免疫酶组织化学技术第二军医大学长海医院病理科马大烈
CK阳性肿瘤细胞组织来源 （中间丝标志物）
EMA阳性肿瘤的病因和发病机理研究
HBsAg阳性
（病毒及癌基因标志物）
肿瘤细胞功能分类
B
细胞阳性
（淋巴瘤及神经内分泌肿瘤标志）
肿瘤癌前病变和早期诊断
P53阳性
（
癌胚抗原或肿瘤相关抗原
）
肿瘤病理诊断与鉴别诊断
HMB45阳性
（
各种肿瘤特异性抗原
）
肿瘤治疗和预后判断
PR阳性
（性激素受体，癌基因和细胞增殖活性标志）
Cer-bB-2
Ki-67阳性第一节基 本 原 理抗原 ＋ 抗体 （ 特异性 ）
＋ 酶标记抗体,通过酶与底物作用生成有色反应物,
定位组织或细胞内抗原的一门技术 。
免疫酶组化免疫学
(抗原抗体反应 )
酶细胞化学
(底物显色反应 )
+
特异性 敏感性 定位性 可视性
PAP法免疫酶组织化学基本组成：
抗原
↓
抗体
↓
放大系统
↓
显色系统
ABC法免疫酶特点：
信号定位准确标本可长期保存阳性标记与病变关系方法简便,易推广第二节酶 和 底 物一,酶及其特点酶选择标准：
★ 该酶用细胞化学易于被检出,
能被光镜或电镜观察 。
★ 酶反应产物须稳定,不扩散,
具有良好定位 。
★ 酶易于纯化,获得纯制品 。
★ 酶与免疫球蛋白结合后,不丧失其活性 。
★ 酶在 PH中性液内较稳定。
★ 组织中不应存在与底物作用的内源性酶。
符合上述条件：
辣根过氧化物酶硷性磷酸酶葡萄糖氧化酶
（ 一 ） 辣根过氧化物酶 （ HRP）
★ 分子量 （ 40000）,不会遮盖抗原的结合部位
★ 稳定,易获得较高纯度酶
★ 具有较高活性及特异性
★ 可溶性佳,生成的产物不扩散
★ 组织中内源性酶较少
★ 可作用于多种底物,产生不同颜色
★ HRP穿透力强,易进入细胞内
（ 二 ） 硷性磷酸酶 （ AKP）
从小牛肠粘膜或大肠杆菌中提取
● 组织穿透能力较弱
● 内源性 AKP较高
● 左旋咪唑具有抑制作用
（ 三 ） 葡萄糖氧化酶 （ GOD）
底物为葡萄糖,终产物稳定
● 体内无内源性 GOD
● 分子量大,穿透力较弱二,底物及其特点酶 ＋ 底物 →酶 ·底物 →酶 ＋
产物 （ 显色 ）
HRP的底物：
HRP的底物为低浓度的 H2O2，
供氢体为胺类及酚类化合物。
HRP显色反应：
HRP＋ H2O2 HRP
＋ H2O＋ 电子供体 （ 氧化型 ）
电子供体电子供体被氧化后,迅速改变颜色,通过聚合等反应,生成不溶性有色颗粒,并就地原位沉淀 。
HRP常用的电子供体：
● 3.3-二氨基联苯胺 (DAB)～棕色
● 氨乙基卡巴唑 (AEC)～红色,易溶于有机溶剂,易扩散,用水溶性封固剂 。
● 4-氯 -1-茶酚 （ 4CN） ～蓝色,
易弥散,不能久保存
● 3.3,5.5-四甲基联苯胺 (TMB)
～黄色
AKP底物：
AKP常用的底物为 α-萘酚
AS-B1磷酸盐偶联试剂,固兰 BB～蓝色固红 TR～红色第三节酶标记抗体法酶标记抗体法 （ Enzayme
Labelled antibody） 是将酶通过共价键结合在抗体分子上,制备成酶标记抗体,通过抗体去寻找相应抗原 。
一,直接法原理,HRP标记在特异性抗体
（ 第一抗体 ） 上,抗原 ---
抗体 ● HRP复合物组织抗原第一抗体过氧化物酶直接法步骤,一步完成特点,方法简便,省时,专一性强,非特异染色轻,
但敏感性差,一种标记抗体只能检测一种抗原 。
二,间接法原理,HRP标记在第二抗体上,
抗原 ---特异性抗体 ---第二抗体 ● HRP复合物步骤,二步法组织抗原第一抗原第二抗体过氧化物酶间接法特点,敏感性较直接法高,一种标记抗体能用于相应动物制备的多种特异性抗体,检测多种抗原 。
但较直接法费时,非特异染色稍重 。
第四节酶 抗 酶 法
● 制备抗酶抗体
● 制备 PAP复合物酶桥法组织抗原第一抗体第二抗体第三抗体（抗酶抗体）
HRP
一,PAP法原理,抗原 ---特异性抗体 ---第二抗体 （ 桥抗体 ） ---
PAP复合物步骤,三步法组织抗原第一抗原第二抗体
PAP复合物
PAP法
HRP
特点：
敏感性较高,背景染色较轻但特异性抗体与 PAP必须为同一种属动物二,双 PAP法：
原理,在 PAP的基础上再重复第二抗体和 PAP复合物抗原 ---特异性抗体 ---第二抗体（桥抗体） ---PAP ---第二抗体 --- PAP复合物组织抗原第一抗原第二抗体
PAP复合物双 PAP法
HRP
双 PAP法组织抗原第一抗原第二抗体
PAP复合物
HRP
步骤,五步法特点,敏感性较高缺点,但步骤多,费时,非特异背景重三,APAAP法原理,抗原 ---特异抗体 ---第二抗体 --- APAAP复合物步骤,三步法
APAAP法特点,非特异背景较轻,不受内源性酶的干扰 。
但产物易溶于有机溶剂第五节卵白素 ---生物素法
Avidin为一种硷性糖蛋白,由四个相同亚基组成
Biotin小分子维生素
Avidin和 Biotin具有较高亲和力一,ABC法
Avidin Biotin Complex
原理,酶标记 Biotin形成酶素化
Biotin
酶素化 Biotin＋ Avidin --- ABC
复合物抗原 ---特异抗体 --- Biotin标记第二抗 --- Avidin ● Biotin ● HRP
组织抗原第一抗体第二抗体
HRP
生物素卵白素
ABC法步骤,三步法特点,敏感性较高,特异性强,
应用范围广
● 某些脏器存在内源性生物素干扰
● Avidin与核酸及细胞膜中磷脂有非特异反应
SABC法
Streptavidin biotin Peroxidase
Complex
SABC法已代替 ABC法二,LSAB法
Labelled Streptavidin Biotin
Method
原理,● Biotin标记第二抗体
LSAB法
● HRP标记 Avidin
抗原 ---特异性抗体 ---Biotin标记第二抗体 ---Avidin ● HRP复合物步骤,三步法特点,敏感性高,特异性强,
方法简便第六节多聚合物酶法多聚合物酶法
HRP---多聚合物 ---抗体一,Epos法
Enhanced polymer one-step
staining
组织抗原一抗
HRP
多聚骨架
EPOS 方法原理,采用一种具有惰性的多聚化合物作为骨架,将特异性抗体和 HRP,同时标记在多聚合物分子上,形成
HRP---多聚合物 ---特异性抗体 。
步骤,一步法特点,快速,简便,特异性强,
敏感性高但商品化种类不全,
价格昂贵二,EnVision法
Enhanced Labelled Polymer
System
原理,HRP ---多聚合物 ---第二抗体组织抗原一抗二抗酶多聚骨架第一步 第二步
EnVisionTM方法特点：
敏感性高,（ 1 mole复合物中含 70mole HRP和 10 mole第二抗体 ）
特异性强：
复合物内无内源性
Avidin和 Biotin的干扰。
第七节基本操作步骤
＊ 抗原修复
＊ 内源性过氧化物抑制
＊ 正常血清封闭
＊ 第一抗体
＊ 第二抗体
＊ 酶标记体
＊ DAB- H2O2显色第八节抗原定位及非特异染色组织细胞
＊ 固定问题
＊ 脱蜡不彻底
＊ 内源性过氧化物
＊ 内源性生物素抗原
＊ 抗原弥散
＊ 抗原异常表达
＊ 共同抗原决定簇特异性抗体
＊ 非特异吸附
＊ 抗体不纯
＊ 交叉反应第二抗体
＊ IgG交叉反应
＊ 二抗不纯标记物
＊ 质量
＊ 纯度
＊ 标记水平底物溶液
＊ DAB
＊ H2O2
操作
＊ 复染
＊ 抗体稀释度
＊ 孵育时间
＊ PAS洗涤第九节免疫酶方法评价
ESA
VIM
CA125
INV
VIM
CK
CD20
VIM
HPC
PR
PCNA
TOPO
Ki-67
P21
CK阳性肿瘤细胞组织来源 （中间丝标志物）
EMA阳性肿瘤的病因和发病机理研究
HBsAg阳性
（病毒及癌基因标志物）
肿瘤细胞功能分类
B
细胞阳性
（淋巴瘤及神经内分泌肿瘤标志）
肿瘤癌前病变和早期诊断
P53阳性
（
癌胚抗原或肿瘤相关抗原
）
肿瘤病理诊断与鉴别诊断
HMB45阳性
（
各种肿瘤特异性抗原
）
肿瘤治疗和预后判断
PR阳性
（性激素受体，癌基因和细胞增殖活性标志）
Cer-bB-2
Ki-67阳性第一节基 本 原 理抗原 ＋ 抗体 （ 特异性 ）
＋ 酶标记抗体,通过酶与底物作用生成有色反应物,
定位组织或细胞内抗原的一门技术 。
免疫酶组化免疫学
(抗原抗体反应 )
酶细胞化学
(底物显色反应 )
+
特异性 敏感性 定位性 可视性
PAP法免疫酶组织化学基本组成：
抗原
↓
抗体
↓
放大系统
↓
显色系统
ABC法免疫酶特点：
信号定位准确标本可长期保存阳性标记与病变关系方法简便,易推广第二节酶 和 底 物一,酶及其特点酶选择标准：
★ 该酶用细胞化学易于被检出,
能被光镜或电镜观察 。
★ 酶反应产物须稳定,不扩散,
具有良好定位 。
★ 酶易于纯化,获得纯制品 。
★ 酶与免疫球蛋白结合后,不丧失其活性 。
★ 酶在 PH中性液内较稳定。
★ 组织中不应存在与底物作用的内源性酶。
符合上述条件：
辣根过氧化物酶硷性磷酸酶葡萄糖氧化酶
（ 一 ） 辣根过氧化物酶 （ HRP）
★ 分子量 （ 40000）,不会遮盖抗原的结合部位
★ 稳定,易获得较高纯度酶
★ 具有较高活性及特异性
★ 可溶性佳,生成的产物不扩散
★ 组织中内源性酶较少
★ 可作用于多种底物,产生不同颜色
★ HRP穿透力强,易进入细胞内
（ 二 ） 硷性磷酸酶 （ AKP）
从小牛肠粘膜或大肠杆菌中提取
● 组织穿透能力较弱
● 内源性 AKP较高
● 左旋咪唑具有抑制作用
（ 三 ） 葡萄糖氧化酶 （ GOD）
底物为葡萄糖,终产物稳定
● 体内无内源性 GOD
● 分子量大,穿透力较弱二,底物及其特点酶 ＋ 底物 →酶 ·底物 →酶 ＋
产物 （ 显色 ）
HRP的底物：
HRP的底物为低浓度的 H2O2，
供氢体为胺类及酚类化合物。
HRP显色反应：
HRP＋ H2O2 HRP
＋ H2O＋ 电子供体 （ 氧化型 ）
电子供体电子供体被氧化后,迅速改变颜色,通过聚合等反应,生成不溶性有色颗粒,并就地原位沉淀 。
HRP常用的电子供体：
● 3.3-二氨基联苯胺 (DAB)～棕色
● 氨乙基卡巴唑 (AEC)～红色,易溶于有机溶剂,易扩散,用水溶性封固剂 。
● 4-氯 -1-茶酚 （ 4CN） ～蓝色,
易弥散,不能久保存
● 3.3,5.5-四甲基联苯胺 (TMB)
～黄色
AKP底物：
AKP常用的底物为 α-萘酚
AS-B1磷酸盐偶联试剂,固兰 BB～蓝色固红 TR～红色第三节酶标记抗体法酶标记抗体法 （ Enzayme
Labelled antibody） 是将酶通过共价键结合在抗体分子上,制备成酶标记抗体,通过抗体去寻找相应抗原 。
一,直接法原理,HRP标记在特异性抗体
（ 第一抗体 ） 上,抗原 ---
抗体 ● HRP复合物组织抗原第一抗体过氧化物酶直接法步骤,一步完成特点,方法简便,省时,专一性强,非特异染色轻,
但敏感性差,一种标记抗体只能检测一种抗原 。
二,间接法原理,HRP标记在第二抗体上,
抗原 ---特异性抗体 ---第二抗体 ● HRP复合物步骤,二步法组织抗原第一抗原第二抗体过氧化物酶间接法特点,敏感性较直接法高,一种标记抗体能用于相应动物制备的多种特异性抗体,检测多种抗原 。
但较直接法费时,非特异染色稍重 。
第四节酶 抗 酶 法
● 制备抗酶抗体
● 制备 PAP复合物酶桥法组织抗原第一抗体第二抗体第三抗体（抗酶抗体）
HRP
一,PAP法原理,抗原 ---特异性抗体 ---第二抗体 （ 桥抗体 ） ---
PAP复合物步骤,三步法组织抗原第一抗原第二抗体
PAP复合物
PAP法
HRP
特点：
敏感性较高,背景染色较轻但特异性抗体与 PAP必须为同一种属动物二,双 PAP法：
原理,在 PAP的基础上再重复第二抗体和 PAP复合物抗原 ---特异性抗体 ---第二抗体（桥抗体） ---PAP ---第二抗体 --- PAP复合物组织抗原第一抗原第二抗体
PAP复合物双 PAP法
HRP
双 PAP法组织抗原第一抗原第二抗体
PAP复合物
HRP
步骤,五步法特点,敏感性较高缺点,但步骤多,费时,非特异背景重三,APAAP法原理,抗原 ---特异抗体 ---第二抗体 --- APAAP复合物步骤,三步法
APAAP法特点,非特异背景较轻,不受内源性酶的干扰 。
但产物易溶于有机溶剂第五节卵白素 ---生物素法
Avidin为一种硷性糖蛋白,由四个相同亚基组成
Biotin小分子维生素
Avidin和 Biotin具有较高亲和力一,ABC法
Avidin Biotin Complex
原理,酶标记 Biotin形成酶素化
Biotin
酶素化 Biotin＋ Avidin --- ABC
复合物抗原 ---特异抗体 --- Biotin标记第二抗 --- Avidin ● Biotin ● HRP
组织抗原第一抗体第二抗体
HRP
生物素卵白素
ABC法步骤,三步法特点,敏感性较高,特异性强,
应用范围广
● 某些脏器存在内源性生物素干扰
● Avidin与核酸及细胞膜中磷脂有非特异反应
SABC法
Streptavidin biotin Peroxidase
Complex
SABC法已代替 ABC法二,LSAB法
Labelled Streptavidin Biotin
Method
原理,● Biotin标记第二抗体
LSAB法
● HRP标记 Avidin
抗原 ---特异性抗体 ---Biotin标记第二抗体 ---Avidin ● HRP复合物步骤,三步法特点,敏感性高,特异性强,
方法简便第六节多聚合物酶法多聚合物酶法
HRP---多聚合物 ---抗体一,Epos法
Enhanced polymer one-step
staining
组织抗原一抗
HRP
多聚骨架
EPOS 方法原理,采用一种具有惰性的多聚化合物作为骨架,将特异性抗体和 HRP,同时标记在多聚合物分子上,形成
HRP---多聚合物 ---特异性抗体 。
步骤,一步法特点,快速,简便,特异性强,
敏感性高但商品化种类不全,
价格昂贵二,EnVision法
Enhanced Labelled Polymer
System
原理,HRP ---多聚合物 ---第二抗体组织抗原一抗二抗酶多聚骨架第一步 第二步
EnVisionTM方法特点：
敏感性高,（ 1 mole复合物中含 70mole HRP和 10 mole第二抗体 ）
特异性强：
复合物内无内源性
Avidin和 Biotin的干扰。
第七节基本操作步骤
＊ 抗原修复
＊ 内源性过氧化物抑制
＊ 正常血清封闭
＊ 第一抗体
＊ 第二抗体
＊ 酶标记体
＊ DAB- H2O2显色第八节抗原定位及非特异染色组织细胞
＊ 固定问题
＊ 脱蜡不彻底
＊ 内源性过氧化物
＊ 内源性生物素抗原
＊ 抗原弥散
＊ 抗原异常表达
＊ 共同抗原决定簇特异性抗体
＊ 非特异吸附
＊ 抗体不纯
＊ 交叉反应第二抗体
＊ IgG交叉反应
＊ 二抗不纯标记物
＊ 质量
＊ 纯度
＊ 标记水平底物溶液
＊ DAB
＊ H2O2
操作
＊ 复染
＊ 抗体稀释度
＊ 孵育时间
＊ PAS洗涤第九节免疫酶方法评价
ESA
VIM
CA125
INV
VIM
CK
CD20
VIM
HPC
PR
PCNA
TOPO
Ki-67
P21
