎 ）
（ 1） 增溶溶解 …… 盐析 （ 粗品 ）
（ 2） 分离纯化 …… 离子交换,凝胶层析,亲合层析
,先粗后细逐步纯化,……… 纯品
（ 二 ） 免疫原 （ 抗原 ） 的准备免疫原＝抗原＋佐剂 （ 可溶性 ）,颗粒性抗原,不加佐剂,直接用于免疫 。
1.选取高纯度的抗原,调整蛋白浓度
（ 1～ 2mg/ml）
2.确定免疫原剂量初次免疫 小动物 1mg /ml ± （ 1～ 10mg）
大动物 20mg /ml ± （ 50～ 100mg）
加强免疫 首次免疫剂量的 1/5～ 2/5
原则：
取小不取大,视抗原的免疫原性而定微量法不易产生高效价抗体大量法易产生免疫耐受或免疫麻痹,甚至过敏致死制备高特异抗体 … 低剂量,短程免疫制备高效价抗体 … 大剂量,长程免疫
3,佐剂应用,乳化充分 （ 非特异免疫增强剂 ）
（ adjuvent）
完全,羊毛脂＋液体石蜡＋卡介苗弗氏佐剂 1 3～ 5 1～ 20mg
Freund’s 不完全 （ 半 ）,羊毛脂＋液体石蜡
（ 三 ） 免疫动物
1.动物选择 种系远,适龄 （ 年轻 ）,健壮,
无病,雄性,实验室 （ 小动物 ）,兔 （ 新西兰种,
2～ 4kg（ 2.5kg） ； 生产单位 （ 大动物 ） 马,骡等
（ 数量 2只以上 ）
2.免疫方案 剂量,次数,途径,间隔时间等 …… 多点,皮内或皮下；首次 +完全佐剂,再次
＋半佐剂,末次不加佐剂 （ iv） ；间隔时间 2～ 4
周；加强免疫次数 2～ 4次；自第二次加强免疫前,
少量采血测抗体效价监控 （ 1,16以上 ）
3.采血,分离血清 （ 抗血清 ）
小动物放血处死；大动物活体股 A采血,200ml/
只； （ 兔颈 A放血,60～ 70ml/只,小鼠球后 A放血,1ml/只 ）
4.纯化,分离 IgG
（ 四 ） 免疫球蛋白 （ IgG） 的分离纯化
（ 综合法 ---盐析＋层析 ）
1,理化方法 ……… 盐析 （ 中性盐 ） 粗制品
（ NH4） 2SO4； NaCL等依据蛋白质的不同沉淀系数或溶解度
50％ 饱和度 …… rG（ 95％ ） ＋其它球蛋白
33％ 饱和度 …… rG（ IgG） 80~90%回收率
2.层析 …… 离子交换,分子筛凝胶,亲合层析 … 纯品要求,载体活化,装柱标准,平衡充分,分部收集,防止变性阴离子交换剂 ----二乙氨乙基纤维素 （ DEAE）
离子交换剂 pH7.0~9.0 ---11.22（ 粗 ） ； 32.52（ 细 ）
ion-exchange 阳离子交换剂 …… 羧甲基纤维素 （ CM）
agents化学纯 pH4.5~6.0 纤维素凝胶过滤法 ----葡聚糖凝胶,琼脂糖凝胶,聚丙乙烯凝胶
（ 分子筛 ） Sephadex Sepharose Bil-gel
Pharmacia瑞典 G50－ G200 4B或 6B
（ 五 ） 质量鉴定与保存
1,纯化品 （ IgG或抗原蛋白 ）
脱盐 （ 透析或分子筛凝胶过滤 ）
↓ Sephadex G50
浓缩 （ 聚乙二醇 PEG）
2,测定蛋白含量 紫外线吸收法 （ OD280）
或化学滴定 （ 双缩脲或酚试剂 ）
纯度 免疫电泳,凝胶电泳活性 效价 ---双扩散,Elasa
3,分装,冻干,低温保存液体 …… 原装高浓度 － 20℃ 数月稀释低浓度 4℃ 或 -20℃ 1～ 2周冻干 4℃ 或 -20℃ 1～ 2年单克隆抗体的制备及其应用单克隆抗体是指由单个克隆的杂交瘤细胞产生针对一种抗原决定簇的特异性抗体 。 它是采用 B淋巴细胞杂交瘤技术（抗体的细胞工程）制备的。
一,利用杂交瘤技术制备 McAb的基本原理
（ 一 ） 淋巴细胞产生抗体的克隆选择学说,即一个 B细胞克隆只产生一种抗体；
（ 二 ） 细胞融合技术产生的杂交瘤细胞可以保持双方亲代细胞的特性；
（ 三 ） 利用代谢缺陷补救机理筛选出杂交瘤细胞,并进行克隆化,然后大量培养增殖,制备所需的 McAb。
二,McAb的制备流程亲本细胞准备 →细胞杂交融合 （ PEG）
→HAT选择性培养 →杂交瘤细胞克隆性培养与建株 （ 有效稀释法 ） →大量制备单克隆抗体 →质量鉴定与分装冻存
↓（ 扩大培养或接种动物 ）
（ 杂交瘤细胞冻存与复苏 ）
McAb的制备流程抗原免疫免疫脾细胞 小鼠骨髓瘤细胞
(BALB/C小鼠 ) （经 8-AG或 6-TG诱导）
(亲本细胞 )
混合、融合（ PEG）
选择性培养（ HAT）
筛选和克隆化冻存 阳性细胞建株（稳定分泌 McAb）
（杂交瘤细胞）
复苏 McAb大量制备（上清或腹水 ---鼠）
稳定性检查 纯化、鉴定（特异性、活性、含量）
三 亲本细胞准备
（ 一 ） 免疫小鼠 （ BALB/C） 脾细胞悬液的制备
1,取 BALB/C小鼠 8～ 12周龄,健康,雄性,
2只以上
2,免疫原制备 （ 抗原＋佐剂或不加佐剂 ）
免疫方案：常规法 （ 多点皮下,多次 ）
脾内注射一次法
3,取脾分离免疫脾细胞 （ 免疫疗程结束后 3～
4d）
4,镜检活细胞率达 90％ 以上,培养液稀释成
108 （ 台盼兰染色,死细胞着染 ）,备用
（ 二 ） 小鼠骨髓瘤细胞悬液的制备 （ SP2/0,NS
－ 1）
1,冻存细胞复苏后,置入含 10％ 新鲜小牛血清的 RPMI-1640培养液中,5％ CO2,37℃ 温箱中培养,每 2～ 3d换液一次,3～ 5d传代一次；
2,取生长良好的瘤细胞 （ 圆形明亮,排列整齐,
形态完整,密度适宜 1× 106）,台盼兰染色 -
镜检活细胞率大于 90％ 以上,备用 （ 对数生长,中期 ） ;
3,实验用小鼠骨髓瘤细胞应每隔 3～ 6个月,将复苏细胞在含有 8-AG或 6-TK培养液中培养一次,去除回复突变细胞 。
四 细胞融合 （ PEG）
A,免疫脾细胞 （ 108） ＋ B.骨髓瘤细胞 （ 酶缺陷,107） （ 10,1）
1,融合操作按比例 （ 10,1） 将免疫后脾淋巴细胞 （ A） 与经处理的缺陷型骨髓瘤细胞 （ B）
混合,加入 20 ～ 50ml RPMI-1640 液,
1000rpm 10min,弃上清,37℃ 水浴中,
吸取 1ml 37℃ 预温的 50％ PEG缓慢滴入,
1min内加完,37℃ 静置 1min,再滴加入完全培养液 （ 1min中加完 ）,尔后加 1640液至 50ml,终止 PEG作用 。 800rpm× 10min
弃上清,沉淀细胞悬浮后转入选择性培养 。
2,细胞融合剂一聚乙二醇的特牲聚乙二醇 （ polyethylene glycol,PEG）
是乙二醇的多聚化合物,存在一系列不同分子量的多聚体 。
PEG可与水分子借氢键结合,在高浓度 （ 50％ ） 的 PEG溶液中自由水消失,导致细胞脱水而发生质膜结构的变化,由此引起细胞膜融合 。 所以在细胞融合试验中多采用较高浓渡 （ 40％ ～ 50％ ）,MW为
6000。 但在 PEG的高浓渡下,
细胞可因脱水显著而遭受破坏,故实际工作中有时在 PEG溶液中加入适量的凝集素
（ 如 Con-A等 ）,此时 PEG的浓度可降低至 20％ ～ 30％,而细胞融合效率反而提高 2～ 3倍,这是因为凝集素与膜结构糖链特异结合,空间构型发生改变有利于细胞融合 。 凝 集 素 添 加 浓 度 常 为 PEG 的
1/103~104。
优点：
① 易制备,好控制；
② 活牲稳定；
③ 使用方便 。
缺点：
①对细胞有毒牲，尤其是高浓度；
②细胞融合率低，约为 1× 10－ 5;
③ 不能在显微镜下直接观察其细胞融合过程。
3,饲养细胞的制备在体外细胞培养中，单个或少数细胞不易生长与增殖，需加入其他活细胞共同培养，才可能使之生存。加入的细胞称为饲养细胞（支持与辅助体外细胞生长增殖的细胞）。
常用的饲养细胞有,小鼠腹腔巨噬细胞,脾细胞、胸腺细胞、传 代胚胎纤维母细胞等。
小鼠腹腔巨噬细胞的制备：
取 8～ 10周龄同系小鼠，断颈处死，无菌操作腹腔内注射 10～ 15ml完全培养液，
用消毒拇指轻揉腹部数次后，吸回腹腔液体，计细胞数。用培养液调整细胞浓度为
1～ 105/ml，备用。一般一只小鼠腹腔液可获取细胞 3× 106～ 5× 106，可供一次融合用
（亦可取两只小鼠腹腔巨噬细胞混合使用）。
融合前一天,在 96孔板中先用饲养细胞培养,0.1ml/孔 （ 含 104细胞 ）,融合时弃培养液,再分别加入混合细胞悬液 。
五 杂交瘤细胞的选择性培养 （ HAT）
（ 一 ） 原理亲本细胞杂交融合后,除了所需的杂交瘤细胞外,还存在自身融合的 4倍体细胞和未融合的二倍体亲本细胞,后者必需予以清除,为此目的,一般选用 HAT培养基进行筛选性培养,其原理是：
在 HAT培养液中，细胞合成核酸的主要途径被氨基喋呤（ A）阻断，而用于细胞融合的骨髓瘤细胞均系预先经过 8-氮鸟嘌呤等处理，而缺少 HGPRT（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶 ）或 TK（胸腺嘧啶激酶），其合成核酸的补救途径也被阻断；脾细胞虽含有 HGPRT或 TK，但它们在体外难以长时间存活（一般只能存活 5～ 7天）。
只有骨髓瘤细胞和脾细胞融合后所形成的杂交瘤细胞，由于可从脾细胞中获得所缺乏的酶类，又具有在体外培养条件下不断生长的能力，故能在含 HAT培养液中通过补救途径合成核酸而继续生长繁殖。
DNA合成途径 经典 补救次黄嘌呤（ H）
HGPRT
氨基酸氨基喋呤（ A）切断 核糖核苷酸
DNA
糖 核糖核苷
TK
胸腺嘧啶（ T）
（ 二 ） 方法,融合后 3～ 5d换一次 HAT培养液,每次吸出培养孔旧液 1/2,加入新液,
连续 2周 。 3～ 5天后未融合及自身融合的细胞逐渐死亡 。 1周左右可出现克隆,并不断增殖,当集落大于 3mm或布满孔底
1/2时,即可取上清作抗体活性检测,并补加新鲜 HAT培养液,培养 3周后改用普通完全培养液,进一步克隆化培养 。
理想的融合试验,约 70％ ～ 80％ 孔有细胞克隆生长 。
六 杂交瘤细胞克隆性培养与建株
（ 有限稀释法 ）
目的,筛选获得单个分泌抗体的杂交瘤细胞原理,f (0) =e-1 (poisson公式 )
λ＝ 1 f（ O） =0.37
即约有 37％的培养孔无细胞生长,63％孔有细胞生长，其中半数含单个细胞，另一半孔可能超过 1个细胞，如果再次倍比稀释，不断降低细胞密度，就可增加获得单个细胞的机率。
例,10个细胞 /10ml→0.1ml/孔，分别接种 100个培养孔。理论上计数，平均每孔 1个细胞。
方法,先从选择性培养后的孔内吸出细胞悬液作细胞计数,测出 1ml的细胞数,用
HT培养液稀释至细胞浓度达 50～ 60个 /ml。
尔后分别加到 96孔板,每孔加 0.1ml（ 约
5～ 6个细胞 /孔 ）,一般接种两排,剩余的细胞悬液作倍比稀释,再接种两排,
如此类推,直至每孔含细胞 0.5～ 1个,培养 7～ 10d后,选择单克隆阳性抗体细胞孔再一次克隆,如此重复 3～ 5次,直至 100
％ 阳性孔时为止,以确保抗体是由单个克隆细胞所产生 。
本法简便、效果好，已广泛被采用。
（其它克隆化方法，尚有：软琼脂法，显微挑选法。 FACS---流式细胞光度分析法等，详见讲义 p20）
体外细胞培养的一些基本知识原代细胞 （ 异性细胞 ） 培养 …… 原代培养传代细胞 （ 同性细胞 ） 培养 …… 传代培养永久性传代细胞 ………… 细胞株 （ 建株细胞 ）
特点：代间细胞特性稳定,较少退化,
1～ 4周体外细胞的生长过程 ---接种 →生长 →传代体外培养细胞,条件适宜,即生长增殖 。 但在培养皿或瓶中,细胞繁殖到一定程度后,即细胞占满,养料耗尽,若不及时传代,原代细胞将会导致死亡,原代细胞传代后即成细胞系 （ 无限生长 ） 。
体外培养细胞生长过程可分三个阶段：
滞留期 （ 悬浮 →潜伏 ） 24～ 96h；指数生长期 （ 对数 ） 3～ 5d;平台期 （ 停止 ） 分裂停止 。
七 制备单克隆抗体
（ 扩大培养或接种动物 ）
前者纯度高,后者得率高,需纯化
1,扩大培养 （ 无血清培养液作悬浮培养法,培养罐法等 ） …… 取上清,量约
10～ 100mg/ml。
2,体内诱导法 （ 接种动物 ） …… 腹水或血清腹水型 McAb的制备：取健康适龄
（ 8～ 10周 ） BALB/C小鼠,先于小鼠腹腔注射 0.3ml降植烷 （ pristane） 或石蜡油,
7～ 10d后每只小鼠腹腔注射阳性克隆杂交瘤细胞悬液 0.5× 106～ 5.0× 106（ 1× 108）
个 /ml,待小鼠腹部明显膨大时即可收取腹水,离心后分装,－ 20℃ 备用或冻干保存 。
质量与细胞数,分泌特性有关 。 少则腹水形成慢,但抗体效价高；多则腹水形成快,
可出现血性腹水,质低 。
血清型 McAb的制备 （ 皮下移植瘤 →分离血清 ）
含量 1～ 10mg/ml
八 McAb的质量鉴定（含杂交瘤细胞）
分泌型杂交瘤细胞 …… 染色体数目
（ 秋水仙素裂解 ）
McAb类型 …… 琼脂双扩散,ELISA法 --夹心用不同 IgG亚型作抗原
McAb特异性 … 免疫电泳法,ELISA法,IH
McAb效价 … 凝集,沉淀,琼脂双扩散,
ELISA
腹水效价 5× 104～ 106为合格
McAb的亲合力 … ELISA法识别抗原表位 … 竞争抑制试验九 杂交瘤细胞的保存与复苏
－ 196℃ 液氮中冻存（逐步降温），冻存液配置（ 30％～ 40％小牛血清＋ 50％～
60％不完全 RPMI－ 1640培养液＋ 10％
DMSO）；细胞浓度～ 5× 106个 /ml；存活数年。
复苏培养,取出细胞冻存管,立即投入 38℃ ～ 40℃ 水浴中解冻,然后用 RPMI－ 1640培养液洗 2次,再用完全培养液配成细胞悬液,移入多孔培养板,37℃,5％ CO2温箱培养 。 传代
2～ 3次 。 死亡细胞多时,可加饲养细胞同时培养 。
单克隆抗体（ McAb）
的应用一、特异性抗原的制备二、临床免疫诊断试剂（ ELISA）
三、免疫组化示踪与杂交组化桥连放大试剂
------用于诊断、鉴别诊断与基础研究四、导向治疗与基因阻断治疗
------交叉、稀释、变异、阻断封闭、不均一等不足，治疗应用还受到一些限制。
鼠源性 McAb对人体有较强的免疫原性,可产生人抗鼠抗体 （ HAMA） ；
制备人的 McAb,由于在肿瘤部位的摄取量甚少,比裸鼠荷瘤模型低 2～ 3个数量级,加之生产成本高,制备时间长,
难以普及应用 。
方向,基因工程技术构建 McAb
人 -鼠嵌合抗体,人源化抗体,单链抗体,抗体库 （ V-鼠,C-人 ）
附录,抗体的分子结构
1.抗体分子在立体构型上都 是 Ig,但 Ig不都是抗体。
2.各类 Ig的基本单位都是四条肽链的对称结构,包括二条相同的重链 (heavy chain,
H链 ),及二条相同的轻链 (light chain,L链 ),每条重链 (H链 )和轻链 (L链 )分为氨基端 (N端 )
和羧基端 (C端 )。
3,两条重链间，两条轻链间及重链和轻链间，分别借二硫键连接。此为免疫球蛋白的基本结构，又称为免疫球蛋白的单体,呈,Y”字构型。
4.重链上结合有不同量的糖,故 Ig属糖蛋白。
根据重链抗原性的不同可分为 5类，即 μ链，
γ 链,α链,δ链和 ε链,由它们组成的 Ig分别称为 IgM,IgG,IgA,IgE和 IgD。
5.轻链也可根据其化学结构和抗原性的差异分为 κ和 λ二型。一个 Ig分子的二条轻链型别相同，绝无可能 κ型和 λ
型共同存在于同一个 Ig分子中。
6,Ig单体的氨基酸序列可分为恒定区
（ constant region,C区 )和可变区（ variable
region,V区）。可变区位于 Ig多肽链的 N端，
占轻链的约 1/2及重链的约 1/4，是 Ig结合抗原的所在部位。恒定区位于 Ig多肽链的 C端，
占轻链的余下的 1/2及重链的 3/4，是补体结合域,Fc受体结合位点,Ig 抗原决定簇等所在部位。
7,Ig的水解片断可因选用的水解酶不同而异 。 采用 木瓜蛋白酶 (papain)水解
Ig时,可得到 2个相同的 Fab段即抗原结合片断 (fragment antigen binding，
Fab) 和 1 个 Fc 段 即 可 结 晶 片 断
（ fragment crystalliable,Fc),拥有 IgG
抗原决定簇 。
采用 胃蛋白酶 （ pepsin），其酶切位点在 Ig重链间二硫键近羧基端，产生两个片断,一个具有双价抗体活性的
F(ab’)2片断，另一个为不具任何免疫活性的 Fc’片断。
8.抗体的蛋白类型主要为 IgG和 IgM。
IgM见于初次免疫和免疫早期,滞留时间较短 。
IgG一般见于加强免疫和免疫晚期，
滞留时间较长，是免疫球蛋白的主要类型。
Theory Basis of the
Immunohistochemistry and
Hybridohistochemistry
学习本门课程的总体要求
*1,熟悉免疫组织化学和原位 PCR的技术特点 及其原理
*2.掌握免疫组织化学染色的操作流 程
*3.熟悉免疫化学反应相关术语及其所用免疫试剂的来源和质量控制
4.了解多克隆抗体制备程序与操作要求
5.了解单克隆抗体制备原理和步骤概 论一,什么是免疫组织化学与杂交组织化学免疫组织化学与杂交组织化学是一门研究利用核素和非核素标记物作为显示剂，
通过交联物连接的抗原抗体或核苷酸碱基配对特异的反应特性，
原位显示生物体细胞或组织中各种高分子物质（蛋白质或核苷酸）等,并可在光镜或电镜上观察的示踪科学 。它是多学科的交叉产物，实用性很强。学习的目的是为了使参与选修的研究生熟悉与成功应用这项研究方法，为日后学位课题研究提供基础。
二,发展历史这项技术 本质上是一种染色及原位示踪技术,它是在酶组织化学基础上发展起来的,始于 20世纪中期 。
先后经历了,免疫荧光 标记抗体技术
（ Coons 1940年 ） ----免疫酶标 抗体技术
（ Abakane 1963） ----不标记酶抗体 （ 酶抗酶复合物 ） 技术 （ Sternberger 1970） ----胶体金免疫标记 技术和 亲和标记 技术 （ Hsu 1985）
----原位分子杂交 技术 （ Couwenhoren 1988）
----原位 PCR技术 （ Bagasrao 1993） 等阶段 。
免 疫 试 剂,自 1975 年 Kohler 和
Milstein发明了单克隆抗体制备的杂交瘤技术后,已从采用多克隆抗体转入了广泛应用单克隆抗体时代 。 目前商品供应的特异性第一抗体和交联第二抗体,绝大多数都为单克隆抗体 。
三,技术特点 （ 优点 ）
1,特异性强 专一
2,敏感性高 检测阈值达 ng或 pg水平
3,定位准确 即可定性,定位,
又可定量
4,三位一体 形态,功能和代谢三结合缺点,干扰多,易出现假阳性四,免疫组织化学染色操作步骤
（ 一 ） 组织处理与切片选择 （ 第三章 ）
（ 二 ） 免疫染色的前处理 （ 第一,二,九章等 ）
试剂准备 （ 示踪,放大,标记 ） ；消化；阻断； *（ 三 ） 免疫组化染色 （ 第四,五,六,七,八章等 ）
原理,优缺点,流程
（ 四 ） 免疫染色的后处理 （ 第八,九,三 章等 ）
增强,衬染,封固
*（ 五 ） 结果判断与对照设置 （ 第九,十章 ）
方法众多,敏感不同,程序雷同,
按需选用关键步骤,特异抗体 -----桥联抗体 ----标记抗体
（ 第一抗体 ） （ 第二抗体 ） （ 第三抗体 ）
种系必需匹配
* 原位 PCR
原理与技术类型,探针和引物,
操作流程和要求,对照设置,应用对象 (十三章 )。 核酸探针和原位杂交由组 胚 设 课 介 绍 。
多克隆抗体的制备一,相关术语的概念
1,抗原,凡具有能刺激机体免疫系统使之产生特异性免疫应答 （ 免疫原性 ）,
并能与相应免疫应答物 ----抗体或致敏淋巴细胞在体内,外发生特异性结合 （ 反应原性 ） 的物质 。
既具免疫原性又具反应原性的物质,称为,完全抗原,；只具反应原性而不具免疫原性的物质称为,半抗原,（ hepten）
颗粒性抗原与可溶性抗原特异性抗原与共同 （ 或交叉 ） 抗原组织抗原 （ 结构,分泌 ） 与胚胎抗原
2.抗原决定簇,抗原分子表面的一些特殊的化学基团,其性质、数量、空间构型与抗原的特异免疫反应有关。
3,抗原的免疫原性取决于抗原的 ① 异物性 ； ② 大分子 ； ③ 表面积 ； ④ 专一决定簇等 。
亲合层析 …… 免疫纯亲合层析柱的制备：
载体 （ sepharose） ＋亲合物 （ 免疫吸附剂 ）
（ 共价交联 ）
抗体 ----抗原；凝集素 ----糖基 （ ConA）
SPA-----IgG等
4,半抗原＋载体蛋白 →全抗原交联剂,戍二醛,碳二亚胺,重氮化,琥珀酸酐,O-羧甲基羟胺 →共价结合；
载体蛋白,HAS,BSA,多聚赖氨酸,
牛甲状腺球蛋白等；
（ 免疫原性强,易获得,交叉反应易去除 ）
交联要求,不改变半抗原的分子构型；远离半抗原的抗原决定簇；高结合率 （ 结合半抗原数目至少 20个以上 ）
5,特异性抗体 ---指由抗原激发生物机体免疫细胞产生的抗体，也可称,免疫抗体”。依制备途径，目前人工制备的特异性抗体有三类，即 多克隆抗体（ PcAb）,单克隆抗体（ McAb）
和基因工程抗体。
二,多克隆抗体 （ 抗血清 ） PcAb的 制备程序多克隆抗体 ---指由不同克隆 B细胞产生的抗体混合物 。 血清中的抗体皆是多克隆的 。
1,抗原纯化 ……… 免疫原
2,免疫动物 ……… 免疫对象
3,收集抗血清 …… 粗,混合品
4,提取 IgG……… PcAb,纯品
5,质量鉴定 …… 效价,特异性,蛋白量
6,保存与使用 …… 免疫试剂纯度 （ 杂 →纯 ）,抗血清 →r球蛋白 →IgG→特异性 IgG→IgG片段 （ Fab或 F(ab’)2）
抗体 ≠IgG
（一） 抗原提取与纯化的一般原则
1.建立检测方法 （ 定性,定量,活性 ）,示踪全过程
2.选择 抗原含量高,易获得,价廉,可大量收集的样品为 原料 ；
人 AFP…… AFP(+)肝癌病人腹水； 4～ 6月胎儿血清；孕 18天大鼠羊水 …… 鼠 AFP
波形蛋白 （ vimentin） …… 猪,牛眼晶状体角蛋白 （ keratin） …… 角化上皮肌红蛋白 （ myoglobin） …… 骨骼肌胶原 （ collagen） …… 皮肤,肌腱等
3.保持抗原分子的稳定性 ----低温,适度
pH与离子强度,抑制酶解,保护巯基
4.操作步骤简易,有效 。 方法有,（ 组织去污和破碎 ）
（ 1） 增溶溶解 …… 盐析 （ 粗品 ）
（ 2） 分离纯化 …… 离子交换,凝胶层析,亲合层析
,先粗后细逐步纯化,……… 纯品
（ 二 ） 免疫原 （ 抗原 ） 的准备免疫原＝抗原＋佐剂 （ 可溶性 ）,颗粒性抗原,不加佐剂,直接用于免疫 。
1.选取高纯度的抗原,调整蛋白浓度
（ 1～ 2mg/ml）
2.确定免疫原剂量初次免疫 小动物 1mg /ml ± （ 1～ 10mg）
大动物 20mg /ml ± （ 50～ 100mg）
加强免疫 首次免疫剂量的 1/5～ 2/5
原则：
取小不取大,视抗原的免疫原性而定微量法不易产生高效价抗体大量法易产生免疫耐受或免疫麻痹,甚至过敏致死制备高特异抗体 … 低剂量,短程免疫制备高效价抗体 … 大剂量,长程免疫
3,佐剂应用,乳化充分 （ 非特异免疫增强剂 ）
（ adjuvent）
完全,羊毛脂＋液体石蜡＋卡介苗弗氏佐剂 1 3～ 5 1～ 20mg
Freund’s 不完全 （ 半 ）,羊毛脂＋液体石蜡
（ 三 ） 免疫动物
1.动物选择 种系远,适龄 （ 年轻 ）,健壮,
无病,雄性,实验室 （ 小动物 ）,兔 （ 新西兰种,
2～ 4kg（ 2.5kg） ； 生产单位 （ 大动物 ） 马,骡等
（ 数量 2只以上 ）
2.免疫方案 剂量,次数,途径,间隔时间等 …… 多点,皮内或皮下；首次 +完全佐剂,再次
＋半佐剂,末次不加佐剂 （ iv） ；间隔时间 2～ 4
周；加强免疫次数 2～ 4次；自第二次加强免疫前,
少量采血测抗体效价监控 （ 1,16以上 ）
3.采血,分离血清 （ 抗血清 ）
小动物放血处死；大动物活体股 A采血,200ml/
只； （ 兔颈 A放血,60～ 70ml/只,小鼠球后 A放血,1ml/只 ）
4.纯化,分离 IgG
（ 四 ） 免疫球蛋白 （ IgG） 的分离纯化
（ 综合法 ---盐析＋层析 ）
1,理化方法 ……… 盐析 （ 中性盐 ） 粗制品
（ NH4） 2SO4； NaCL等依据蛋白质的不同沉淀系数或溶解度
50％ 饱和度 …… rG（ 95％ ） ＋其它球蛋白
33％ 饱和度 …… rG（ IgG） 80~90%回收率
2.层析 …… 离子交换,分子筛凝胶,亲合层析 … 纯品要求,载体活化,装柱标准,平衡充分,分部收集,防止变性阴离子交换剂 ----二乙氨乙基纤维素 （ DEAE）
离子交换剂 pH7.0~9.0 ---11.22（ 粗 ） ； 32.52（ 细 ）
ion-exchange 阳离子交换剂 …… 羧甲基纤维素 （ CM）
agents化学纯 pH4.5~6.0 纤维素凝胶过滤法 ----葡聚糖凝胶,琼脂糖凝胶,聚丙乙烯凝胶
（ 分子筛 ） Sephadex Sepharose Bil-gel
Pharmacia瑞典 G50－ G200 4B或 6B
（ 五 ） 质量鉴定与保存
1,纯化品 （ IgG或抗原蛋白 ）
脱盐 （ 透析或分子筛凝胶过滤 ）
↓ Sephadex G50
浓缩 （ 聚乙二醇 PEG）
2,测定蛋白含量 紫外线吸收法 （ OD280）
或化学滴定 （ 双缩脲或酚试剂 ）
纯度 免疫电泳,凝胶电泳活性 效价 ---双扩散,Elasa
3,分装,冻干,低温保存液体 …… 原装高浓度 － 20℃ 数月稀释低浓度 4℃ 或 -20℃ 1～ 2周冻干 4℃ 或 -20℃ 1～ 2年单克隆抗体的制备及其应用单克隆抗体是指由单个克隆的杂交瘤细胞产生针对一种抗原决定簇的特异性抗体 。 它是采用 B淋巴细胞杂交瘤技术（抗体的细胞工程）制备的。
一,利用杂交瘤技术制备 McAb的基本原理
（ 一 ） 淋巴细胞产生抗体的克隆选择学说,即一个 B细胞克隆只产生一种抗体；
（ 二 ） 细胞融合技术产生的杂交瘤细胞可以保持双方亲代细胞的特性；
（ 三 ） 利用代谢缺陷补救机理筛选出杂交瘤细胞,并进行克隆化,然后大量培养增殖,制备所需的 McAb。
二,McAb的制备流程亲本细胞准备 →细胞杂交融合 （ PEG）
→HAT选择性培养 →杂交瘤细胞克隆性培养与建株 （ 有效稀释法 ） →大量制备单克隆抗体 →质量鉴定与分装冻存
↓（ 扩大培养或接种动物 ）
（ 杂交瘤细胞冻存与复苏 ）
McAb的制备流程抗原免疫免疫脾细胞 小鼠骨髓瘤细胞
(BALB/C小鼠 ) （经 8-AG或 6-TG诱导）
(亲本细胞 )
混合、融合（ PEG）
选择性培养（ HAT）
筛选和克隆化冻存 阳性细胞建株（稳定分泌 McAb）
（杂交瘤细胞）
复苏 McAb大量制备（上清或腹水 ---鼠）
稳定性检查 纯化、鉴定（特异性、活性、含量）
三 亲本细胞准备
（ 一 ） 免疫小鼠 （ BALB/C） 脾细胞悬液的制备
1,取 BALB/C小鼠 8～ 12周龄,健康,雄性,
2只以上
2,免疫原制备 （ 抗原＋佐剂或不加佐剂 ）
免疫方案：常规法 （ 多点皮下,多次 ）
脾内注射一次法
3,取脾分离免疫脾细胞 （ 免疫疗程结束后 3～
4d）
4,镜检活细胞率达 90％ 以上,培养液稀释成
108 （ 台盼兰染色,死细胞着染 ）,备用
（ 二 ） 小鼠骨髓瘤细胞悬液的制备 （ SP2/0,NS
－ 1）
1,冻存细胞复苏后,置入含 10％ 新鲜小牛血清的 RPMI-1640培养液中,5％ CO2,37℃ 温箱中培养,每 2～ 3d换液一次,3～ 5d传代一次；
2,取生长良好的瘤细胞 （ 圆形明亮,排列整齐,
形态完整,密度适宜 1× 106）,台盼兰染色 -
镜检活细胞率大于 90％ 以上,备用 （ 对数生长,中期 ） ;
3,实验用小鼠骨髓瘤细胞应每隔 3～ 6个月,将复苏细胞在含有 8-AG或 6-TK培养液中培养一次,去除回复突变细胞 。
四 细胞融合 （ PEG）
A,免疫脾细胞 （ 108） ＋ B.骨髓瘤细胞 （ 酶缺陷,107） （ 10,1）
1,融合操作按比例 （ 10,1） 将免疫后脾淋巴细胞 （ A） 与经处理的缺陷型骨髓瘤细胞 （ B）
混合,加入 20 ～ 50ml RPMI-1640 液,
1000rpm 10min,弃上清,37℃ 水浴中,
吸取 1ml 37℃ 预温的 50％ PEG缓慢滴入,
1min内加完,37℃ 静置 1min,再滴加入完全培养液 （ 1min中加完 ）,尔后加 1640液至 50ml,终止 PEG作用 。 800rpm× 10min
弃上清,沉淀细胞悬浮后转入选择性培养 。
2,细胞融合剂一聚乙二醇的特牲聚乙二醇 （ polyethylene glycol,PEG）
是乙二醇的多聚化合物,存在一系列不同分子量的多聚体 。
PEG可与水分子借氢键结合,在高浓度 （ 50％ ） 的 PEG溶液中自由水消失,导致细胞脱水而发生质膜结构的变化,由此引起细胞膜融合 。 所以在细胞融合试验中多采用较高浓渡 （ 40％ ～ 50％ ）,MW为
6000。 但在 PEG的高浓渡下,
细胞可因脱水显著而遭受破坏,故实际工作中有时在 PEG溶液中加入适量的凝集素
（ 如 Con-A等 ）,此时 PEG的浓度可降低至 20％ ～ 30％,而细胞融合效率反而提高 2～ 3倍,这是因为凝集素与膜结构糖链特异结合,空间构型发生改变有利于细胞融合 。 凝 集 素 添 加 浓 度 常 为 PEG 的
1/103~104。
优点：
① 易制备,好控制；
② 活牲稳定；
③ 使用方便 。
缺点：
①对细胞有毒牲，尤其是高浓度；
②细胞融合率低，约为 1× 10－ 5;
③ 不能在显微镜下直接观察其细胞融合过程。
3,饲养细胞的制备在体外细胞培养中，单个或少数细胞不易生长与增殖，需加入其他活细胞共同培养，才可能使之生存。加入的细胞称为饲养细胞（支持与辅助体外细胞生长增殖的细胞）。
常用的饲养细胞有,小鼠腹腔巨噬细胞,脾细胞、胸腺细胞、传 代胚胎纤维母细胞等。
小鼠腹腔巨噬细胞的制备：
取 8～ 10周龄同系小鼠，断颈处死，无菌操作腹腔内注射 10～ 15ml完全培养液，
用消毒拇指轻揉腹部数次后，吸回腹腔液体，计细胞数。用培养液调整细胞浓度为
1～ 105/ml，备用。一般一只小鼠腹腔液可获取细胞 3× 106～ 5× 106，可供一次融合用
（亦可取两只小鼠腹腔巨噬细胞混合使用）。
融合前一天,在 96孔板中先用饲养细胞培养,0.1ml/孔 （ 含 104细胞 ）,融合时弃培养液,再分别加入混合细胞悬液 。
五 杂交瘤细胞的选择性培养 （ HAT）
（ 一 ） 原理亲本细胞杂交融合后,除了所需的杂交瘤细胞外,还存在自身融合的 4倍体细胞和未融合的二倍体亲本细胞,后者必需予以清除,为此目的,一般选用 HAT培养基进行筛选性培养,其原理是：
在 HAT培养液中，细胞合成核酸的主要途径被氨基喋呤（ A）阻断，而用于细胞融合的骨髓瘤细胞均系预先经过 8-氮鸟嘌呤等处理，而缺少 HGPRT（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶 ）或 TK（胸腺嘧啶激酶），其合成核酸的补救途径也被阻断；脾细胞虽含有 HGPRT或 TK，但它们在体外难以长时间存活（一般只能存活 5～ 7天）。
只有骨髓瘤细胞和脾细胞融合后所形成的杂交瘤细胞，由于可从脾细胞中获得所缺乏的酶类，又具有在体外培养条件下不断生长的能力，故能在含 HAT培养液中通过补救途径合成核酸而继续生长繁殖。
DNA合成途径 经典 补救次黄嘌呤（ H）
HGPRT
氨基酸氨基喋呤（ A）切断 核糖核苷酸
DNA
糖 核糖核苷
TK
胸腺嘧啶（ T）
（ 二 ） 方法,融合后 3～ 5d换一次 HAT培养液,每次吸出培养孔旧液 1/2,加入新液,
连续 2周 。 3～ 5天后未融合及自身融合的细胞逐渐死亡 。 1周左右可出现克隆,并不断增殖,当集落大于 3mm或布满孔底
1/2时,即可取上清作抗体活性检测,并补加新鲜 HAT培养液,培养 3周后改用普通完全培养液,进一步克隆化培养 。
理想的融合试验,约 70％ ～ 80％ 孔有细胞克隆生长 。
六 杂交瘤细胞克隆性培养与建株
（ 有限稀释法 ）
目的,筛选获得单个分泌抗体的杂交瘤细胞原理,f (0) =e-1 (poisson公式 )
λ＝ 1 f（ O） =0.37
即约有 37％的培养孔无细胞生长,63％孔有细胞生长，其中半数含单个细胞，另一半孔可能超过 1个细胞，如果再次倍比稀释，不断降低细胞密度，就可增加获得单个细胞的机率。
例,10个细胞 /10ml→0.1ml/孔，分别接种 100个培养孔。理论上计数，平均每孔 1个细胞。
方法,先从选择性培养后的孔内吸出细胞悬液作细胞计数,测出 1ml的细胞数,用
HT培养液稀释至细胞浓度达 50～ 60个 /ml。
尔后分别加到 96孔板,每孔加 0.1ml（ 约
5～ 6个细胞 /孔 ）,一般接种两排,剩余的细胞悬液作倍比稀释,再接种两排,
如此类推,直至每孔含细胞 0.5～ 1个,培养 7～ 10d后,选择单克隆阳性抗体细胞孔再一次克隆,如此重复 3～ 5次,直至 100
％ 阳性孔时为止,以确保抗体是由单个克隆细胞所产生 。
本法简便、效果好，已广泛被采用。
（其它克隆化方法，尚有：软琼脂法，显微挑选法。 FACS---流式细胞光度分析法等，详见讲义 p20）
体外细胞培养的一些基本知识原代细胞 （ 异性细胞 ） 培养 …… 原代培养传代细胞 （ 同性细胞 ） 培养 …… 传代培养永久性传代细胞 ………… 细胞株 （ 建株细胞 ）
特点：代间细胞特性稳定,较少退化,
1～ 4周体外细胞的生长过程 ---接种 →生长 →传代体外培养细胞,条件适宜,即生长增殖 。 但在培养皿或瓶中,细胞繁殖到一定程度后,即细胞占满,养料耗尽,若不及时传代,原代细胞将会导致死亡,原代细胞传代后即成细胞系 （ 无限生长 ） 。
体外培养细胞生长过程可分三个阶段：
滞留期 （ 悬浮 →潜伏 ） 24～ 96h；指数生长期 （ 对数 ） 3～ 5d;平台期 （ 停止 ） 分裂停止 。
七 制备单克隆抗体
（ 扩大培养或接种动物 ）
前者纯度高,后者得率高,需纯化
1,扩大培养 （ 无血清培养液作悬浮培养法,培养罐法等 ） …… 取上清,量约
10～ 100mg/ml。
2,体内诱导法 （ 接种动物 ） …… 腹水或血清腹水型 McAb的制备：取健康适龄
（ 8～ 10周 ） BALB/C小鼠,先于小鼠腹腔注射 0.3ml降植烷 （ pristane） 或石蜡油,
7～ 10d后每只小鼠腹腔注射阳性克隆杂交瘤细胞悬液 0.5× 106～ 5.0× 106（ 1× 108）
个 /ml,待小鼠腹部明显膨大时即可收取腹水,离心后分装,－ 20℃ 备用或冻干保存 。
质量与细胞数,分泌特性有关 。 少则腹水形成慢,但抗体效价高；多则腹水形成快,
可出现血性腹水,质低 。
血清型 McAb的制备 （ 皮下移植瘤 →分离血清 ）
含量 1～ 10mg/ml
八 McAb的质量鉴定（含杂交瘤细胞）
分泌型杂交瘤细胞 …… 染色体数目
（ 秋水仙素裂解 ）
McAb类型 …… 琼脂双扩散,ELISA法 --夹心用不同 IgG亚型作抗原
McAb特异性 … 免疫电泳法,ELISA法,IH
McAb效价 … 凝集,沉淀,琼脂双扩散,
ELISA
腹水效价 5× 104～ 106为合格
McAb的亲合力 … ELISA法识别抗原表位 … 竞争抑制试验九 杂交瘤细胞的保存与复苏
－ 196℃ 液氮中冻存（逐步降温），冻存液配置（ 30％～ 40％小牛血清＋ 50％～
60％不完全 RPMI－ 1640培养液＋ 10％
DMSO）；细胞浓度～ 5× 106个 /ml；存活数年。
复苏培养,取出细胞冻存管,立即投入 38℃ ～ 40℃ 水浴中解冻,然后用 RPMI－ 1640培养液洗 2次,再用完全培养液配成细胞悬液,移入多孔培养板,37℃,5％ CO2温箱培养 。 传代
2～ 3次 。 死亡细胞多时,可加饲养细胞同时培养 。
单克隆抗体（ McAb）
的应用一、特异性抗原的制备二、临床免疫诊断试剂（ ELISA）
三、免疫组化示踪与杂交组化桥连放大试剂
------用于诊断、鉴别诊断与基础研究四、导向治疗与基因阻断治疗
------交叉、稀释、变异、阻断封闭、不均一等不足，治疗应用还受到一些限制。
鼠源性 McAb对人体有较强的免疫原性,可产生人抗鼠抗体 （ HAMA） ；
制备人的 McAb,由于在肿瘤部位的摄取量甚少,比裸鼠荷瘤模型低 2～ 3个数量级,加之生产成本高,制备时间长,
难以普及应用 。
方向,基因工程技术构建 McAb
人 -鼠嵌合抗体,人源化抗体,单链抗体,抗体库 （ V-鼠,C-人 ）
附录,抗体的分子结构
1.抗体分子在立体构型上都 是 Ig,但 Ig不都是抗体。
2.各类 Ig的基本单位都是四条肽链的对称结构,包括二条相同的重链 (heavy chain,
H链 ),及二条相同的轻链 (light chain,L链 ),每条重链 (H链 )和轻链 (L链 )分为氨基端 (N端 )
和羧基端 (C端 )。
3,两条重链间，两条轻链间及重链和轻链间，分别借二硫键连接。此为免疫球蛋白的基本结构，又称为免疫球蛋白的单体,呈,Y”字构型。
4.重链上结合有不同量的糖,故 Ig属糖蛋白。
根据重链抗原性的不同可分为 5类，即 μ链，
γ 链,α链,δ链和 ε链,由它们组成的 Ig分别称为 IgM,IgG,IgA,IgE和 IgD。
5.轻链也可根据其化学结构和抗原性的差异分为 κ和 λ二型。一个 Ig分子的二条轻链型别相同，绝无可能 κ型和 λ
型共同存在于同一个 Ig分子中。
6,Ig单体的氨基酸序列可分为恒定区
（ constant region,C区 )和可变区（ variable
region,V区）。可变区位于 Ig多肽链的 N端，
占轻链的约 1/2及重链的约 1/4，是 Ig结合抗原的所在部位。恒定区位于 Ig多肽链的 C端，
占轻链的余下的 1/2及重链的 3/4，是补体结合域,Fc受体结合位点,Ig 抗原决定簇等所在部位。
7,Ig的水解片断可因选用的水解酶不同而异 。 采用 木瓜蛋白酶 (papain)水解
Ig时,可得到 2个相同的 Fab段即抗原结合片断 (fragment antigen binding，
Fab) 和 1 个 Fc 段 即 可 结 晶 片 断
（ fragment crystalliable,Fc),拥有 IgG
抗原决定簇 。
采用 胃蛋白酶 （ pepsin），其酶切位点在 Ig重链间二硫键近羧基端，产生两个片断,一个具有双价抗体活性的
F(ab’)2片断，另一个为不具任何免疫活性的 Fc’片断。
8.抗体的蛋白类型主要为 IgG和 IgM。
IgM见于初次免疫和免疫早期,滞留时间较短 。
IgG一般见于加强免疫和免疫晚期，
滞留时间较长，是免疫球蛋白的主要类型。
