** 第七章免疫组化结果的分析和判断
（要求：理解,熟记,会用）
(p120)
第一节 免疫组化结果的判断原则免疫组化结果的判断原则概括起来有以下几点：
⒈ 必须同时设对照染色 。 没有对照染色的免疫组化染色结果是不可信的 。
⒉ 抗原表达必须在特定部位 。 如 LCA应定位在细胞膜上； CK应定位在细胞浆内；
PCNA及 p53蛋白应定位在细胞核内； EMA应定位在细胞膜上,等等 。 不在抗原所在部位的阳性着色,一概不能视为阳性 。
⒊ 阴性结果不能视为抗原不表达 。 由于检测方法灵敏度有高低之分,有时可因染色方法灵敏度不够,而导致阴性反应,
判断时应注意 。
⒋ 尽量避开出血,坏死及切片刀痕和界面边缘细胞的阳性表达,特别是酶免疫标记 。 因为这类阳性着色多系内源干扰,或系人为因素所致 。
⒌ 对免疫组化标记结果的意义不能绝对化,应结合临床资料,X线等影像学及实验结果综合分析 。
* 第二节对照染色设计
(一 ） 对照染色的目的设对照的目的是为了排除假阴性和假阳性 。 假阴性的原因主要有三,① 组织处理不当,抗原丢失过多或被遮蔽； ② 抗体失活,效价过低或稀释度不合适 （ 主要指一抗,即特异性抗体 ） ； ③ 染色步骤遗漏及差错,或显色剂的选择,缓冲液的 pH
和离子强度不当等 。
假阳性均系由多种因素造成的非特异着色所致，原因主要有,①自发荧光或内源酶等干扰；②抗体试剂不纯 (特别是一抗）；③操作失误，如污染、切片干枯或显色剂操作不当等；④ Fc受体的干扰，等等。
（ 二 ） 对照的种类及其选用目的对照染色大致可分为,阳性组织对照,阴性组织对照 及 阴性试剂对照和 自身对照 四大类,
⒈ 阳性组织对照 指用已证实含有靶抗原的同源及不同源组织切片或细胞涂片与待检实验切片同时作同样处理和免疫染色的组织对照 。 正确的结果应呈现阳性
,目的是为了证实所用免疫组化染色流程的有效性,排除假阴性的可能 。
⒉ 阴性组织对照 指用已证实不含靶抗原的同步处理和免疫标记染色的组织对照 。 正确的结果应为阴性,目的是除外假阳性 。
⒊ 阴性试剂对照 是指用于证实在免疫组化染色中所用试剂,尤其是特异性抗体试剂的有效性和可靠性而所设立的同步免疫染色对照,包括有,空白对照；
替代对照；吸收试验和抑制试验 等 。 目的在于除外假阳性和证实所用免疫组化试剂及其技术方法的有效性和待检实验切片免疫标记阳性结果的可靠性 。
⑴ 空白对照 指以缓冲液 （ PBS,TBS
等 ） 取代第一抗体 （ 主要的,必要时还可做第二抗体及桥联抗体的空白取代 ）
,其他各步不变的试剂对照染色,结果应为阴性 。
⑵ 取代对照 指以所用方法第一抗体同源动物的正常血清,或与本实验无关的抗体 (靶生物缺如的 )取代第一抗体,其他步骤不变的试剂对照染色,结果应为阴性 。
⑶ 吸收试验 是指用事先经过量抗原吸收的第一抗体上清液取代第一抗体,其他步骤不变的免疫染色试剂对照 。 结果应是阴性或阳性着色明显减弱 （ 吸收不全时 ） 。
⑷ 抑制试验 是指用标记抗体和未标记抗体 （ 可以是一抗,也可以是二抗或桥抗体 ） 两者的混合物作试剂,其他步骤不变的免疫组化染色试剂对照,结果其阳性着色应成比例的减弱 （ 等量或 1,9）
。 此试剂对照多用于直接法 。
这类阴性试剂对照的 选用原则 是：
① 空白对照不能省,其他对照在预实验中应尽量多做,尤其是应用新抗体试剂； ② 对照必需与实验片同步进行染色；
③ 对照的结果应附合要求 。
⒋ 自身对照 是指在同一标记切片上的自身组织成分的阴性背景对照 。 即与靶抗原阳性反应细胞或成分相邻的阴性背景结构的显色,结果应为阴性或着色较浅,需与阳性着色成分呈鲜明对比 。 目的在于排除内源性干扰产生的假阳性和因抗原弥散移位造成的错误结果 。
* 第三节非特异染色非特异染色 是指免疫组化染色过程中产生的非靶抗原的呈色结果，属假阳性，又称背景着色，能严重干扰免疫组化染色结果的正确判断，应竭力避免或减轻。其原因涉及免疫组化染色流程的各个环节，可来自：
① 内源性干扰 (自发荧光,内源酶,内源性生物素等 )；
② 试剂污染 (质量差,交叉反应,Fc受体干扰等 )；
③ 组织处理不当 (组织固定不及时或固定不良所导致的抗原弥散移位,洗涤不充分所导致的游离试剂残留等 )。
纠正的方法视原因而异,可在预实验基础上,采用有针对性的纠正对策,
即对症下药 (具体纠正方法不展开讲了,
同学们可以自己阅读讲义 p123-126)。
**第四节阳性标记的形态特征和判断免疫组化标记具有一定形态特点,
若能熟练掌握则有助于对免疫组化标记结果的正确判断 。 内容包括定性,定位和定量三方面 。
免疫显色强度和阳性细胞密度是定性定量指标,实际工作中常采用强度和密度结合的方法综合计量,与抗原含量有关；阳性细胞的着色形态及组织分布特点主要是定位指标,与功能有关 。
一,阳性标记免疫特征：分 "弱 (+)
,中 (++),强 (+++)"三级 。 免疫荧光法 （
FITC为例 ） 则表现为浅绿色荧光,明显绿色荧光和亮绿色耀眼荧光；
免疫酶标记 （ HRP- DAB/H2O2） 则表现为淡黄色细颗粒,棕黄色颗粒和褐黄色粗颗粒,后者耀眼易见 。 图像摄影
,原则上多取强阳性区域 。
二,阳 性 标 记 细 胞 学 特 征 （ 以 HRP-
DAB/H2O2为例 ） 可分为 ① 胞膜型； ② 胞核型； ③ 胞质 (浆 )型； ④ 微绒毛型和 ⑤ 复合型
（ 胞膜 -胞质兼有,胞核 -胞质兼有,或微绒毛 -胞质兼有 ） 等五种阳性细胞类型 。 这与抗原所在部位相关联,但应注意排除因组织固定不好引起的抗原弥散假象,尤其是复合型图像 。
三,阳 性 标 记 组 织 学 特 征 （ 以 HRP-
DAB/H2O2为例 ） 免疫组化染色阳性细胞在组织中的分布排列形式可以有如下 7种,①
局灶型； ② 弥漫型； ③ 片块型； ④ 网状型；
⑤ 腺管型； ⑥ 腔缘型和 ⑦ 菊团型,等 。 这主要取决于抗原抗体复合物在细胞内的分布和阳性细胞在组织内的群体分布特点 。
四,阳性标记强度特征 依照细胞阳性着色程度 （ 抗原含量 ）,可分为弱阳性
（ +） ┅ 1分；中等阳性 （ ++） ┅ 2分；
强阳性 （ +++） ┅ 3分 。 依照阳性细胞数量,可分为：弱阳性 （ +,指阳性细胞数在 25%以下 ） ┅ 1分；
中等阳性 （ ++,指阳性细胞数在 25%—
49%) ┅ 2分；强阳性 （ +++,指阳性细胞数在 50%以上 ) ┅ 3分 。 目前多采用积分综合计量 。 计算公式：两者相乘 （ 或相加 ） 。 大多主张 <3者为阴性,>4者为阳性,>6者为强阳性,至少随机观察 5-
10个 HPF,取其均值 。
第五节染色失败的可能原因免疫组化染色的 基本要求有二,①
实验切片的阳性抗原定位准确,呈色鲜明,背景着色浅或无,二者的比值应大于 1（ 阳性 /背景 ） ； ② 对照染色的结果应附合要求 。 否则,所得实验结果都是错误的,或为假阳性或为假阴性 。
假阳性是指实验切片呈阳性，阴性组织对照或阴性试剂对照也呈阳性的结果，谓之假阳性。其原因与内源性干扰
，试剂不纯，交叉反应等有关。
假阴性是指实验切片呈阴性,阳性组织对照及阴性试剂对照也均呈阴性的结果
,谓之假阴性 。 其原因与组织处理不当,
组织细胞抗原丢失或试剂错误 (如漏加,
错加,失效,变质等 ),操作失误等有关 。
对照结果判断：
表中 1～ 5结果无效,6,7结果可靠
（＋）
（＋）
（＋）
（－）
（＋）
（＋）
（－）
检测标本含抗体，结果可靠（＋）（－）（－）7
检测标本不含抗体结合可靠（－）（－）（－）6
非特异染色（＋）（＋）（－）5
阳性对照不含定位抗原（＋）（－）（－）4
阴性对照内含定位抗原(＋ )(－ )（－）（＋）3
非特异性染色（＋）（＋）（＋）2
抗体失活，操作有误（－）（－）（－）1
结果判断检测结果替代对照阴性对照阳性对照染色失败原因：
均为阴性均为弱阳性（除阴性对照）
背景染色过深阳性对照好，待检标本弱阳性阳性对照无背景，待检标本背景深判断原则：
实验设计抗体选择抗原定位性抗原分布不均一性假阴性常见原因,抗原丢失或减弱抗体失效或稀释度不当操作失误假阳性常见原因,抗原弥散抗原异位表达瘤细胞吞噬病变中正常组织残留抗体交叉反应内源性物质着色边缘、刀痕、皱折、坏死或挤压区域不作为判断依据，应用,正反法,原则。
免疫组化标准化：
抗原特异性抗体交叉反应和标记谱系方法规范化结果综合分析和判断
（要求：理解,熟记,会用）
(p120)
第一节 免疫组化结果的判断原则免疫组化结果的判断原则概括起来有以下几点：
⒈ 必须同时设对照染色 。 没有对照染色的免疫组化染色结果是不可信的 。
⒉ 抗原表达必须在特定部位 。 如 LCA应定位在细胞膜上； CK应定位在细胞浆内；
PCNA及 p53蛋白应定位在细胞核内； EMA应定位在细胞膜上,等等 。 不在抗原所在部位的阳性着色,一概不能视为阳性 。
⒊ 阴性结果不能视为抗原不表达 。 由于检测方法灵敏度有高低之分,有时可因染色方法灵敏度不够,而导致阴性反应,
判断时应注意 。
⒋ 尽量避开出血,坏死及切片刀痕和界面边缘细胞的阳性表达,特别是酶免疫标记 。 因为这类阳性着色多系内源干扰,或系人为因素所致 。
⒌ 对免疫组化标记结果的意义不能绝对化,应结合临床资料,X线等影像学及实验结果综合分析 。
* 第二节对照染色设计
(一 ） 对照染色的目的设对照的目的是为了排除假阴性和假阳性 。 假阴性的原因主要有三,① 组织处理不当,抗原丢失过多或被遮蔽； ② 抗体失活,效价过低或稀释度不合适 （ 主要指一抗,即特异性抗体 ） ； ③ 染色步骤遗漏及差错,或显色剂的选择,缓冲液的 pH
和离子强度不当等 。
假阳性均系由多种因素造成的非特异着色所致，原因主要有,①自发荧光或内源酶等干扰；②抗体试剂不纯 (特别是一抗）；③操作失误，如污染、切片干枯或显色剂操作不当等；④ Fc受体的干扰，等等。
（ 二 ） 对照的种类及其选用目的对照染色大致可分为,阳性组织对照,阴性组织对照 及 阴性试剂对照和 自身对照 四大类,
⒈ 阳性组织对照 指用已证实含有靶抗原的同源及不同源组织切片或细胞涂片与待检实验切片同时作同样处理和免疫染色的组织对照 。 正确的结果应呈现阳性
,目的是为了证实所用免疫组化染色流程的有效性,排除假阴性的可能 。
⒉ 阴性组织对照 指用已证实不含靶抗原的同步处理和免疫标记染色的组织对照 。 正确的结果应为阴性,目的是除外假阳性 。
⒊ 阴性试剂对照 是指用于证实在免疫组化染色中所用试剂,尤其是特异性抗体试剂的有效性和可靠性而所设立的同步免疫染色对照,包括有,空白对照；
替代对照；吸收试验和抑制试验 等 。 目的在于除外假阳性和证实所用免疫组化试剂及其技术方法的有效性和待检实验切片免疫标记阳性结果的可靠性 。
⑴ 空白对照 指以缓冲液 （ PBS,TBS
等 ） 取代第一抗体 （ 主要的,必要时还可做第二抗体及桥联抗体的空白取代 ）
,其他各步不变的试剂对照染色,结果应为阴性 。
⑵ 取代对照 指以所用方法第一抗体同源动物的正常血清,或与本实验无关的抗体 (靶生物缺如的 )取代第一抗体,其他步骤不变的试剂对照染色,结果应为阴性 。
⑶ 吸收试验 是指用事先经过量抗原吸收的第一抗体上清液取代第一抗体,其他步骤不变的免疫染色试剂对照 。 结果应是阴性或阳性着色明显减弱 （ 吸收不全时 ） 。
⑷ 抑制试验 是指用标记抗体和未标记抗体 （ 可以是一抗,也可以是二抗或桥抗体 ） 两者的混合物作试剂,其他步骤不变的免疫组化染色试剂对照,结果其阳性着色应成比例的减弱 （ 等量或 1,9）
。 此试剂对照多用于直接法 。
这类阴性试剂对照的 选用原则 是：
① 空白对照不能省,其他对照在预实验中应尽量多做,尤其是应用新抗体试剂； ② 对照必需与实验片同步进行染色；
③ 对照的结果应附合要求 。
⒋ 自身对照 是指在同一标记切片上的自身组织成分的阴性背景对照 。 即与靶抗原阳性反应细胞或成分相邻的阴性背景结构的显色,结果应为阴性或着色较浅,需与阳性着色成分呈鲜明对比 。 目的在于排除内源性干扰产生的假阳性和因抗原弥散移位造成的错误结果 。
* 第三节非特异染色非特异染色 是指免疫组化染色过程中产生的非靶抗原的呈色结果，属假阳性，又称背景着色，能严重干扰免疫组化染色结果的正确判断，应竭力避免或减轻。其原因涉及免疫组化染色流程的各个环节，可来自：
① 内源性干扰 (自发荧光,内源酶,内源性生物素等 )；
② 试剂污染 (质量差,交叉反应,Fc受体干扰等 )；
③ 组织处理不当 (组织固定不及时或固定不良所导致的抗原弥散移位,洗涤不充分所导致的游离试剂残留等 )。
纠正的方法视原因而异,可在预实验基础上,采用有针对性的纠正对策,
即对症下药 (具体纠正方法不展开讲了,
同学们可以自己阅读讲义 p123-126)。
**第四节阳性标记的形态特征和判断免疫组化标记具有一定形态特点,
若能熟练掌握则有助于对免疫组化标记结果的正确判断 。 内容包括定性,定位和定量三方面 。
免疫显色强度和阳性细胞密度是定性定量指标,实际工作中常采用强度和密度结合的方法综合计量,与抗原含量有关；阳性细胞的着色形态及组织分布特点主要是定位指标,与功能有关 。
一,阳性标记免疫特征：分 "弱 (+)
,中 (++),强 (+++)"三级 。 免疫荧光法 （
FITC为例 ） 则表现为浅绿色荧光,明显绿色荧光和亮绿色耀眼荧光；
免疫酶标记 （ HRP- DAB/H2O2） 则表现为淡黄色细颗粒,棕黄色颗粒和褐黄色粗颗粒,后者耀眼易见 。 图像摄影
,原则上多取强阳性区域 。
二,阳 性 标 记 细 胞 学 特 征 （ 以 HRP-
DAB/H2O2为例 ） 可分为 ① 胞膜型； ② 胞核型； ③ 胞质 (浆 )型； ④ 微绒毛型和 ⑤ 复合型
（ 胞膜 -胞质兼有,胞核 -胞质兼有,或微绒毛 -胞质兼有 ） 等五种阳性细胞类型 。 这与抗原所在部位相关联,但应注意排除因组织固定不好引起的抗原弥散假象,尤其是复合型图像 。
三,阳 性 标 记 组 织 学 特 征 （ 以 HRP-
DAB/H2O2为例 ） 免疫组化染色阳性细胞在组织中的分布排列形式可以有如下 7种,①
局灶型； ② 弥漫型； ③ 片块型； ④ 网状型；
⑤ 腺管型； ⑥ 腔缘型和 ⑦ 菊团型,等 。 这主要取决于抗原抗体复合物在细胞内的分布和阳性细胞在组织内的群体分布特点 。
四,阳性标记强度特征 依照细胞阳性着色程度 （ 抗原含量 ）,可分为弱阳性
（ +） ┅ 1分；中等阳性 （ ++） ┅ 2分；
强阳性 （ +++） ┅ 3分 。 依照阳性细胞数量,可分为：弱阳性 （ +,指阳性细胞数在 25%以下 ） ┅ 1分；
中等阳性 （ ++,指阳性细胞数在 25%—
49%) ┅ 2分；强阳性 （ +++,指阳性细胞数在 50%以上 ) ┅ 3分 。 目前多采用积分综合计量 。 计算公式：两者相乘 （ 或相加 ） 。 大多主张 <3者为阴性,>4者为阳性,>6者为强阳性,至少随机观察 5-
10个 HPF,取其均值 。
第五节染色失败的可能原因免疫组化染色的 基本要求有二,①
实验切片的阳性抗原定位准确,呈色鲜明,背景着色浅或无,二者的比值应大于 1（ 阳性 /背景 ） ； ② 对照染色的结果应附合要求 。 否则,所得实验结果都是错误的,或为假阳性或为假阴性 。
假阳性是指实验切片呈阳性，阴性组织对照或阴性试剂对照也呈阳性的结果，谓之假阳性。其原因与内源性干扰
，试剂不纯，交叉反应等有关。
假阴性是指实验切片呈阴性,阳性组织对照及阴性试剂对照也均呈阴性的结果
,谓之假阴性 。 其原因与组织处理不当,
组织细胞抗原丢失或试剂错误 (如漏加,
错加,失效,变质等 ),操作失误等有关 。
对照结果判断：
表中 1～ 5结果无效,6,7结果可靠
（＋）
（＋）
（＋）
（－）
（＋）
（＋）
（－）
检测标本含抗体，结果可靠（＋）（－）（－）7
检测标本不含抗体结合可靠（－）（－）（－）6
非特异染色（＋）（＋）（－）5
阳性对照不含定位抗原（＋）（－）（－）4
阴性对照内含定位抗原(＋ )(－ )（－）（＋）3
非特异性染色（＋）（＋）（＋）2
抗体失活，操作有误（－）（－）（－）1
结果判断检测结果替代对照阴性对照阳性对照染色失败原因：
均为阴性均为弱阳性（除阴性对照）
背景染色过深阳性对照好，待检标本弱阳性阳性对照无背景，待检标本背景深判断原则：
实验设计抗体选择抗原定位性抗原分布不均一性假阴性常见原因,抗原丢失或减弱抗体失效或稀释度不当操作失误假阳性常见原因,抗原弥散抗原异位表达瘤细胞吞噬病变中正常组织残留抗体交叉反应内源性物质着色边缘、刀痕、皱折、坏死或挤压区域不作为判断依据，应用,正反法,原则。
免疫组化标准化：
抗原特异性抗体交叉反应和标记谱系方法规范化结果综合分析和判断
