第六章双重或多重免疫组化标记
(p111)
一,基 本 原 理双重或多重标记是利用免疫学和细胞化学原理,在同一张切片上同时采用或先后采用不同颜色的荧光色素或酶促产物,
或采用不同直径大小颗粒胶体金来原位示踪组织或细胞内不同抗原大分子物质的一项标记染色技术 。
由于此项技术可在同一张切片上同时显示两种或两种以上不同抗原成分 (定性,
定位,定量 ),因而使组织内不同抗原成分相互间功能关系的观察更加直观,操作需遵循的原则和要求基本上与单标免疫组化方法雷同,但差异是流程长,脱片机率更高,前后重染色试剂间有交叉干扰等 。
二、技术类型
（一）双重或多重免疫荧光标记染色采用呈现不同颜色的荧光色素配伍，
分别标记不同的抗体，再通过各自与同一切片上的相应抗原特异性结合而加以区别显示所建立起来的双重或多重免疫组化染色技术。
荧光素配伍,异硫氰酸荧光素
(FITC） —— 翠绿色，常与罗丹明 (RB200)
或异硫氰酸四甲基罗丹明（ TRITC）配伍，
后者呈红色。
方法敏感、特异,需选用各自特定的激发滤光片分别观察或二次曝光显影,样本不能长期保存，组织结构背景不清晰 。
技术类型有 直接法和间接法 之分。前者特异、快速，后者敏感、多用。
所用抗体试剂可为异种动物抗体，也可为同种动物抗体。
异种动物抗体常混合应用，操作步骤少，脱片率相对较低。
同种动物抗体多分别应用，操作步骤加倍，脱片机率相对较高，前后重免疫荧光标记交叉重叠机会多，需用酸性洗脱或多聚甲醛蒸气处理。
操作举例：垂体腺瘤 ----ACTH与 GH
双重免疫荧光标记染色（间接法）
(1)石蜡切片，厚 5μ m，常规二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，入 PBS(pH7.4,
0.01mol/L)。
(2)1％人血清白蛋白（ HAS）孵育 10min
（亦可用 10％正常羊血清代之），不洗。
(3)抗 ACTH血清（ McAb） 1:200，孵育
30min 37℃,湿盒。
(4)0.05mol/L TBS(pH7.4,内含 1％ Triten×
100,下同 )洗,10min× 3。
(5)羊抗鼠 IgG-TRITC 1:100，湿盒，室温避光反应 1h。
(6)0.05mol/L TBS(pH7.4)洗,10min× 3，
(第一重 ACTH-TRITC标记染色已完成 )。
(7)切片逐级酒精脱水，二甲苯透明，空气干燥后，置于装有多聚甲醛粉末的密闭容器内，放在 80℃ 烤箱或温箱内以甲醛蒸气固定 2～ 4h，使第一重染色中二抗的抗原结合部位失活。
(8)切片以 TBS洗,5min× 4
(9)1％ HSA（或 10％正羊血清）孵育
30min，室温，湿盒，不洗。
(10)抗 GH血清 (McAb) 1:400，孵育 30min，
37℃,湿盒。
(11)0.05mol/L TBS(pH7.4)洗,10min× 3
(12)羊抗鼠 IgG-FITC 1:100,湿盒，室温避光反应 1h。
(13)0.05mol/L TBS(pH7.4)洗,10min× 3
(第二重 GH-FITC标记染色完成 )。
(14)缓冲甘油封片。
(15)荧光显微镜下分别以 546nm及 490nm波长的激发光观察切片组织内 TRITC及
FITC所标示的 ACTH及 GH抗原（ TRITC
阳性细胞呈红色,FITC阳性细胞呈绿色）。
(16)用彩色底片对切片同一部位用
546nm及 490nm波长激发光分别作两次曝光，即可在同一张照片上显示不同颜色标示的 ACTH与 GH两种抗原。
TRITC-GAM
IgG
鼠抗人 ACTH
（ IgG）
TITC-GAM
IgG
鼠抗人 GH
（ IgG）
T 游离 Fab
T
T
T F
GH抗原
ACTH抗原 F
Fab被灭活图 1 同种动物抗体间接法（分步固定）双重免疫荧光荧色原理
（二）双重或多重免疫酶标记染色以酶催化不同底物呈现不同颜色产物标示同一切片内两种或两种以上抗原为理论基础所建立起来的多重免疫标记染色方法。特点是光镜下可以同时观察和对比，
样品保存时间相对较长，一次曝光即可成像，故较双重免疫荧光染色法更为常用。
★ 常用标记酶与底物的配伍单酶双底物 --HRP--DAB(棕色 ):4CN(蓝色 )
AEC(红色 ):4CN(蓝色 )
AP-萘酚 AS-MX-坚固红 (fast
red 红色 )-坚固蓝 (fast blue 蓝色 )
双酶双底物 --HRP(DAB):AP(萘酚 AS.MX-坚固蓝 )
HRP(4CN):AP(萘酚 AS.MX-坚固红 )
（直接法、间接法、桥法均可使用，灵敏度以桥法中的复合物法最高，特异性则以直接法最佳）
操作方法类同单酶标记，有直接法、
间接法、复合物法之分。
间接法与复合物法较常采用。
★ 操作举例 淋巴瘤轻链 κ,λ的双重酶标记（双酶双底物）
(1)石蜡切片常规脱蜡进水（若用含汞固定液固定的组织则需用 0.5%碘的乙醇溶液脱汞 5min，乙醇浓度为 70％，经自来水洗后，
以 2.5%硫代硫到钠浸洗 1min，水洗 )；
(2)0.3% H2O2甲醇液浸泡切片 30min,自来水洗，蒸馏水洗,入 PBS(0.01mol/L pH7.2);
(3)滴加正羊血清 1:10，湿盒，室温，
10min，不洗；
(4)加一抗 (抗人 κPcAb与抗人 λMcAb的混合液 )1:200，湿盒,37℃,45min或更长；
(5)PBS液,5min× 3
(6)加二抗 (GARG＋ GAMG混合液 1:200)，
温盒,37℃,30min；
(7)PBS洗,5min× 3;
(8)加酶抗酶抗体复合物 (兔 PAP＋鼠 APAAP
混合液 1:100)，湿盒,37℃,30min；
(9)PBS洗,5min× 3；
(10)过氧化物酶显色反应：以 DAB- H2O2
液显色 7～ 10min(镜下控制显色程度 )，
PBS洗,5min× 3；
(11)硷性磷酸酶显色反应：以萘酚 AS.MX
及坚固蓝 (fast blue)显色 10～ 15min(镜下控制显色程度 ),PBS洗、自来水洗；
(12)缓冲甘油封片，光镜下观察
P
P P A A
A
κ λ
图 2 双酶双底物 (复合物法 )双重酶标染色原理兔 PAP
GAR IgG
兔抗 K
Ag
鼠 APAAP
GAM,IgG
鼠抗人注,若用同种动物抗血清分别进行标记染色时，
尚需考虑在前后重染色之间是否设置,多聚甲醛蒸气处理 2-4h（封闭固定）或用 pH2.2的甘氨酸 ---盐酸溶液处理 2h（酸洗脱）的操作步骤,，目的为了避免前后重免疫试剂间的交叉反应。可视预实验结果来确定。
（三）双重及多重免疫金标记 (电镜）
电镜下的双重免疫标记染色不是靠颜色区分，而是靠标记物的不同电子密度或颗粒的不同大小来区别不同抗原，
有别于光镜下的双重免疫标记方法。
常用的方法多为双重免疫金标记优点,高电子密度，分辨率高，抗原定位精确，颗粒大小可人工控制，
标记试剂易制备。
缺点,试剂质量要求高，非特异吸附干扰大 (背景 )
类型有直接法、间接法（异种动物抗体或同种动物抗体） ----双面染色，分步固定。标记用的胶体金颗粒，直径多采用
5nm,15nm组合，标记不同类别抗体 (特异性一抗 ---直接法，间接抗体 ---间接法 )。
应用直接法进行多标，简便、快速、
准确、效果佳，尤多用于细胞表面抗原的双重或多重标记。
缺点,敏感性较低，金标抗体纯度要求高。
金标抗体双重抗原标记常用间接法显示，且多采用异种动物抗体混合同步操作。
优点,敏感性提高，操作步骤减少缺点,标记二抗质量要求高，背景染色深。
可通过采用固相吸附或过量二抗封闭，
或用多聚甲醛蒸气处理，使二抗的游离抗原结合部位（ Fab段）灭活加以克服。
*举例：垂体组织生长激素 (GH)和促肾上腺皮质激素 (ACTH)双重免疫电镜染色
(间接法 )----分步固定。
(1)取新鲜垂体腺瘤组织 1mm3，蒸馏水洗，
不经饿酸固定，常规酒精脱水，用
Lowicryl k4M包埋，超薄切片厚 40nm，置无支持膜的镍网上；
(2)以 0.05mol/L TBS(pH7.4含 1％ Triton
X-100，下同 )，浸洗 5min；
(3)加入 1％ HSA 5min；不洗；
(4)以兔抗 ACTH血清 (1:200)孵育,4℃,
20h，室温下 2h,TBS洗，用上述一抗重复孵育 1次,TBS喷射冲洗，然后浸洗
10min,3次,TBS (pH8.2)浸洗 5min；
(5)0.02mol/L TBS (pH8.2)浸洗 5min；
(6)1％ HSA孵育 5min，不洗；再以 5nm
胶体金标记的羊抗兔,IgG孵育 10min；
0.02mol/L TBS (pH8.2)喷射冲洗，
0.05mol/L TBS (pH7.4)冲洗及浸洗，时间同前；
(7)蒸馏水浸洗后，空气中干燥；
(8)置盛有多聚甲醛粉末的密闭容器内，
80℃ 温箱中以多聚甲醛蒸气处理 1h，冷却取出，入蒸馏水，换洗 2次。
(9)再按 (4)----(8)步骤作第二重抗原染色，
这次一抗用鼠抗 GH单克隆抗体 (1:400)；
二抗用 15nm胶体金标记的羊抗鼠 IgG，在二抗孵育并清洗后，入 2％的戊二醛及 3％
多聚甲醛的 TBS (pH7.4)溶液中固定 30min，
经蒸馏水换洗 3次，再以 1％醋酸铀和构橼酸铅作常规电子密度的染色。
(10)电镜观察结果：见 ACTH细胞和 GH细胞的分泌颗粒分别被 5nm和 15nm的胶体金颗粒所显示，除很少量背景染色外，标记位置精确，
无交叉重叠与弥散现象。
（四）其它双重标记法
1.免疫荧光法与免疫酶法联合应用 (先酶标后荧光 ) ；
2.免疫荧光法与免疫金银法联合应用 (先免疫金银标记后荧光标记 ) ；
3.免疫酶法与免疫金法联合应用 (20nm,红色），此法忌用银液放大，易吸附干扰；
4.免疫金银法与免疫酶法联合应用 (对比明显 )。
三,注 意 事 项
1.标记染色的顺序确定需视组织标记抗原的性质,量少,脆弱先标记,量多,耐受后标记 。
2.结构保存与抗原保护并重,电镜样品一般忌用饿酸后固定,PG固定液中的戊二醛
(G)浓度不宜超过 2％,光镜样品的固定剂类 型 和 固 定 时 间 的 选 择 也 应 如 此 ；
3.严格操作步骤,轻柔,洗涤应彻底,洗涤用的 TBS 中常加入 1 ％ Triton× 100 或
Saponin ；
4.保证试剂的清洁度与纯度 (双蒸水,亲和免疫层析 ),注意增强组织片与载玻片的粘合度,以减少脱片机率；
5,封片剂选择应注意显色剂的溶解特性,
一般多采用水封片 (10%缓冲甘油 ),保存时间不长,应及时观察记录 。
(p111)
一,基 本 原 理双重或多重标记是利用免疫学和细胞化学原理,在同一张切片上同时采用或先后采用不同颜色的荧光色素或酶促产物,
或采用不同直径大小颗粒胶体金来原位示踪组织或细胞内不同抗原大分子物质的一项标记染色技术 。
由于此项技术可在同一张切片上同时显示两种或两种以上不同抗原成分 (定性,
定位,定量 ),因而使组织内不同抗原成分相互间功能关系的观察更加直观,操作需遵循的原则和要求基本上与单标免疫组化方法雷同,但差异是流程长,脱片机率更高,前后重染色试剂间有交叉干扰等 。
二、技术类型
（一）双重或多重免疫荧光标记染色采用呈现不同颜色的荧光色素配伍，
分别标记不同的抗体，再通过各自与同一切片上的相应抗原特异性结合而加以区别显示所建立起来的双重或多重免疫组化染色技术。
荧光素配伍,异硫氰酸荧光素
(FITC） —— 翠绿色，常与罗丹明 (RB200)
或异硫氰酸四甲基罗丹明（ TRITC）配伍，
后者呈红色。
方法敏感、特异,需选用各自特定的激发滤光片分别观察或二次曝光显影,样本不能长期保存，组织结构背景不清晰 。
技术类型有 直接法和间接法 之分。前者特异、快速，后者敏感、多用。
所用抗体试剂可为异种动物抗体，也可为同种动物抗体。
异种动物抗体常混合应用，操作步骤少，脱片率相对较低。
同种动物抗体多分别应用，操作步骤加倍，脱片机率相对较高，前后重免疫荧光标记交叉重叠机会多，需用酸性洗脱或多聚甲醛蒸气处理。
操作举例：垂体腺瘤 ----ACTH与 GH
双重免疫荧光标记染色（间接法）
(1)石蜡切片，厚 5μ m，常规二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，入 PBS(pH7.4,
0.01mol/L)。
(2)1％人血清白蛋白（ HAS）孵育 10min
（亦可用 10％正常羊血清代之），不洗。
(3)抗 ACTH血清（ McAb） 1:200，孵育
30min 37℃,湿盒。
(4)0.05mol/L TBS(pH7.4,内含 1％ Triten×
100,下同 )洗,10min× 3。
(5)羊抗鼠 IgG-TRITC 1:100，湿盒，室温避光反应 1h。
(6)0.05mol/L TBS(pH7.4)洗,10min× 3，
(第一重 ACTH-TRITC标记染色已完成 )。
(7)切片逐级酒精脱水，二甲苯透明，空气干燥后，置于装有多聚甲醛粉末的密闭容器内，放在 80℃ 烤箱或温箱内以甲醛蒸气固定 2～ 4h，使第一重染色中二抗的抗原结合部位失活。
(8)切片以 TBS洗,5min× 4
(9)1％ HSA（或 10％正羊血清）孵育
30min，室温，湿盒，不洗。
(10)抗 GH血清 (McAb) 1:400，孵育 30min，
37℃,湿盒。
(11)0.05mol/L TBS(pH7.4)洗,10min× 3
(12)羊抗鼠 IgG-FITC 1:100,湿盒，室温避光反应 1h。
(13)0.05mol/L TBS(pH7.4)洗,10min× 3
(第二重 GH-FITC标记染色完成 )。
(14)缓冲甘油封片。
(15)荧光显微镜下分别以 546nm及 490nm波长的激发光观察切片组织内 TRITC及
FITC所标示的 ACTH及 GH抗原（ TRITC
阳性细胞呈红色,FITC阳性细胞呈绿色）。
(16)用彩色底片对切片同一部位用
546nm及 490nm波长激发光分别作两次曝光，即可在同一张照片上显示不同颜色标示的 ACTH与 GH两种抗原。
TRITC-GAM
IgG
鼠抗人 ACTH
（ IgG）
TITC-GAM
IgG
鼠抗人 GH
（ IgG）
T 游离 Fab
T
T
T F
GH抗原
ACTH抗原 F
Fab被灭活图 1 同种动物抗体间接法（分步固定）双重免疫荧光荧色原理
（二）双重或多重免疫酶标记染色以酶催化不同底物呈现不同颜色产物标示同一切片内两种或两种以上抗原为理论基础所建立起来的多重免疫标记染色方法。特点是光镜下可以同时观察和对比，
样品保存时间相对较长，一次曝光即可成像，故较双重免疫荧光染色法更为常用。
★ 常用标记酶与底物的配伍单酶双底物 --HRP--DAB(棕色 ):4CN(蓝色 )
AEC(红色 ):4CN(蓝色 )
AP-萘酚 AS-MX-坚固红 (fast
red 红色 )-坚固蓝 (fast blue 蓝色 )
双酶双底物 --HRP(DAB):AP(萘酚 AS.MX-坚固蓝 )
HRP(4CN):AP(萘酚 AS.MX-坚固红 )
（直接法、间接法、桥法均可使用，灵敏度以桥法中的复合物法最高，特异性则以直接法最佳）
操作方法类同单酶标记，有直接法、
间接法、复合物法之分。
间接法与复合物法较常采用。
★ 操作举例 淋巴瘤轻链 κ,λ的双重酶标记（双酶双底物）
(1)石蜡切片常规脱蜡进水（若用含汞固定液固定的组织则需用 0.5%碘的乙醇溶液脱汞 5min，乙醇浓度为 70％，经自来水洗后，
以 2.5%硫代硫到钠浸洗 1min，水洗 )；
(2)0.3% H2O2甲醇液浸泡切片 30min,自来水洗，蒸馏水洗,入 PBS(0.01mol/L pH7.2);
(3)滴加正羊血清 1:10，湿盒，室温，
10min，不洗；
(4)加一抗 (抗人 κPcAb与抗人 λMcAb的混合液 )1:200，湿盒,37℃,45min或更长；
(5)PBS液,5min× 3
(6)加二抗 (GARG＋ GAMG混合液 1:200)，
温盒,37℃,30min；
(7)PBS洗,5min× 3;
(8)加酶抗酶抗体复合物 (兔 PAP＋鼠 APAAP
混合液 1:100)，湿盒,37℃,30min；
(9)PBS洗,5min× 3；
(10)过氧化物酶显色反应：以 DAB- H2O2
液显色 7～ 10min(镜下控制显色程度 )，
PBS洗,5min× 3；
(11)硷性磷酸酶显色反应：以萘酚 AS.MX
及坚固蓝 (fast blue)显色 10～ 15min(镜下控制显色程度 ),PBS洗、自来水洗；
(12)缓冲甘油封片，光镜下观察
P
P P A A
A
κ λ
图 2 双酶双底物 (复合物法 )双重酶标染色原理兔 PAP
GAR IgG
兔抗 K
Ag
鼠 APAAP
GAM,IgG
鼠抗人注,若用同种动物抗血清分别进行标记染色时，
尚需考虑在前后重染色之间是否设置,多聚甲醛蒸气处理 2-4h（封闭固定）或用 pH2.2的甘氨酸 ---盐酸溶液处理 2h（酸洗脱）的操作步骤,，目的为了避免前后重免疫试剂间的交叉反应。可视预实验结果来确定。
（三）双重及多重免疫金标记 (电镜）
电镜下的双重免疫标记染色不是靠颜色区分，而是靠标记物的不同电子密度或颗粒的不同大小来区别不同抗原，
有别于光镜下的双重免疫标记方法。
常用的方法多为双重免疫金标记优点,高电子密度，分辨率高，抗原定位精确，颗粒大小可人工控制，
标记试剂易制备。
缺点,试剂质量要求高，非特异吸附干扰大 (背景 )
类型有直接法、间接法（异种动物抗体或同种动物抗体） ----双面染色，分步固定。标记用的胶体金颗粒，直径多采用
5nm,15nm组合，标记不同类别抗体 (特异性一抗 ---直接法，间接抗体 ---间接法 )。
应用直接法进行多标，简便、快速、
准确、效果佳，尤多用于细胞表面抗原的双重或多重标记。
缺点,敏感性较低，金标抗体纯度要求高。
金标抗体双重抗原标记常用间接法显示，且多采用异种动物抗体混合同步操作。
优点,敏感性提高，操作步骤减少缺点,标记二抗质量要求高，背景染色深。
可通过采用固相吸附或过量二抗封闭，
或用多聚甲醛蒸气处理，使二抗的游离抗原结合部位（ Fab段）灭活加以克服。
*举例：垂体组织生长激素 (GH)和促肾上腺皮质激素 (ACTH)双重免疫电镜染色
(间接法 )----分步固定。
(1)取新鲜垂体腺瘤组织 1mm3，蒸馏水洗，
不经饿酸固定，常规酒精脱水，用
Lowicryl k4M包埋，超薄切片厚 40nm，置无支持膜的镍网上；
(2)以 0.05mol/L TBS(pH7.4含 1％ Triton
X-100，下同 )，浸洗 5min；
(3)加入 1％ HSA 5min；不洗；
(4)以兔抗 ACTH血清 (1:200)孵育,4℃,
20h，室温下 2h,TBS洗，用上述一抗重复孵育 1次,TBS喷射冲洗，然后浸洗
10min,3次,TBS (pH8.2)浸洗 5min；
(5)0.02mol/L TBS (pH8.2)浸洗 5min；
(6)1％ HSA孵育 5min，不洗；再以 5nm
胶体金标记的羊抗兔,IgG孵育 10min；
0.02mol/L TBS (pH8.2)喷射冲洗，
0.05mol/L TBS (pH7.4)冲洗及浸洗，时间同前；
(7)蒸馏水浸洗后，空气中干燥；
(8)置盛有多聚甲醛粉末的密闭容器内，
80℃ 温箱中以多聚甲醛蒸气处理 1h，冷却取出，入蒸馏水，换洗 2次。
(9)再按 (4)----(8)步骤作第二重抗原染色，
这次一抗用鼠抗 GH单克隆抗体 (1:400)；
二抗用 15nm胶体金标记的羊抗鼠 IgG，在二抗孵育并清洗后，入 2％的戊二醛及 3％
多聚甲醛的 TBS (pH7.4)溶液中固定 30min，
经蒸馏水换洗 3次，再以 1％醋酸铀和构橼酸铅作常规电子密度的染色。
(10)电镜观察结果：见 ACTH细胞和 GH细胞的分泌颗粒分别被 5nm和 15nm的胶体金颗粒所显示，除很少量背景染色外，标记位置精确，
无交叉重叠与弥散现象。
（四）其它双重标记法
1.免疫荧光法与免疫酶法联合应用 (先酶标后荧光 ) ；
2.免疫荧光法与免疫金银法联合应用 (先免疫金银标记后荧光标记 ) ；
3.免疫酶法与免疫金法联合应用 (20nm,红色），此法忌用银液放大，易吸附干扰；
4.免疫金银法与免疫酶法联合应用 (对比明显 )。
三,注 意 事 项
1.标记染色的顺序确定需视组织标记抗原的性质,量少,脆弱先标记,量多,耐受后标记 。
2.结构保存与抗原保护并重,电镜样品一般忌用饿酸后固定,PG固定液中的戊二醛
(G)浓度不宜超过 2％,光镜样品的固定剂类 型 和 固 定 时 间 的 选 择 也 应 如 此 ；
3.严格操作步骤,轻柔,洗涤应彻底,洗涤用的 TBS 中常加入 1 ％ Triton× 100 或
Saponin ；
4.保证试剂的清洁度与纯度 (双蒸水,亲和免疫层析 ),注意增强组织片与载玻片的粘合度,以减少脱片机率；
5,封片剂选择应注意显色剂的溶解特性,
一般多采用水封片 (10%缓冲甘油 ),保存时间不长,应及时观察记录 。
