免疫胶体金组化技术主要内容一、免疫胶体金技术发展史二、溶胶的基本概念三、胶体金的制备方法四、胶体金探针制备五、光镜免疫金银组织化学思考题：
1.胶体金的概念，胶体金有哪些特性？
2.影响溶胶稳定性的因素有哪些？
3.制备胶体金的还原剂有哪几种？
4.有哪几种经典的胶体金制备方法？
5.胶体探针的纯化方式有哪二种，请叙述他们的过程？
6IGSS技术的优点有哪些？
7.IGSS技术存在的问题和克服的办法有哪些？
一、免疫胶体金技术发展史
1.1939年 Kausche和 Ruska把烟草叶病毒吸附在金颗粒上，电镜下观察呈高电子密度细颗粒状。
2.1971年 Faulk和 Taylor首先将兔抗沙门菌抗血清与胶体金颗粒结合，用直接
IHC检测沙门菌的表面抗原。
3.1974年 Romano和他的同事们将胶体金标记在马抗人 IgG上，实现了间接免疫金染色法。
同年 Bauer等报道将胶体金标记在凝集素上的应用。
4.1978年 Geoghegan等应用免疫金技术检测 B
淋巴细胞表面抗原。
5.1981年 Danscher建立了银显影液增强光镜下金颗粒的免疫金银染色方法
（ Immunogold-silver staining,IGSS）。
6.1986年 Fritz等人在 IGSS法基础上成功地进行了彩色 IGSS法,使得结果更加鲜艳夺目。
二、溶胶的基本概念
1.胶体金溶胶的概念,溶胶是指一种物质以或大或小的微小粒子分散在另一种物质中所形成的体系。被分散的物质叫分散相，容纳分散相的另一种物质称为分散介质。按分散相质点的大小不同，分三类。
(1)离子分散体系 分散相以小分子或离子状态存在（分散相粒子小于 1nm）。
具有高度的稳定性。
(2)胶体金分散体系 指分散相颗粒在 1～
100nm之间，外观透明不浑浊，在普通显微镜下看不见。
(3)粗分散体系 指颗粒大于 100nm，不稳定，显微镜下可见。
2.胶体金的一般性状
(1)胶体金的颜色 颗粒在 5～ 20nm
之间，吸收波长 520nm，呈红葡萄酒色；
20～ 40nm之间吸收波长 530nm，呈深红色；
60nm的金溶液主要吸收波长 600nm为橙黄色光，液体呈蓝紫色。
(2)胶体金的稳定性 其稳定介于小分子离子和粗分散体系之间，即稳定，又容易出现聚沉。影响溶胶稳定性的主要原因有三点：①胶粒间的相互吸引力；②
胶粒及其溶剂化层的带电情况；③胶体界面的溶剂膜。
(3)溶胶的聚沉现象 胶粒之间存在吸引力与排斥力这对矛盾，一旦平衡打破，
胶粒便聚结发生聚沉。引起溶胶聚沉的原因有：
① 少量电解质对溶胶的作用；
②温度对溶胶稳定性的影响：当温度升高时，吸附能力减少，溶剂化程度降低，溶剂化层变薄，胶粒聚结，不稳定性增加；
③浓度对溶胶的稳定性的影响 浓度增大时，粒子间距离缩小，引力增加，容易聚结而发生聚沉。
三、胶体金的制备
1.制备前的准备
(1)玻璃器皿的清洁 制备胶体金的成功与失败除试剂因素以外玻璃器皿清洁是非常关键的一步。
其清洁流程如下：清洁液泡 24h，自流水洗净，洗洁剂洗 3～ 4次，流水冲洗干净，蒸馏水洗 4～ 5次，烤箱烤干备用。如果条件允许，可将器皿进行硅化。
(2)试剂的配制要求 所有配制试剂的容器均按上述要求清洗，配制试剂用双蒸馏水或去离子水。
2.胶体金制备的方法胶体金的制备方法很多，其中应用较为广泛的方法是化学还原法。这一方法的基本原理是在氯化金水溶液中加入一定的还原剂，使金离子还原成金原子。可用于制备胶体金的还原剂有 50余种，但常用的还原剂仅以下三种：即白磷、柠檬酸三钠以及鞣酸。
(1)改良的白磷还原法 (Henegouwen,1986)
① 取 20％饱和度白磷乙醚溶液 0.5ml，加蒸馏水 60ml。
②加入 1％的 HAucl4水溶液 0.75ml，加
0.1mol/L K2CO3 0.6ml，振荡变成棕色。
③加热煮沸，至透明红色。
胶体金颗粒大小与还原次数之间的关系还原次数 颗粒直径 (nm) 正负误差
1 5.6 0.9
2 6.7 0.9
3 7.9 0.9
4 9.8 1.3
5 12 1.0
(2)柠檬酸三钠还原法 (Frens 1973)
取 0.01%氯化金溶液 100ml加热至沸腾，
迅速中入 4ml 1％柠檬酸三钠水溶液，可见溶液很快变蓝至橙红色。
柠檬酸三钠与胶体金颗粒直径的关系
0.01%HAucl4 1％柠檬酸三钠 (ml) 直径 (nm)
100 5.0 10.0
100 4.0 15.0
100 1.5 25.0
100 1.0 50.0
100 0.75 60.0
100 0.60 70.0
100 0.42 98.0
100 0.32 147.0
100 0.25 160
(3)鞣酸 ---柠檬酸三钠还原法 (slot 1985)
A液,1％氯化金 1ml
蒸馏水 79ml
B液,1％柠檬酸三钠 4ml
1％鞣酸 0.1ml
25mmol/L K2CO3 0.1ml
蒸馏水 15.8ml
将上述 A液加温到 60℃,然后将 B液快速加入到 A液中，在 10min内煮沸，此时颜色由黑 → 蓝 → 亮红。
鞣酸 ---柠檬酸三钠还原法
B液 A液直径 (nm) 1％柠檬酸钠 0.1M 2%鞣酸 H2O2 1％ H2O
(ml) K2CO3(ml) (ml) (ml) HAucl4(ml)(ml)
3.3 4 0.2 4 11.8 1 79
5 4 0.2 0.7 15.1 1 79
10 4 0.025 0.1 15.875 1 79
15 4 0.005 0.01 15.987 1 79
3.胶体金的质量鉴定胶体金制备好后，应进行颗粒直径的测定，金颗粒间大小的均匀度鉴定。
(1)胶体金颗粒直径测定用预先处理好的覆有 Formvar膜的 300
目镍网浸入胶体金溶液内，取出放在空气中干燥或 37℃ 内烤干。于透射电镜下观察其颗粒大小及均匀度，计算平均直径。如电镜 10万倍，照片 2.5倍,10万 × 2.5＝
250000＝ 25nm。理想的金颗粒大小基本相等，均匀一致，无椭圆形及多角形的金颗粒存在。
(2)胶体金颗均匀度的测定一般需测量 100个以上的胶体金颗粒，
然后用统计学处理，计算胶体金颗粒的平均直径及标准差。
（ 3）影响胶体金颗粒大小的因素如果总数超过 10％以上大小不等的金颗粒及椭圆形、三角形金颗存在应重新制备。其原因如下：
① 还原剂不是一次快速加入。
②容器太大或太小及加温至 100℃ 时间超过 15min。
③在室温或 4℃ 保存太久。
④低温保存。
四、胶体金探针制备
1.原理 蛋白质在等电点或稍偏碱的情况下，被吸附于胶体金颗粒表面，是根据电荷正负相吸的原理，使其牢固结合，
一般胶体金颗粒表面带负电，与蛋白质所带的正电荷基团间靠静电引力作用相结合。
另外，由于蛋白质分子牢固地结合在金颗粒表面，形成一个蛋白层，从而阻止了胶体金颗粒的相互接触，使标记蛋白质的金探针较为稳定。
2.待标记蛋白质 通过透析法除去多余的电解质。长期低温保存的蛋白质，临用前需 100000g 4℃ 离心 1h，去除聚合的蛋白质，尤其在浓度高于 2mg/ml的情况下。
3.胶体金应用 0.1mol/L K2CO3或 0.1NHCL调节 pH值在待标记蛋白的等电点或略偏碱。
各种蛋白质、酶的等电点名称 等电点 名称 等电点
IgG 9.0 DNA酶 6.0
F(ab)2 7.2 RNA酶 9.0~9.2
McAb 8.2 低密度脂蛋白 5.5
SPA 5.7~6.2 Avidin 10~10.6
HRP 7.2~8.0 Streptavidin 6.4~6.8
BSA 5.2~5.5 Lectin 8.0
胰岛素 -BSA结合物 5.3 α-球蛋白 6.0
4.确定胶体金与待标记蛋白质用量
(1)光电比色法制备一系列不同浓度的等体积蛋白质溶液（ 1ml），分别加入到 5ml胶体金中，迅速混均，然后各加入 1ml10％ Nacl溶液，摇匀，
静置 5min后测各管，根据金颗粒大小，测 OD
值 (520～ 580nm)，绘制示意图。
取曲线最先与横轴相接近那一点为蛋白质最稳定量。
(2)目测法目测法列表说明管数 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
胶体金 (ml) 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
蛋白质 (μg) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 0
10%Nacl(ml) 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
(3)估计量：
10ml 15nm胶体金＋ 30μ g蛋白质
10ml 3nm胶体金＋ 60μ g蛋白质
10ml 8～ 13nm胶体金＋ 8μ g蛋白质
5.胶体金与蛋白质结合取高度纯化 SPA 2ml（含 400μ g）加入到 100ml烧杯中，边搅拌拌边加入 98ml
10nm胶体金溶液,10min后，加入一定量的稳定剂聚乙烯乙二醇（终浓度 1％）继续搅拌，并测 pH。
6.胶体金探针的纯化
(1)初步纯化 4000g 4℃ 离心 30min，
吸取上清，去除沉淀物。
(2)超速离心法纯化 根据胶体金颗粒大小不同，其离心力也不完全一致。
离心力与金颗粒直径的关系 4℃ 1h
颗粒直径 (nm) 离心力 (g) 颗粒直径 (nm) 离心力 (g)
2－ 3 125000 10－ 15 64000
4－ 5 120000 15－ 20 14000
6－ 8 100000
轻轻地倒去上清（无色），取松散的红色沉淀，底部深暗色物不要吸取。
(3)凝胶过滤法 将胶体金与蛋白结合装入透析袋内，硅胶中浓缩至原体积十分之一左右，用蒸馏水冲洗软化透析袋后，按如下流程操作：
① 将浓缩好的胶体金以 1500r/min离心去掉大的聚合物，吸取上清待过柱。
② 柱高 34cm，直径 1cm，加样体积为柱床体积的 1/10。
③ 丙烯葡聚糖 S-400（ Sephacryls-400）装柱后用 0.02mol/L pH8.2 TBS平衡层析柱
（ pH7.4者用于标记的 SPA），平衡好后，
吸取上清胶体金液加入层析柱上，加样时不要破坏 S－ 400胶面。
④ 流速为 8ml/h，待胶体金全部进入界面后，
再加缓冲液，大约几小时后，可见先滤出液体呈微黄色，有时略浊，内含大颗粒聚合物等杂质，待红色出现可收集，最后肉眼可见黄色终止收集。
7.胶体金探针的质量鉴定
(1)电镜下测定金颗粒大小，均匀程度。
(2)纸膜试验
(3)IGSS或免疫电镜 IGS法
8.胶体金探针的保存
(1)SPA金标探针因易形成凝集物，不能冷冻贮存。
(2)用 0.01% NaN3 PBS溶液混悬复合物，在 4℃ 中，可稳定数月。
(3)用柠檬酸三钠制作的 SPA金标探针可保存一年以上。
(4)用白磷制备的 SPA金标探针最多稳定 4
周。
五、光镜免疫金银组织化学
(一 )免疫金染色
1.概述,1978年,Geoghegan等首次应用免疫金探针检测 B淋巴细胞表面抗原，
建立了免疫金法（ Immunogold
staining,IGS），
IGS法的特点是染色程序简便，不要显色，
染色时免疫金法一般要求金颗粒的直径大于 20nm，并且用的浓度较高。
2.IGS步骤
(1)石蜡切片脱蜡至水。
(2)消化或抗原修复,PBS洗 3× 3min。
(3)1％卵蛋白（ EA） 15min 37℃ 。
(4)适当稀释一抗 37℃ 1h,或 4℃ 过夜，
PBS洗 3× 3min。
(5)1％卵蛋白 15min 37℃ 。
(6)SPA金标探针 1:5 37℃ 1h,PBS洗。
(7)双重蒸馏水洗 5min× 3。
(8)1％戊二醛 10min。
(9)双重蒸馏水洗 5min× 3。
(10)用苏木素衬染核 30秒，常规封片。
(11)结果,在光镜下可见部分暗红色点状物
(阳性物质 )
3.SPA金标 （ PAG） 放大法该方法是在 IGS间接法的基础上，通过抗 SPA抗体上的 Fab段和 Fc段与 PAG上的 A
蛋白结合，再用 PAG，使它在抗原抗体结合部位聚集更多的胶体金颗粒，其敏感性大大提高。
操作步骤如下：
(1)石蜡切片脱蜡至水。
(2)消化或抗原修复,PBS洗 3× 3min。
(3)1％卵蛋白（ EA） 15min,37℃ 。
(4)适当稀释一抗（在间接法基础上 100倍稀释 )
4℃ 过夜,PBS洗 3× 3min,1％ EA 37℃
15min。
(5)PAG 1:40-1:50 37℃ 1h,PBS洗 3× 3min。
(6)1％ EA 15min 37℃ 。
(7)抗 SPA抗体 1:200 37℃ 40min,PBS洗
3× 3min。
(8)PAG 1:60 37℃ 45min,PBS洗
(9)蒸馏水洗 5min× 2。
(10)1％戊二醛固定 10min。
(11)蒸馏水洗 5min× 2。
(12)0.01%伊文氏蓝衬染 2min，常规或甘油封片。
PAG放大的优点,①使用试剂单一；②可大大提高 IGS的敏感性；③背景干净。
（二）免疫金银法 (Immunoglold sliver
staining,IGSS)
1.基本原理 通过免疫反应沉积在抗原位置的胶体金颗粒起着一种催化剂作用，用对苯二酚还原剂将银离子（ Ag+）还原成银原子（ Ag0）。
被还原的银原子于是围绕金颗粒形成一个
,银壳”，,银壳”一旦形成本身亦具有催化作用，从而使更多银离子还原并促使,银壳”越变越大，最终抗原位置得以清楚放大。
2.操作流程
(1)石蜡切片脱蜡至水,0.05mol/L pH7.6
TBS洗 5min× 2。
(2)消化或抗原修复 TBS洗 5min× 2。
(3)1％卵蛋白 15min。
(4)特异性一抗适当稀释（在 EnVision法基础上 1:100-1:1000） 4℃ 过夜或室 温 4h或
37℃ 1h,TBS洗 3× 3min。
(5)1％卵蛋白 15min，不洗。
(6)PAG10nm 1:30-1:40 37℃ 30min,TBS
洗 3× 3min。
(7)双蒸馏水洗 3× 3min,1％戊二醛后固定
5min，蒸馏水洗 3× 3min。
(8)避光物理显影，蒸馏水洗,45℃ 热水洗。
(9)核固红或苏木素衬染。
(10)常规封片
(11)结果观察：背景为红色，阳性呈黑色
（三）彩色免疫金银法 (CIGSS)
1.基本原理 该法的原理与彩色显影相似。 IGSS方法染色在抗原位点处生成银颗粒经铁氰化钾与溴化钾的作用，银颗粒被氧化成溴化银，
并与彩色显影剂反应，而被还原成金属银，
彩色显影剂也被氧化，其氧化产物使彩色成色剂由无色变成有色的染料，并沉积在银颗粒的部位，金属银变成了银离子。
2.操作流程
(1)IGSS物理显影，不衬染，流水冲洗。
(2)双蒸水振洗 5min× 2。
(3)漂白（ 2％铁氰化钾和 1％溴化钾） 7min。
(4)双蒸水振洗 5min× 2。
(5)彩显 3min。
彩显液的配制
A液：二乙基对二胺硫酸盐（ TSS） 200mg
无水碳酸钠 2g
溴化钾 100mg
无水亚硫酸 2mg
蒸馏水 90ml
B液,α-萘酚 200mg溶于 10ml异丙醇中，或用硝基苯乙晴（碱性品红） 200mg溶于
10ml丙酮中。
临用前 A,B两液混合，过滤后在室 温下即可显色。
(6)水洗 5min。
(7)如果阳性结果较弱，而背景较清晰，可重复 2～ 6步（共可 4次以上），如切片背景较深，可用 20％硫代硫酸钠 1.2ml，
7%铁氰化钾 0.3ml加蒸馏水至 60ml，在显微镜下控制。
(8)定影 20min
(9)甘油明胶封片，避光保存
3.CIGSS的优点
(1)阳性结果比黑色更鲜明；
(2)可以使弱信号得到放大；
(3)消除 IGSS背景染色；
(4)信号 /背景比值高；
(5)是开展免疫金银双标技术的新途径。
(四 )IGSS技术的优点：
1.制备简单，金颗粒大小可人为控制；
2.标记简单；
3.适用范围广，可用于光镜和电镜 (透射和扫描 )。
4.特异性强
5.敏感性高
6.安全
（五） IGSS染色中常见问题和对策
IGSS方法的主要问题是非特异背景染色，并且直接影响到应用，其原因有如下几条：
1.特异性一抗的质量及一抗与金标二抗没有最佳稀释。
2.金标二抗存在游离聚合的金颗粒。
3.在配制显影液，必须用新鲜的双蒸水配制，绝对避光显影。
4,银盐和对苯二酚用量不宜过大，否则反应速度太快，不易掌握而造成背景染色。
5,避光显色后，应在暗处用热水洗。
（六）银显影液的配制
1,硝酸银显影液
(1)1%明胶 60ml。
(2)pH3.4柠檬酸缓冲液 10ml。
(3)对苯二酚 1.3g溶在 30ml蒸馏水中。
(4)硝酸银 100mg溶在 2ml蒸馏水中。
用时临时混合，并立即避光显色。
2.乳酸银显影液
(1)10％阿拉伯胶水溶液 60ml。
(2)pH3.4柠檬酸缓冲液 10ml。
(3)对苯二酚 1.3g溶在 20ml蒸馏水中。
(4)乳酸银水溶液 100mg加蒸馏水 10ml。
1.胶体金的概念，胶体金有哪些特性？
2.影响溶胶稳定性的因素有哪些？
3.制备胶体金的还原剂有哪几种？
4.有哪几种经典的胶体金制备方法？
5.胶体探针的纯化方式有哪二种，请叙述他们的过程？
6IGSS技术的优点有哪些？
7.IGSS技术存在的问题和克服的办法有哪些？
一、免疫胶体金技术发展史
1.1939年 Kausche和 Ruska把烟草叶病毒吸附在金颗粒上，电镜下观察呈高电子密度细颗粒状。
2.1971年 Faulk和 Taylor首先将兔抗沙门菌抗血清与胶体金颗粒结合，用直接
IHC检测沙门菌的表面抗原。
3.1974年 Romano和他的同事们将胶体金标记在马抗人 IgG上，实现了间接免疫金染色法。
同年 Bauer等报道将胶体金标记在凝集素上的应用。
4.1978年 Geoghegan等应用免疫金技术检测 B
淋巴细胞表面抗原。
5.1981年 Danscher建立了银显影液增强光镜下金颗粒的免疫金银染色方法
（ Immunogold-silver staining,IGSS）。
6.1986年 Fritz等人在 IGSS法基础上成功地进行了彩色 IGSS法,使得结果更加鲜艳夺目。
二、溶胶的基本概念
1.胶体金溶胶的概念,溶胶是指一种物质以或大或小的微小粒子分散在另一种物质中所形成的体系。被分散的物质叫分散相，容纳分散相的另一种物质称为分散介质。按分散相质点的大小不同，分三类。
(1)离子分散体系 分散相以小分子或离子状态存在（分散相粒子小于 1nm）。
具有高度的稳定性。
(2)胶体金分散体系 指分散相颗粒在 1～
100nm之间，外观透明不浑浊，在普通显微镜下看不见。
(3)粗分散体系 指颗粒大于 100nm，不稳定，显微镜下可见。
2.胶体金的一般性状
(1)胶体金的颜色 颗粒在 5～ 20nm
之间，吸收波长 520nm，呈红葡萄酒色；
20～ 40nm之间吸收波长 530nm，呈深红色；
60nm的金溶液主要吸收波长 600nm为橙黄色光，液体呈蓝紫色。
(2)胶体金的稳定性 其稳定介于小分子离子和粗分散体系之间，即稳定，又容易出现聚沉。影响溶胶稳定性的主要原因有三点：①胶粒间的相互吸引力；②
胶粒及其溶剂化层的带电情况；③胶体界面的溶剂膜。
(3)溶胶的聚沉现象 胶粒之间存在吸引力与排斥力这对矛盾，一旦平衡打破，
胶粒便聚结发生聚沉。引起溶胶聚沉的原因有：
① 少量电解质对溶胶的作用；
②温度对溶胶稳定性的影响：当温度升高时，吸附能力减少，溶剂化程度降低，溶剂化层变薄，胶粒聚结，不稳定性增加；
③浓度对溶胶的稳定性的影响 浓度增大时，粒子间距离缩小，引力增加，容易聚结而发生聚沉。
三、胶体金的制备
1.制备前的准备
(1)玻璃器皿的清洁 制备胶体金的成功与失败除试剂因素以外玻璃器皿清洁是非常关键的一步。
其清洁流程如下：清洁液泡 24h，自流水洗净，洗洁剂洗 3～ 4次，流水冲洗干净，蒸馏水洗 4～ 5次，烤箱烤干备用。如果条件允许，可将器皿进行硅化。
(2)试剂的配制要求 所有配制试剂的容器均按上述要求清洗，配制试剂用双蒸馏水或去离子水。
2.胶体金制备的方法胶体金的制备方法很多，其中应用较为广泛的方法是化学还原法。这一方法的基本原理是在氯化金水溶液中加入一定的还原剂，使金离子还原成金原子。可用于制备胶体金的还原剂有 50余种，但常用的还原剂仅以下三种：即白磷、柠檬酸三钠以及鞣酸。
(1)改良的白磷还原法 (Henegouwen,1986)
① 取 20％饱和度白磷乙醚溶液 0.5ml，加蒸馏水 60ml。
②加入 1％的 HAucl4水溶液 0.75ml，加
0.1mol/L K2CO3 0.6ml，振荡变成棕色。
③加热煮沸，至透明红色。
胶体金颗粒大小与还原次数之间的关系还原次数 颗粒直径 (nm) 正负误差
1 5.6 0.9
2 6.7 0.9
3 7.9 0.9
4 9.8 1.3
5 12 1.0
(2)柠檬酸三钠还原法 (Frens 1973)
取 0.01%氯化金溶液 100ml加热至沸腾，
迅速中入 4ml 1％柠檬酸三钠水溶液，可见溶液很快变蓝至橙红色。
柠檬酸三钠与胶体金颗粒直径的关系
0.01%HAucl4 1％柠檬酸三钠 (ml) 直径 (nm)
100 5.0 10.0
100 4.0 15.0
100 1.5 25.0
100 1.0 50.0
100 0.75 60.0
100 0.60 70.0
100 0.42 98.0
100 0.32 147.0
100 0.25 160
(3)鞣酸 ---柠檬酸三钠还原法 (slot 1985)
A液,1％氯化金 1ml
蒸馏水 79ml
B液,1％柠檬酸三钠 4ml
1％鞣酸 0.1ml
25mmol/L K2CO3 0.1ml
蒸馏水 15.8ml
将上述 A液加温到 60℃,然后将 B液快速加入到 A液中，在 10min内煮沸，此时颜色由黑 → 蓝 → 亮红。
鞣酸 ---柠檬酸三钠还原法
B液 A液直径 (nm) 1％柠檬酸钠 0.1M 2%鞣酸 H2O2 1％ H2O
(ml) K2CO3(ml) (ml) (ml) HAucl4(ml)(ml)
3.3 4 0.2 4 11.8 1 79
5 4 0.2 0.7 15.1 1 79
10 4 0.025 0.1 15.875 1 79
15 4 0.005 0.01 15.987 1 79
3.胶体金的质量鉴定胶体金制备好后，应进行颗粒直径的测定，金颗粒间大小的均匀度鉴定。
(1)胶体金颗粒直径测定用预先处理好的覆有 Formvar膜的 300
目镍网浸入胶体金溶液内，取出放在空气中干燥或 37℃ 内烤干。于透射电镜下观察其颗粒大小及均匀度，计算平均直径。如电镜 10万倍，照片 2.5倍,10万 × 2.5＝
250000＝ 25nm。理想的金颗粒大小基本相等，均匀一致，无椭圆形及多角形的金颗粒存在。
(2)胶体金颗均匀度的测定一般需测量 100个以上的胶体金颗粒，
然后用统计学处理，计算胶体金颗粒的平均直径及标准差。
（ 3）影响胶体金颗粒大小的因素如果总数超过 10％以上大小不等的金颗粒及椭圆形、三角形金颗存在应重新制备。其原因如下：
① 还原剂不是一次快速加入。
②容器太大或太小及加温至 100℃ 时间超过 15min。
③在室温或 4℃ 保存太久。
④低温保存。
四、胶体金探针制备
1.原理 蛋白质在等电点或稍偏碱的情况下，被吸附于胶体金颗粒表面，是根据电荷正负相吸的原理，使其牢固结合，
一般胶体金颗粒表面带负电，与蛋白质所带的正电荷基团间靠静电引力作用相结合。
另外，由于蛋白质分子牢固地结合在金颗粒表面，形成一个蛋白层，从而阻止了胶体金颗粒的相互接触，使标记蛋白质的金探针较为稳定。
2.待标记蛋白质 通过透析法除去多余的电解质。长期低温保存的蛋白质，临用前需 100000g 4℃ 离心 1h，去除聚合的蛋白质，尤其在浓度高于 2mg/ml的情况下。
3.胶体金应用 0.1mol/L K2CO3或 0.1NHCL调节 pH值在待标记蛋白的等电点或略偏碱。
各种蛋白质、酶的等电点名称 等电点 名称 等电点
IgG 9.0 DNA酶 6.0
F(ab)2 7.2 RNA酶 9.0~9.2
McAb 8.2 低密度脂蛋白 5.5
SPA 5.7~6.2 Avidin 10~10.6
HRP 7.2~8.0 Streptavidin 6.4~6.8
BSA 5.2~5.5 Lectin 8.0
胰岛素 -BSA结合物 5.3 α-球蛋白 6.0
4.确定胶体金与待标记蛋白质用量
(1)光电比色法制备一系列不同浓度的等体积蛋白质溶液（ 1ml），分别加入到 5ml胶体金中，迅速混均，然后各加入 1ml10％ Nacl溶液，摇匀，
静置 5min后测各管，根据金颗粒大小，测 OD
值 (520～ 580nm)，绘制示意图。
取曲线最先与横轴相接近那一点为蛋白质最稳定量。
(2)目测法目测法列表说明管数 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
胶体金 (ml) 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
蛋白质 (μg) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 0
10%Nacl(ml) 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
(3)估计量：
10ml 15nm胶体金＋ 30μ g蛋白质
10ml 3nm胶体金＋ 60μ g蛋白质
10ml 8～ 13nm胶体金＋ 8μ g蛋白质
5.胶体金与蛋白质结合取高度纯化 SPA 2ml（含 400μ g）加入到 100ml烧杯中，边搅拌拌边加入 98ml
10nm胶体金溶液,10min后，加入一定量的稳定剂聚乙烯乙二醇（终浓度 1％）继续搅拌，并测 pH。
6.胶体金探针的纯化
(1)初步纯化 4000g 4℃ 离心 30min，
吸取上清，去除沉淀物。
(2)超速离心法纯化 根据胶体金颗粒大小不同，其离心力也不完全一致。
离心力与金颗粒直径的关系 4℃ 1h
颗粒直径 (nm) 离心力 (g) 颗粒直径 (nm) 离心力 (g)
2－ 3 125000 10－ 15 64000
4－ 5 120000 15－ 20 14000
6－ 8 100000
轻轻地倒去上清（无色），取松散的红色沉淀，底部深暗色物不要吸取。
(3)凝胶过滤法 将胶体金与蛋白结合装入透析袋内，硅胶中浓缩至原体积十分之一左右，用蒸馏水冲洗软化透析袋后，按如下流程操作：
① 将浓缩好的胶体金以 1500r/min离心去掉大的聚合物，吸取上清待过柱。
② 柱高 34cm，直径 1cm，加样体积为柱床体积的 1/10。
③ 丙烯葡聚糖 S-400（ Sephacryls-400）装柱后用 0.02mol/L pH8.2 TBS平衡层析柱
（ pH7.4者用于标记的 SPA），平衡好后，
吸取上清胶体金液加入层析柱上，加样时不要破坏 S－ 400胶面。
④ 流速为 8ml/h，待胶体金全部进入界面后，
再加缓冲液，大约几小时后，可见先滤出液体呈微黄色，有时略浊，内含大颗粒聚合物等杂质，待红色出现可收集，最后肉眼可见黄色终止收集。
7.胶体金探针的质量鉴定
(1)电镜下测定金颗粒大小，均匀程度。
(2)纸膜试验
(3)IGSS或免疫电镜 IGS法
8.胶体金探针的保存
(1)SPA金标探针因易形成凝集物，不能冷冻贮存。
(2)用 0.01% NaN3 PBS溶液混悬复合物，在 4℃ 中，可稳定数月。
(3)用柠檬酸三钠制作的 SPA金标探针可保存一年以上。
(4)用白磷制备的 SPA金标探针最多稳定 4
周。
五、光镜免疫金银组织化学
(一 )免疫金染色
1.概述,1978年,Geoghegan等首次应用免疫金探针检测 B淋巴细胞表面抗原，
建立了免疫金法（ Immunogold
staining,IGS），
IGS法的特点是染色程序简便，不要显色，
染色时免疫金法一般要求金颗粒的直径大于 20nm，并且用的浓度较高。
2.IGS步骤
(1)石蜡切片脱蜡至水。
(2)消化或抗原修复,PBS洗 3× 3min。
(3)1％卵蛋白（ EA） 15min 37℃ 。
(4)适当稀释一抗 37℃ 1h,或 4℃ 过夜，
PBS洗 3× 3min。
(5)1％卵蛋白 15min 37℃ 。
(6)SPA金标探针 1:5 37℃ 1h,PBS洗。
(7)双重蒸馏水洗 5min× 3。
(8)1％戊二醛 10min。
(9)双重蒸馏水洗 5min× 3。
(10)用苏木素衬染核 30秒，常规封片。
(11)结果,在光镜下可见部分暗红色点状物
(阳性物质 )
3.SPA金标 （ PAG） 放大法该方法是在 IGS间接法的基础上，通过抗 SPA抗体上的 Fab段和 Fc段与 PAG上的 A
蛋白结合，再用 PAG，使它在抗原抗体结合部位聚集更多的胶体金颗粒，其敏感性大大提高。
操作步骤如下：
(1)石蜡切片脱蜡至水。
(2)消化或抗原修复,PBS洗 3× 3min。
(3)1％卵蛋白（ EA） 15min,37℃ 。
(4)适当稀释一抗（在间接法基础上 100倍稀释 )
4℃ 过夜,PBS洗 3× 3min,1％ EA 37℃
15min。
(5)PAG 1:40-1:50 37℃ 1h,PBS洗 3× 3min。
(6)1％ EA 15min 37℃ 。
(7)抗 SPA抗体 1:200 37℃ 40min,PBS洗
3× 3min。
(8)PAG 1:60 37℃ 45min,PBS洗
(9)蒸馏水洗 5min× 2。
(10)1％戊二醛固定 10min。
(11)蒸馏水洗 5min× 2。
(12)0.01%伊文氏蓝衬染 2min，常规或甘油封片。
PAG放大的优点,①使用试剂单一；②可大大提高 IGS的敏感性；③背景干净。
（二）免疫金银法 (Immunoglold sliver
staining,IGSS)
1.基本原理 通过免疫反应沉积在抗原位置的胶体金颗粒起着一种催化剂作用，用对苯二酚还原剂将银离子（ Ag+）还原成银原子（ Ag0）。
被还原的银原子于是围绕金颗粒形成一个
,银壳”，,银壳”一旦形成本身亦具有催化作用，从而使更多银离子还原并促使,银壳”越变越大，最终抗原位置得以清楚放大。
2.操作流程
(1)石蜡切片脱蜡至水,0.05mol/L pH7.6
TBS洗 5min× 2。
(2)消化或抗原修复 TBS洗 5min× 2。
(3)1％卵蛋白 15min。
(4)特异性一抗适当稀释（在 EnVision法基础上 1:100-1:1000） 4℃ 过夜或室 温 4h或
37℃ 1h,TBS洗 3× 3min。
(5)1％卵蛋白 15min，不洗。
(6)PAG10nm 1:30-1:40 37℃ 30min,TBS
洗 3× 3min。
(7)双蒸馏水洗 3× 3min,1％戊二醛后固定
5min，蒸馏水洗 3× 3min。
(8)避光物理显影，蒸馏水洗,45℃ 热水洗。
(9)核固红或苏木素衬染。
(10)常规封片
(11)结果观察：背景为红色，阳性呈黑色
（三）彩色免疫金银法 (CIGSS)
1.基本原理 该法的原理与彩色显影相似。 IGSS方法染色在抗原位点处生成银颗粒经铁氰化钾与溴化钾的作用，银颗粒被氧化成溴化银，
并与彩色显影剂反应，而被还原成金属银，
彩色显影剂也被氧化，其氧化产物使彩色成色剂由无色变成有色的染料，并沉积在银颗粒的部位，金属银变成了银离子。
2.操作流程
(1)IGSS物理显影，不衬染，流水冲洗。
(2)双蒸水振洗 5min× 2。
(3)漂白（ 2％铁氰化钾和 1％溴化钾） 7min。
(4)双蒸水振洗 5min× 2。
(5)彩显 3min。
彩显液的配制
A液：二乙基对二胺硫酸盐（ TSS） 200mg
无水碳酸钠 2g
溴化钾 100mg
无水亚硫酸 2mg
蒸馏水 90ml
B液,α-萘酚 200mg溶于 10ml异丙醇中，或用硝基苯乙晴（碱性品红） 200mg溶于
10ml丙酮中。
临用前 A,B两液混合，过滤后在室 温下即可显色。
(6)水洗 5min。
(7)如果阳性结果较弱，而背景较清晰，可重复 2～ 6步（共可 4次以上），如切片背景较深，可用 20％硫代硫酸钠 1.2ml，
7%铁氰化钾 0.3ml加蒸馏水至 60ml，在显微镜下控制。
(8)定影 20min
(9)甘油明胶封片，避光保存
3.CIGSS的优点
(1)阳性结果比黑色更鲜明；
(2)可以使弱信号得到放大；
(3)消除 IGSS背景染色；
(4)信号 /背景比值高；
(5)是开展免疫金银双标技术的新途径。
(四 )IGSS技术的优点：
1.制备简单，金颗粒大小可人为控制；
2.标记简单；
3.适用范围广，可用于光镜和电镜 (透射和扫描 )。
4.特异性强
5.敏感性高
6.安全
（五） IGSS染色中常见问题和对策
IGSS方法的主要问题是非特异背景染色，并且直接影响到应用，其原因有如下几条：
1.特异性一抗的质量及一抗与金标二抗没有最佳稀释。
2.金标二抗存在游离聚合的金颗粒。
3.在配制显影液，必须用新鲜的双蒸水配制，绝对避光显影。
4,银盐和对苯二酚用量不宜过大，否则反应速度太快，不易掌握而造成背景染色。
5,避光显色后，应在暗处用热水洗。
（六）银显影液的配制
1,硝酸银显影液
(1)1%明胶 60ml。
(2)pH3.4柠檬酸缓冲液 10ml。
(3)对苯二酚 1.3g溶在 30ml蒸馏水中。
(4)硝酸银 100mg溶在 2ml蒸馏水中。
用时临时混合，并立即避光显色。
2.乳酸银显影液
(1)10％阿拉伯胶水溶液 60ml。
(2)pH3.4柠檬酸缓冲液 10ml。
(3)对苯二酚 1.3g溶在 20ml蒸馏水中。
(4)乳酸银水溶液 100mg加蒸馏水 10ml。
