免疫组化基本技术倪 灿 荣
RCA法 IGSS
IS-PCR CSA法
UIP Envision
LSAB法双 PAP法
PAP法
ABC法桥法间接法直接法第一部分组织与细胞材料的制备内容：组织与细胞材料的取材和保存主要内容一、人体组织标本的取材二、动物组织标本的取材三、取材注意事项四、细胞标本的准备五、组织的固定、脱水、透明和包埋六、切片七、组织与细胞材料的保存概 述免疫组织化学（ Immunohistochemistry;
IHC） 技术是一门综合性技术，除了具备优质、高效，特异的一抗，敏感的检测方法，
稳定的显示系统外，还需要掌握组织标本或标本的取材、固定、包埋、切片，以及 IHC
前的处理，内源性酶的消除方法，非特异背景的消除方法，怎样防止 IHC染色过程中的脱片。
一、人体组织标本的取材手术切除标本，各种活检穿刺标本和尸体解剖标本。
1.手术切除标本的取材：
抗原在组织中的分布常不均一，取材时应考虑：主要病灶，病灶与正常组织交界处，远离病灶的正常组织。
组织大小,长 1cm× 宽 1cm× 厚 0.2～ 0.3cm。
2.各种小组织的活检取材：
它不仅体积小，取材困难，不易取到主要病灶，因此对标本的处理应特别慎重，
及时固定，包埋时要平整。
3.穿刺标本的取材：
光镜（ HE、特殊染色,IHC,ISH）
电镜（透射电镜、免疫电镜）
4.尸检组织的取材病人死亡后，一般要在数小时后才能做尸检，因此，及时取材，尽早固定是开展 IHC检测的关键。
二、动物组织标本的取材动物的处死方式一般为活杀，组织标本来源较新鲜,10min内即可完成固定和冷冻保存，脑组织和神经组织应采用灌注固定后，再进行后固定。
动物处死方法：
1.麻醉法 乙醚或 4％戊巴比妥静注
2.空气栓塞法
3.断头法
4.击头法
5.股动脉放血法三、组织取材注意事项
1.组织要求离体后 30min内浸入固定液，
尤其是开展分子生物学工作。动物组织取材要求心脏还在跳动时取材。
2.注意防止人为因素的影响刀和剪要快，刀要足够长。
3.组织块的大小厚为 0.1～ 0.3cm，大小可根据需要而定
4.动物和人体组织的取材位置要视研究目的，观察部位而定
5.取材时间原则上，应尽快取材，但比较大的手术标本如胃、肺、肠等器官，最好先固定后取材。
6.注意包埋方向
7.边缘标记
8.保持材料的清洁
9.切除不需要的部分
10.明确编号，登记
11.骨组织还需脱钙四、细胞材料的准备细胞的取材和制片法：
1.印片法,常用于活检或手术切除标本。
将新鲜标本沿病灶中心剖开，将病灶区轻压于载玻片上，吹干后立即固定 20～ 30min。
优点,操作简单，抗原保存好缺点,细胞厚薄不均,IHC染色易引起背景染色。
2.穿刺吸取法
3.沉淀法 主要用于胸水、腹水、尿液、脑脊液等体液多而细胞较少的标本。
（ 1）常规细胞玻片制片法
（ 2）单核细胞分离法体液沉渣细胞学切片制作：
1,取两只 10ml试管,分别装入体液 10ml,离心后留取沉渣 。
2,滴入蛋清 1～ 2滴混匀,加入固定液 5ml,固定 1h,离心后留取沉渣 。
3,将试管剪开,底部 1cm处,取出沉渣,用擦镜纸包好,进行常规脱水,包埋,石蜡切片 。
该方法可以免除大范围的阅片,又可避免漏诊,可重复切片,使 IHC标记更为方便 。
自动细胞离心涂片机制作胸腹水细胞学涂片方法 。
3.制备细胞玻片应注意
（ 1）易脱片；
（ 2）细胞应集中在直径 0.6～
1.0cm的圆圈内，总数 105-106；
（ 3）富于粘液的标本，未经处理不宜做 IHC。
4.活细胞标本的制备法培养的活细胞可分贴壁和悬浮二种。贴壁细胞可将
（ 1）细胞大量培养后，经消化将细胞制成悬液（ 106）涂在涂有切片粘合剂的载玻片上，
凉干后固定。
（ 2）将细胞直接培养在盖玻片上。
（ 3）将细胞直接培养在 6孔或 9孔板上，经固定后可行 IHC。
五、组织标本的固定
1.目的
(1)防止组织细胞的死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织细胞的固有形态。
(2)使细胞内的蛋白质、脂肪、糖和酶等各种抗原成份转变成不溶性物质，以保持它原有的结构与生活时相仿。
（ 3）使组织中的各种物质沉淀和凝固起来而产生不同的折射率，造成光学上的差异，以便染色后易于鉴别和观察。
（ 4）固定剂兼有硬化作用、使组织硬化、
增加组织硬度、便于制片。
（ 5）防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有形态结构。
（ 6）经过固定的组织能对染料产生不同的亲和力而着色清晰，便于辨认。
2.固定液的种类
(1)甲醛固定液
10％福尔马林
10％中性福尔马林
10％中性缓冲福尔马林
(2)4％多聚甲醛固定液
(3)Bouin S液及改良 Bouin S液
(4)Zenker S液重铬酸钾 25mg
氯化汞 10g
冰醋酸 50ml
蒸馏水 800ml
(5)Zamboni S液多聚甲醛 20g
饱和苦味酸 150ml
PB液至 1000ml
(6)PLP固定液：过碘酸 -赖氨酸 -多聚甲醛固定液。该固定剂较适合于富含糖类组织，
对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。
(7)PLPD固定液 取 PLP固定液 25ml，加入 2.5%重铬酸钾 25ml。
(8)Kanovsky S液
(9)Methacarn固定液 甲醇 60ml，氯仿
30ml，醋酸 10ml，混均后 4℃ 保存备用，对核内抗原的保存效果较好。
(10)PEG液
(11)0.4%对苯醌
(12)碳二亚酰胺 -戊二醛（ ECG-G）液
(13)丙酮及醇类固定剂 丙酮、乙醇类固定剂其固定原理主要是对蛋白质的沉淀而发生固定作用。
3.固定方法的选择及注意事项
(1)大小 2cm× 2cm× 0.3cm
(2)及时固定
(3)固定时间 固定时间要视组织块的厚薄，固定液的种类及浓度，温度而定，原则上，组织块大小与固定时间成正比，固定液的穿透力及浓度与固定时间成反比。
(4)组织固定后必须彻底冲洗。
影响固定的因素
1,温度 常规固定温度是室温 (22℃ ),某些酶的固定要求在 37℃ 下进行,某些病毒则需在低温下固定 。 冰冻切片用丙酮固定,最佳在 -
20℃ ~－ 40℃ 。
2,浓度 10%中性甲醛,4%多聚甲醛,乙醇常用 95%,丙酮为原液 。
3.时间 固定时间要视组织块的大小,固定液的种类和浓度,固定所处的环境温度等条件而定 。 原则上,组织块大小与固定时间成正比 。
六、组织脱水、浸蜡及包埋
1.目的 由于石蜡不溶于水和醇类试剂，只溶解在二甲苯类试剂中。因而,组织经固定和水洗后含大量水分,需用乙醇类试剂进行脱水,水脱完后,组织内含有大量的乙醇,还必须用能溶解乙醇的二甲苯来置换,最后经浸蜡,组织细胞内被大量石蜡支称,才使组织能用于石蜡切片。
2.脱水剂的种类,非石蜡溶剂的脱水剂和脱水兼石蜡溶剂的脱水剂。
常用的脱水剂,(1)乙醇； (2)丙酮；
(3)正丁醇； (4)淑丁醇； (5)环乙酮； (6)
松脂醇； (7)二氧陆环。
3.常用的透明剂,(1)二甲苯； (2)甲苯；
(3)苯； (4)香柏油； (5)苯甲酸甲酯； (6)
氯仿； (7)冬青油 ;(8)苯胺油
4.原则 脱水方法甚多，一般需逐级进行脱水，否则可引起组织强烈收缩，组织变形。
在脱水完全的前提下，组织的透明必须彻底，但不能过长，否则会引起组织切片困难。
5.常规石蜡包埋过程
(1)脱水,75％,85％乙醇,95％ Ⅰ,Ⅱ,
Ⅲ 乙醇，无水乙醇 Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ 。
(2)透明：二甲苯 Ⅰ,二甲苯 Ⅱ,二甲苯 Ⅲ
(3)浸蜡：石蜡 Ⅰ,石蜡 Ⅱ,石蜡 Ⅲ
(4)石蜡包埋：修蜡块，标号
6.根据本实验室经验各种不同类型组织的石蜡包埋条件
(1)大动物组织 （狗、兔、小儿尸检）脱水、透明和浸蜡时间
75％乙醇 30～ 120min,85％乙醇 30～
120min,95％乙醇 Ⅰ 2h,95％乙醇 Ⅱ 2h,
95％乙醇 Ⅲ 过夜，无水乙醇 Ⅰ30 ～ 60min，
无水乙醇 Ⅱ30 ～ 60min，无水乙醇
Ⅲ60min ～ 120min，二甲苯 Ⅰ,Ⅱ 和 Ⅲ 各
15min（可视观察结果而定），石蜡
Ⅰ30min,石蜡 Ⅱ1 ～ 2h，石蜡 Ⅲ2 ～ 3h。
(2)小动物组织脱水、透明和浸蜡时间
75％乙醇 30min,85％乙醇 30min,95
％乙醇 Ⅰ1h,Ⅱ1h,Ⅲ 过夜或 2h，无水乙醇 Ⅰ,Ⅱ 和 Ⅲ 各 30min，二甲苯 Ⅰ15min,
Ⅱ10min,Ⅲ10min （肉眼观察），石蜡
Ⅰ30min,石蜡 Ⅱ30min,石蜡 Ⅲ1 ～ 2h。
(3)活检或手术切除标本的脱水透明和浸蜡时间
75％乙醇 30min,85％乙醇 1h,95％
乙醇 Ⅰ1h,Ⅱ1h 和 Ⅲ4h 或过夜，无水乙醇 Ⅰ30min,Ⅱ1 ～ 2h和 Ⅲ4h,二甲苯
Ⅰ30min,Ⅱ30min 和 Ⅲ1h 。
七、组织切片切片可分石蜡切片、冰冻切片、火棉胶切片,IHC切片要求不同与常规切片，需连续有序，防止脱片等特殊要求。
1.切片前的准备工作
(1)载玻片的清洁,市售载玻片需经清洁液泡 24h，流水冲洗，系列乙醇浸泡，
凉干涂胶，如需开展原位杂交，还需将玻片 240℃ 烤 2h。
(2)切片粘合剂的种类多聚赖氨酸（分子量 300KD）,0.5%浓度。
APES试剂（ 3-氨基、丙基三氧基硅烷）：干净载玻片 → 丙酮 5min →APES （ 1ml+50ml丙酮）：
用镊子夹住浸入 APES试剂 1～ 3次 → 纯丙酮洗二次
→ 干燥玻片 → 用铝箔包好，室温或 4℃ 保存备用。
铬矾明胶液：
铬矾 0.5g 明胶 5g H2O2 1000ml
甲醛明胶液：
40％甲醛 2.5ml 明胶 0.5g H2O2 100ml
2.石蜡切片：
3.冰冻切片,IHC冰冻切片,ISH冰冻切片
(恒冷箱冰冻切片机和开放式冰冻切片机 )
4.切片要求及注意事项：
(1)连续切片按序贴在玻片的下 1/3。
(2)52－ 60℃ 烤片 18h。
(3)切片厚 2～ 4μ m。
(4)切片刀要快
(5)编上号
(6)切片可在 4℃ 保存数年（石蜡切片）
(7)冰冻切片需凉干后立即固定
(8)冰冻切片分固定和新鲜组织，固定组织需经庶糖处理 24h，冰冻切片。
(9)冰冻切片固定后 -80℃ 保存备用八、组织与细胞材料的保存
1.冷冻保存：
-80℃,-145℃,-198℃
组织应在离体 30min内，快速取材，放入专用冷冻管中，并编上号，登记在册。
2.新鲜组织经适当固定后，装入冻存管中,-80℃ 冻存。
3.蜡块的保存
4.活细胞的保存 可根据需要将细胞直接培养在盖玻片上,9孔板上的细胞可经固定后 -80℃ 保存备用，大容量培养的细胞收集冻存在液氮中。
第二部分
IHC的一些基本技术主要内容一、实验的设计二、石蜡切片的脱蜡至水三、内源性酶的消除方法四,IHC的非特异性染色五、抗原的暴露和修复六、抗体的购置及注意事项七、抗体最佳稀释度的测定和保存八、显示系统及衬染剂的选择和配制九,IHC常用缓冲液一、实验的设计
1.查阅相关文献，列出要做的
IHC指标，根据经费情况，选择相关公司购置特异性抗体和检测试剂。
2.列出 IHC实验操作流程，选择何种 IHC前处理方式。
3.通过预实验寻找第一抗体的最佳稀释度，
应设置何种对照。
4.每批实验应用同一稀释度的一抗，孵育时间和温度，同一的显色时间。
5.列出阳性判定的标准
6.预期达到的目标二、石蜡切片脱蜡至水冰冻切片从 -80℃ 取出，凉干或电吹风吹干后可直接进行免疫组化标记。石蜡切片需经如下脱蜡才能做 IHC。
二甲苯 Ⅰ10min,二甲苯 Ⅱ10min,
二甲苯 Ⅲ10min,无水乙醇 2min,95％
乙醇 2min,85％乙醇 2min,75％乙醇
2min，流水冲洗。
三、内源性酶的消除方法
(一 )内源性过氧化物酶的消除方法：
1,0.3%～ 3%H2O2甲醇液 20min
2,1％ H2O2 20min
3,3％苯肼溶液 37℃ 1h
4,0.075%盐酸甲醇液 30min
5.DAB-H2O2溶液中加 0.005M NaN3
6.过碘酸 -硼酸钠,0.5%过碘酸 10min，
经洗后 1％硼酸钠处理 10min。
7.20mol/L-100mol/L抗坏血酸 30～
60min。
(二 )内源性碱性磷酸酶的消除方法
1,10％醋酸 10min
2,0.5mol/L碳酸氢钠（ pH9.0） 20min
3,1mol/L左旋咪唑 20min
(三 )内源性生物素的消除方法
1.用 2-甲基 -D苷露糖饱和生物素
2.先用 25μ g/ml卵白素孵育 15min,PBS
洗 10min，移至生物素饱和液中处理 15min，
PBS洗 15min。
四,IHC的非特异性染色
1.特异性抗体不纯
2.抗体免疫球蛋白所带电荷与检测组织所带电荷差异很大，可引起非特异染色。
3.IgG的交叉反应
4.共同抗原决定簇
5.单一决定簇抗体的异质性
6.特异性抗原弥散
7.IgG受体干扰
8.鼠源性抗体检测鼠源性组织
9.内源性抗生物素蛋白结合物内源性抗生物素蛋白指的是体内能够与抗生物素蛋白结合的分子或基团,在体内含有这种分子或基团的物质主要是内源性生物素 。 可以用 20%蛋清封闭,或用 2%
卵蛋白进行封闭,或不采用亲和细胞化学方法 。
解决方法：
1.用正常二抗血清吸附
2.将组织用酶消化或抗原修复
3.二抗用木瓜酶将抗体结合部 Fab切除
4.高度稀释特异性一抗五、酶消化和抗原修复
1.为什么要进行酶消化和抗原修复？
(1)固定液的影响 自 1893年 Ferdinand
Blum创立组织固定以来，为了避免组织固定液对抗原决定簇的影响，已经寻找到几十种固定液，目的就是为了对一定抗原起到保护作用，同时还能获得良好的组织形态结构。
目前无一种固定液适用于所有的抗原，从组织细微结构的保存，稳定、简便和廉价综合评估上，甲醛最优。
甲醛使蛋白质发生凝固，自身和之间会发生交联，交联时会使蛋白质的四级和三级结构的折叠方向发生改变，使蛋白质苯环结构上的抗原决定簇发生改变，而影响检测。
(2)抗体制备的影响
2.酶消化
(1)原理：
1)去除覆盖于抗原决定簇表面的杂蛋白
2)断交联
(2)蛋白酶的种类胰蛋白酶 0.05%～ 0.1％胰蛋白酶加入等量的氯化钙，用 0.1N NaoH调 pH至 7.8。
消化时间 37℃ 30min 。
胃蛋白酶 0.4%胃蛋白酶，用 0.01N HCI
稀释，消化时间 37℃ 30 ～ 180min。
蛋白酶 K 20μ g/ml，用 pH8.0 0.5M
Tris-HCI配制，消化时间 37℃ 20 ～ 40min。
链酶蛋白酶 0.1%，用 pH 7.4,0.5M
Tris-Hcl稀释，消化时间 37℃ 1 ～ 4h。
无花果蛋白酶 0.1%浓度，用 0.2M
pH7.4 PBS稀释，消化时间 37℃ 30 ～
60min。
菠萝蛋白酶 其浓度为 0.4%～ 1％，溶在 0.01M,pH7.4 PBS中,37℃ 消化 30～
120min。
尿素 浓度 3M 37℃ 5 ～ 30min
(3)原则及注意事项胃蛋白酶和菠萝蛋白酶主要用于细胞间质抗原的检测前消化，其余蛋白酶均为细胞内抗原的显示消化。
在配制和使用时应考虑到酶激活的最佳 pH值，消化温度、浓度和孵育时间。
3.热诱导的抗原修复,抗原修复 (Antigen
Retrieval;AR)是以高温、高压对常规固定的石蜡切片进行抗原修复或复原的一种非蛋白酶消化以提高抗原抗体阳性检测的一种方法和技术手段。
(1)依据,40年代美国学者 Fraenkel-
conrat等实验证实，甲醛和蛋白水解交联过程中氨基酸侧链上的某些基团 (抗原决定簇 )如咪唑、吲哚等基团受到影响，通过
120℃ 高温或强碱处理后，可使交联打开。
(2)修复方式：①微波 96℃ ± 10min× 2；②
直接加温 100℃,15min；③水浴锅 100℃,
15min；④高压锅 /消毒锅 120℃,5min；⑤
真空加热 10min；⑥直接烤片法。
(3)修复介质,0.05MEDTA;0.05MEGTA;
0.01M pH6.0柠檬酸缓冲液 (CB)；
0.05MTris-HCL(pH1-12系列 );0.01M
pH7.0 PBS;2%硫酸铝； 2％硝酸铝；
生理盐水；蒸馏水 ; 认为修复介质种类和溶液的摩尔浓度对修复效果影响较小，而 pH值则影响较大。缓冲液以
CB和 Tris-HCL较常见。
(4)温度与修复时间的关系：许多的实验结果表明，温度高修复时间短，呈正相关。
例如,Ki-67,P-gp的检测，利用同一切片，
达到相同的染色结果如下步骤：① 100℃
20min；② 90℃ 40min ；③ 80℃ 60min ；④
70℃ 20h 。
(5)选择最佳的修复方法根据下表选择最佳的修复方法柠檬酸 Buffer pH1-2 PH6 pH10-11
Tris-HCL Buffer pH1-2 pH8 pH10-11
微波 100℃ 10min× 2 切片 1 切片 2 切片 3
压力锅 120℃ 10min 切片 4 切片 5 切片 6
微波或水浴锅 90℃ 30min 切片 7 切片 8 切片 9
切片 10作阳性对照，不作任何处理
(6)AR应注意的问题：高温 AR因其机理尚不清楚，对某些存在的问题或现象不可能用设计对照的方法加以解决或解释清楚，
例如，有些抗体在冰冻切片上不表达，或表达率很低，但石蜡切片用 AR后，却能很好地表达；
某些应表达在胞浆或膜上的抗原，经过量修复后，绝大部分表达在核内；某些应表达在核内的抗原，经过量修复后出现在细胞浆内。因此对结果的判断要作出客观的分析。在操作过程中还应注意如下问题：
① 热处理后应注意自然冷却；
②热处理液不要让其煮干；
③不要任何抗原的检测都使用该方法；
④一批抗原的检测其温度和时间一定保持一致；
⑤ 形态学结构的改变：一般经高温修复后胞浆无明显的破坏，而对细胞核内影响较大，会出现核破裂，苏木素淡染等现象。
⑥如果在常用的修复液无法得到阳性结果，
或经修复后抗原定位发生改变，可改用某些不常用的修复液，或加一些螯合剂，如
EDTA和 EGTA等可改善某些抗原的修复。
六、抗体的购置及注意事项
1.抗体的购置 目前商品化抗体已有上千种，一种抗体可以有数家公司生产，
其质量的好坏也存在很大差异，首先应选择一家好的生产公司，根据文献提供的信息，选择所需试剂的型号。
2.购置抗体的注意事项
(1)种属：单克隆抗体，多克隆抗体
(2)能否用于石蜡切片
(3)稀释度
(4)特异性，交叉反应
(5)用何种组织前处理形式
(6)包装单位，价格
3.抗体的大致分类
(1)癌基因与抗癌基因标记物；
(2)细胞凋亡标记物；
(3)各种信号传导标记物
(4)各种正负调控基因标记物
(5)细胞增殖及调控标记物；
(6)凝集素类标记物
(7)激素受体标记物
(8)病毒性标记物
(9)各类肿瘤标记物
(10)耐药基因标记物七、抗体最佳稀释度的测定和保存
1.直接测定法一抗稀释度 特异性染色 非特异性染色
1:50 ++++ ++
1:100 ++++ ++
1:200 ++++ ++
1:400 ++++ +
1:500 +++ (－ )
阴性对照 (－ ) (－ )
2.棋盘法
3.抗体稀释液 抗体稀释液是从事 IHC
工作实验室必备，其制备方法如下,1克明胶 (红、绿 )溶在 300ml 0.2M pH7.6 TBS
中，加温，搅拌使其溶解，待其冷却后，
加入 1克牛血清白蛋白和 100mg NaN3,4℃
保存。
4.抗体的保存 商品化一抗或自制一抗均需加入防腐剂，在 4℃ 中保存一年其质量不会有太多的改变，如一次购置量大，可
10μ l/支分装，标上号,-40℃ 保存备用。
用抗体稀释液稀释一抗可在 4℃ 中保存一年。
八、显示系统及衬染剂的选择和配制
(一 )显示系统目前用于 IHC的标记酶主要有 HRP，
AKP，其显示系统分别为：
1.HRP常用的发色基因：
(1)3,3’-二氨基联苯胺盐酸盐 (3、
3’-diaminbezidine;DAB);
(2)3-氨基 -9-乙基卡吧唑 (3-amino-
9-ethlylcarbazde;AEC);
(3)四甲基联苯胺；
(4)盐酸对苯二胺；
(5)4-氯 -1-萘酚；
(6)高香草酸
(7) α –萘酚派若宁
2.AKP常用的发色基团：
(1)BCIP（ 5-溴 -4-氯 -3-吲哚基磷酸 )
＋ NBT(硝基四氮唑蓝 )；
(2) α –萘酚 AS-BI磷酸盐＋快红或快蓝。
3.配制方法
(1)DAB:50mg DAB溶在 0.01M pH7.6
100ml Tris-Hcl中，加入 0.03% H2O2，显色 8～ 12min，终产物为不溶性棕褐色颗粒状。
(2)AEC:取 40mg AEC溶在 5ml二甲基甲酰胺中，待完全溶解后，加入 0.05mol/L
pH5.5醋酸盐缓冲液 50ml，最后加入 0.03%
H2O,终产物为红色可溶性。
(3)4-氯 -萘酚：取 100mg 4cl-1-萘酚溶于
10ml无水乙醇中，待完全溶解后加入
0.05M pH7.6 TB 190ml,过滤后加入
0.03% H2O2。
(二 )衬染剂的选择和配制
IHC染色后必须进行衬染，以衬托出组织形态结构，使形态与机能密切相关，
以利于结果的分析。
1.苏木素衬染色剂
(1)Mayer氏苏木素：取 1g Mayer氏苏木素加温溶于 100ml蒸馏水中，再加入 50g
碘酸钠和 50g钾明矾，溶解后加入枸橼酸和水合氯醛，溶解后过滤。
(2)Harris氏苏木素：取 2.5g Harris氏苏木素溶于 25ml无水乙醇中，另将钾明矾加温溶于 500ml蒸馏水中，待钾明矾全部溶解，再将二液混合在一起，加入氧化汞，
溶解 30min，冷却后过滤，使用时加醋酸
4ml，可增加染色强度。
2.甲基绿,取 2％甲基绿水溶液 20ml倾入洁净的分液漏斗，加入三氯甲烷充分摇荡混合，使甲基绿中的甲基紫溶于氯仿中而呈紫红色。旋动分液漏斗下部的砂塞，移去紫红色的三氯甲烷，如此反复更换氯仿，
直到氯仿为无色。
3.核固红,取 0.1g核固红溶于 100ml 15％
硫酸铝水溶液，加热溶解，冷却后过滤。
九,IHC常用缓冲液：
1.0.01M pH7.4 PBS
2.0.02M pH7.6 TBS
RCA法 IGSS
IS-PCR CSA法
UIP Envision
LSAB法双 PAP法
PAP法
ABC法桥法间接法直接法第一部分组织与细胞材料的制备内容：组织与细胞材料的取材和保存主要内容一、人体组织标本的取材二、动物组织标本的取材三、取材注意事项四、细胞标本的准备五、组织的固定、脱水、透明和包埋六、切片七、组织与细胞材料的保存概 述免疫组织化学（ Immunohistochemistry;
IHC） 技术是一门综合性技术，除了具备优质、高效，特异的一抗，敏感的检测方法，
稳定的显示系统外，还需要掌握组织标本或标本的取材、固定、包埋、切片，以及 IHC
前的处理，内源性酶的消除方法，非特异背景的消除方法，怎样防止 IHC染色过程中的脱片。
一、人体组织标本的取材手术切除标本，各种活检穿刺标本和尸体解剖标本。
1.手术切除标本的取材：
抗原在组织中的分布常不均一，取材时应考虑：主要病灶，病灶与正常组织交界处，远离病灶的正常组织。
组织大小,长 1cm× 宽 1cm× 厚 0.2～ 0.3cm。
2.各种小组织的活检取材：
它不仅体积小，取材困难，不易取到主要病灶，因此对标本的处理应特别慎重，
及时固定，包埋时要平整。
3.穿刺标本的取材：
光镜（ HE、特殊染色,IHC,ISH）
电镜（透射电镜、免疫电镜）
4.尸检组织的取材病人死亡后，一般要在数小时后才能做尸检，因此，及时取材，尽早固定是开展 IHC检测的关键。
二、动物组织标本的取材动物的处死方式一般为活杀，组织标本来源较新鲜,10min内即可完成固定和冷冻保存，脑组织和神经组织应采用灌注固定后，再进行后固定。
动物处死方法：
1.麻醉法 乙醚或 4％戊巴比妥静注
2.空气栓塞法
3.断头法
4.击头法
5.股动脉放血法三、组织取材注意事项
1.组织要求离体后 30min内浸入固定液，
尤其是开展分子生物学工作。动物组织取材要求心脏还在跳动时取材。
2.注意防止人为因素的影响刀和剪要快，刀要足够长。
3.组织块的大小厚为 0.1～ 0.3cm，大小可根据需要而定
4.动物和人体组织的取材位置要视研究目的，观察部位而定
5.取材时间原则上，应尽快取材，但比较大的手术标本如胃、肺、肠等器官，最好先固定后取材。
6.注意包埋方向
7.边缘标记
8.保持材料的清洁
9.切除不需要的部分
10.明确编号，登记
11.骨组织还需脱钙四、细胞材料的准备细胞的取材和制片法：
1.印片法,常用于活检或手术切除标本。
将新鲜标本沿病灶中心剖开，将病灶区轻压于载玻片上，吹干后立即固定 20～ 30min。
优点,操作简单，抗原保存好缺点,细胞厚薄不均,IHC染色易引起背景染色。
2.穿刺吸取法
3.沉淀法 主要用于胸水、腹水、尿液、脑脊液等体液多而细胞较少的标本。
（ 1）常规细胞玻片制片法
（ 2）单核细胞分离法体液沉渣细胞学切片制作：
1,取两只 10ml试管,分别装入体液 10ml,离心后留取沉渣 。
2,滴入蛋清 1～ 2滴混匀,加入固定液 5ml,固定 1h,离心后留取沉渣 。
3,将试管剪开,底部 1cm处,取出沉渣,用擦镜纸包好,进行常规脱水,包埋,石蜡切片 。
该方法可以免除大范围的阅片,又可避免漏诊,可重复切片,使 IHC标记更为方便 。
自动细胞离心涂片机制作胸腹水细胞学涂片方法 。
3.制备细胞玻片应注意
（ 1）易脱片；
（ 2）细胞应集中在直径 0.6～
1.0cm的圆圈内，总数 105-106；
（ 3）富于粘液的标本，未经处理不宜做 IHC。
4.活细胞标本的制备法培养的活细胞可分贴壁和悬浮二种。贴壁细胞可将
（ 1）细胞大量培养后，经消化将细胞制成悬液（ 106）涂在涂有切片粘合剂的载玻片上，
凉干后固定。
（ 2）将细胞直接培养在盖玻片上。
（ 3）将细胞直接培养在 6孔或 9孔板上，经固定后可行 IHC。
五、组织标本的固定
1.目的
(1)防止组织细胞的死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织细胞的固有形态。
(2)使细胞内的蛋白质、脂肪、糖和酶等各种抗原成份转变成不溶性物质，以保持它原有的结构与生活时相仿。
（ 3）使组织中的各种物质沉淀和凝固起来而产生不同的折射率，造成光学上的差异，以便染色后易于鉴别和观察。
（ 4）固定剂兼有硬化作用、使组织硬化、
增加组织硬度、便于制片。
（ 5）防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有形态结构。
（ 6）经过固定的组织能对染料产生不同的亲和力而着色清晰，便于辨认。
2.固定液的种类
(1)甲醛固定液
10％福尔马林
10％中性福尔马林
10％中性缓冲福尔马林
(2)4％多聚甲醛固定液
(3)Bouin S液及改良 Bouin S液
(4)Zenker S液重铬酸钾 25mg
氯化汞 10g
冰醋酸 50ml
蒸馏水 800ml
(5)Zamboni S液多聚甲醛 20g
饱和苦味酸 150ml
PB液至 1000ml
(6)PLP固定液：过碘酸 -赖氨酸 -多聚甲醛固定液。该固定剂较适合于富含糖类组织，
对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。
(7)PLPD固定液 取 PLP固定液 25ml，加入 2.5%重铬酸钾 25ml。
(8)Kanovsky S液
(9)Methacarn固定液 甲醇 60ml，氯仿
30ml，醋酸 10ml，混均后 4℃ 保存备用，对核内抗原的保存效果较好。
(10)PEG液
(11)0.4%对苯醌
(12)碳二亚酰胺 -戊二醛（ ECG-G）液
(13)丙酮及醇类固定剂 丙酮、乙醇类固定剂其固定原理主要是对蛋白质的沉淀而发生固定作用。
3.固定方法的选择及注意事项
(1)大小 2cm× 2cm× 0.3cm
(2)及时固定
(3)固定时间 固定时间要视组织块的厚薄，固定液的种类及浓度，温度而定，原则上，组织块大小与固定时间成正比，固定液的穿透力及浓度与固定时间成反比。
(4)组织固定后必须彻底冲洗。
影响固定的因素
1,温度 常规固定温度是室温 (22℃ ),某些酶的固定要求在 37℃ 下进行,某些病毒则需在低温下固定 。 冰冻切片用丙酮固定,最佳在 -
20℃ ~－ 40℃ 。
2,浓度 10%中性甲醛,4%多聚甲醛,乙醇常用 95%,丙酮为原液 。
3.时间 固定时间要视组织块的大小,固定液的种类和浓度,固定所处的环境温度等条件而定 。 原则上,组织块大小与固定时间成正比 。
六、组织脱水、浸蜡及包埋
1.目的 由于石蜡不溶于水和醇类试剂，只溶解在二甲苯类试剂中。因而,组织经固定和水洗后含大量水分,需用乙醇类试剂进行脱水,水脱完后,组织内含有大量的乙醇,还必须用能溶解乙醇的二甲苯来置换,最后经浸蜡,组织细胞内被大量石蜡支称,才使组织能用于石蜡切片。
2.脱水剂的种类,非石蜡溶剂的脱水剂和脱水兼石蜡溶剂的脱水剂。
常用的脱水剂,(1)乙醇； (2)丙酮；
(3)正丁醇； (4)淑丁醇； (5)环乙酮； (6)
松脂醇； (7)二氧陆环。
3.常用的透明剂,(1)二甲苯； (2)甲苯；
(3)苯； (4)香柏油； (5)苯甲酸甲酯； (6)
氯仿； (7)冬青油 ;(8)苯胺油
4.原则 脱水方法甚多，一般需逐级进行脱水，否则可引起组织强烈收缩，组织变形。
在脱水完全的前提下，组织的透明必须彻底，但不能过长，否则会引起组织切片困难。
5.常规石蜡包埋过程
(1)脱水,75％,85％乙醇,95％ Ⅰ,Ⅱ,
Ⅲ 乙醇，无水乙醇 Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ 。
(2)透明：二甲苯 Ⅰ,二甲苯 Ⅱ,二甲苯 Ⅲ
(3)浸蜡：石蜡 Ⅰ,石蜡 Ⅱ,石蜡 Ⅲ
(4)石蜡包埋：修蜡块，标号
6.根据本实验室经验各种不同类型组织的石蜡包埋条件
(1)大动物组织 （狗、兔、小儿尸检）脱水、透明和浸蜡时间
75％乙醇 30～ 120min,85％乙醇 30～
120min,95％乙醇 Ⅰ 2h,95％乙醇 Ⅱ 2h,
95％乙醇 Ⅲ 过夜，无水乙醇 Ⅰ30 ～ 60min，
无水乙醇 Ⅱ30 ～ 60min，无水乙醇
Ⅲ60min ～ 120min，二甲苯 Ⅰ,Ⅱ 和 Ⅲ 各
15min（可视观察结果而定），石蜡
Ⅰ30min,石蜡 Ⅱ1 ～ 2h，石蜡 Ⅲ2 ～ 3h。
(2)小动物组织脱水、透明和浸蜡时间
75％乙醇 30min,85％乙醇 30min,95
％乙醇 Ⅰ1h,Ⅱ1h,Ⅲ 过夜或 2h，无水乙醇 Ⅰ,Ⅱ 和 Ⅲ 各 30min，二甲苯 Ⅰ15min,
Ⅱ10min,Ⅲ10min （肉眼观察），石蜡
Ⅰ30min,石蜡 Ⅱ30min,石蜡 Ⅲ1 ～ 2h。
(3)活检或手术切除标本的脱水透明和浸蜡时间
75％乙醇 30min,85％乙醇 1h,95％
乙醇 Ⅰ1h,Ⅱ1h 和 Ⅲ4h 或过夜，无水乙醇 Ⅰ30min,Ⅱ1 ～ 2h和 Ⅲ4h,二甲苯
Ⅰ30min,Ⅱ30min 和 Ⅲ1h 。
七、组织切片切片可分石蜡切片、冰冻切片、火棉胶切片,IHC切片要求不同与常规切片，需连续有序，防止脱片等特殊要求。
1.切片前的准备工作
(1)载玻片的清洁,市售载玻片需经清洁液泡 24h，流水冲洗，系列乙醇浸泡，
凉干涂胶，如需开展原位杂交，还需将玻片 240℃ 烤 2h。
(2)切片粘合剂的种类多聚赖氨酸（分子量 300KD）,0.5%浓度。
APES试剂（ 3-氨基、丙基三氧基硅烷）：干净载玻片 → 丙酮 5min →APES （ 1ml+50ml丙酮）：
用镊子夹住浸入 APES试剂 1～ 3次 → 纯丙酮洗二次
→ 干燥玻片 → 用铝箔包好，室温或 4℃ 保存备用。
铬矾明胶液：
铬矾 0.5g 明胶 5g H2O2 1000ml
甲醛明胶液：
40％甲醛 2.5ml 明胶 0.5g H2O2 100ml
2.石蜡切片：
3.冰冻切片,IHC冰冻切片,ISH冰冻切片
(恒冷箱冰冻切片机和开放式冰冻切片机 )
4.切片要求及注意事项：
(1)连续切片按序贴在玻片的下 1/3。
(2)52－ 60℃ 烤片 18h。
(3)切片厚 2～ 4μ m。
(4)切片刀要快
(5)编上号
(6)切片可在 4℃ 保存数年（石蜡切片）
(7)冰冻切片需凉干后立即固定
(8)冰冻切片分固定和新鲜组织，固定组织需经庶糖处理 24h，冰冻切片。
(9)冰冻切片固定后 -80℃ 保存备用八、组织与细胞材料的保存
1.冷冻保存：
-80℃,-145℃,-198℃
组织应在离体 30min内，快速取材，放入专用冷冻管中，并编上号，登记在册。
2.新鲜组织经适当固定后，装入冻存管中,-80℃ 冻存。
3.蜡块的保存
4.活细胞的保存 可根据需要将细胞直接培养在盖玻片上,9孔板上的细胞可经固定后 -80℃ 保存备用，大容量培养的细胞收集冻存在液氮中。
第二部分
IHC的一些基本技术主要内容一、实验的设计二、石蜡切片的脱蜡至水三、内源性酶的消除方法四,IHC的非特异性染色五、抗原的暴露和修复六、抗体的购置及注意事项七、抗体最佳稀释度的测定和保存八、显示系统及衬染剂的选择和配制九,IHC常用缓冲液一、实验的设计
1.查阅相关文献，列出要做的
IHC指标，根据经费情况，选择相关公司购置特异性抗体和检测试剂。
2.列出 IHC实验操作流程，选择何种 IHC前处理方式。
3.通过预实验寻找第一抗体的最佳稀释度，
应设置何种对照。
4.每批实验应用同一稀释度的一抗，孵育时间和温度，同一的显色时间。
5.列出阳性判定的标准
6.预期达到的目标二、石蜡切片脱蜡至水冰冻切片从 -80℃ 取出，凉干或电吹风吹干后可直接进行免疫组化标记。石蜡切片需经如下脱蜡才能做 IHC。
二甲苯 Ⅰ10min,二甲苯 Ⅱ10min,
二甲苯 Ⅲ10min,无水乙醇 2min,95％
乙醇 2min,85％乙醇 2min,75％乙醇
2min，流水冲洗。
三、内源性酶的消除方法
(一 )内源性过氧化物酶的消除方法：
1,0.3%～ 3%H2O2甲醇液 20min
2,1％ H2O2 20min
3,3％苯肼溶液 37℃ 1h
4,0.075%盐酸甲醇液 30min
5.DAB-H2O2溶液中加 0.005M NaN3
6.过碘酸 -硼酸钠,0.5%过碘酸 10min，
经洗后 1％硼酸钠处理 10min。
7.20mol/L-100mol/L抗坏血酸 30～
60min。
(二 )内源性碱性磷酸酶的消除方法
1,10％醋酸 10min
2,0.5mol/L碳酸氢钠（ pH9.0） 20min
3,1mol/L左旋咪唑 20min
(三 )内源性生物素的消除方法
1.用 2-甲基 -D苷露糖饱和生物素
2.先用 25μ g/ml卵白素孵育 15min,PBS
洗 10min，移至生物素饱和液中处理 15min，
PBS洗 15min。
四,IHC的非特异性染色
1.特异性抗体不纯
2.抗体免疫球蛋白所带电荷与检测组织所带电荷差异很大，可引起非特异染色。
3.IgG的交叉反应
4.共同抗原决定簇
5.单一决定簇抗体的异质性
6.特异性抗原弥散
7.IgG受体干扰
8.鼠源性抗体检测鼠源性组织
9.内源性抗生物素蛋白结合物内源性抗生物素蛋白指的是体内能够与抗生物素蛋白结合的分子或基团,在体内含有这种分子或基团的物质主要是内源性生物素 。 可以用 20%蛋清封闭,或用 2%
卵蛋白进行封闭,或不采用亲和细胞化学方法 。
解决方法：
1.用正常二抗血清吸附
2.将组织用酶消化或抗原修复
3.二抗用木瓜酶将抗体结合部 Fab切除
4.高度稀释特异性一抗五、酶消化和抗原修复
1.为什么要进行酶消化和抗原修复？
(1)固定液的影响 自 1893年 Ferdinand
Blum创立组织固定以来，为了避免组织固定液对抗原决定簇的影响，已经寻找到几十种固定液，目的就是为了对一定抗原起到保护作用，同时还能获得良好的组织形态结构。
目前无一种固定液适用于所有的抗原，从组织细微结构的保存，稳定、简便和廉价综合评估上，甲醛最优。
甲醛使蛋白质发生凝固，自身和之间会发生交联，交联时会使蛋白质的四级和三级结构的折叠方向发生改变，使蛋白质苯环结构上的抗原决定簇发生改变，而影响检测。
(2)抗体制备的影响
2.酶消化
(1)原理：
1)去除覆盖于抗原决定簇表面的杂蛋白
2)断交联
(2)蛋白酶的种类胰蛋白酶 0.05%～ 0.1％胰蛋白酶加入等量的氯化钙，用 0.1N NaoH调 pH至 7.8。
消化时间 37℃ 30min 。
胃蛋白酶 0.4%胃蛋白酶，用 0.01N HCI
稀释，消化时间 37℃ 30 ～ 180min。
蛋白酶 K 20μ g/ml，用 pH8.0 0.5M
Tris-HCI配制，消化时间 37℃ 20 ～ 40min。
链酶蛋白酶 0.1%，用 pH 7.4,0.5M
Tris-Hcl稀释，消化时间 37℃ 1 ～ 4h。
无花果蛋白酶 0.1%浓度，用 0.2M
pH7.4 PBS稀释，消化时间 37℃ 30 ～
60min。
菠萝蛋白酶 其浓度为 0.4%～ 1％，溶在 0.01M,pH7.4 PBS中,37℃ 消化 30～
120min。
尿素 浓度 3M 37℃ 5 ～ 30min
(3)原则及注意事项胃蛋白酶和菠萝蛋白酶主要用于细胞间质抗原的检测前消化，其余蛋白酶均为细胞内抗原的显示消化。
在配制和使用时应考虑到酶激活的最佳 pH值，消化温度、浓度和孵育时间。
3.热诱导的抗原修复,抗原修复 (Antigen
Retrieval;AR)是以高温、高压对常规固定的石蜡切片进行抗原修复或复原的一种非蛋白酶消化以提高抗原抗体阳性检测的一种方法和技术手段。
(1)依据,40年代美国学者 Fraenkel-
conrat等实验证实，甲醛和蛋白水解交联过程中氨基酸侧链上的某些基团 (抗原决定簇 )如咪唑、吲哚等基团受到影响，通过
120℃ 高温或强碱处理后，可使交联打开。
(2)修复方式：①微波 96℃ ± 10min× 2；②
直接加温 100℃,15min；③水浴锅 100℃,
15min；④高压锅 /消毒锅 120℃,5min；⑤
真空加热 10min；⑥直接烤片法。
(3)修复介质,0.05MEDTA;0.05MEGTA;
0.01M pH6.0柠檬酸缓冲液 (CB)；
0.05MTris-HCL(pH1-12系列 );0.01M
pH7.0 PBS;2%硫酸铝； 2％硝酸铝；
生理盐水；蒸馏水 ; 认为修复介质种类和溶液的摩尔浓度对修复效果影响较小，而 pH值则影响较大。缓冲液以
CB和 Tris-HCL较常见。
(4)温度与修复时间的关系：许多的实验结果表明，温度高修复时间短，呈正相关。
例如,Ki-67,P-gp的检测，利用同一切片，
达到相同的染色结果如下步骤：① 100℃
20min；② 90℃ 40min ；③ 80℃ 60min ；④
70℃ 20h 。
(5)选择最佳的修复方法根据下表选择最佳的修复方法柠檬酸 Buffer pH1-2 PH6 pH10-11
Tris-HCL Buffer pH1-2 pH8 pH10-11
微波 100℃ 10min× 2 切片 1 切片 2 切片 3
压力锅 120℃ 10min 切片 4 切片 5 切片 6
微波或水浴锅 90℃ 30min 切片 7 切片 8 切片 9
切片 10作阳性对照，不作任何处理
(6)AR应注意的问题：高温 AR因其机理尚不清楚，对某些存在的问题或现象不可能用设计对照的方法加以解决或解释清楚，
例如，有些抗体在冰冻切片上不表达，或表达率很低，但石蜡切片用 AR后，却能很好地表达；
某些应表达在胞浆或膜上的抗原，经过量修复后，绝大部分表达在核内；某些应表达在核内的抗原，经过量修复后出现在细胞浆内。因此对结果的判断要作出客观的分析。在操作过程中还应注意如下问题：
① 热处理后应注意自然冷却；
②热处理液不要让其煮干；
③不要任何抗原的检测都使用该方法；
④一批抗原的检测其温度和时间一定保持一致；
⑤ 形态学结构的改变：一般经高温修复后胞浆无明显的破坏，而对细胞核内影响较大，会出现核破裂，苏木素淡染等现象。
⑥如果在常用的修复液无法得到阳性结果，
或经修复后抗原定位发生改变，可改用某些不常用的修复液，或加一些螯合剂，如
EDTA和 EGTA等可改善某些抗原的修复。
六、抗体的购置及注意事项
1.抗体的购置 目前商品化抗体已有上千种，一种抗体可以有数家公司生产，
其质量的好坏也存在很大差异，首先应选择一家好的生产公司，根据文献提供的信息，选择所需试剂的型号。
2.购置抗体的注意事项
(1)种属：单克隆抗体，多克隆抗体
(2)能否用于石蜡切片
(3)稀释度
(4)特异性，交叉反应
(5)用何种组织前处理形式
(6)包装单位，价格
3.抗体的大致分类
(1)癌基因与抗癌基因标记物；
(2)细胞凋亡标记物；
(3)各种信号传导标记物
(4)各种正负调控基因标记物
(5)细胞增殖及调控标记物；
(6)凝集素类标记物
(7)激素受体标记物
(8)病毒性标记物
(9)各类肿瘤标记物
(10)耐药基因标记物七、抗体最佳稀释度的测定和保存
1.直接测定法一抗稀释度 特异性染色 非特异性染色
1:50 ++++ ++
1:100 ++++ ++
1:200 ++++ ++
1:400 ++++ +
1:500 +++ (－ )
阴性对照 (－ ) (－ )
2.棋盘法
3.抗体稀释液 抗体稀释液是从事 IHC
工作实验室必备，其制备方法如下,1克明胶 (红、绿 )溶在 300ml 0.2M pH7.6 TBS
中，加温，搅拌使其溶解，待其冷却后，
加入 1克牛血清白蛋白和 100mg NaN3,4℃
保存。
4.抗体的保存 商品化一抗或自制一抗均需加入防腐剂，在 4℃ 中保存一年其质量不会有太多的改变，如一次购置量大，可
10μ l/支分装，标上号,-40℃ 保存备用。
用抗体稀释液稀释一抗可在 4℃ 中保存一年。
八、显示系统及衬染剂的选择和配制
(一 )显示系统目前用于 IHC的标记酶主要有 HRP，
AKP，其显示系统分别为：
1.HRP常用的发色基因：
(1)3,3’-二氨基联苯胺盐酸盐 (3、
3’-diaminbezidine;DAB);
(2)3-氨基 -9-乙基卡吧唑 (3-amino-
9-ethlylcarbazde;AEC);
(3)四甲基联苯胺；
(4)盐酸对苯二胺；
(5)4-氯 -1-萘酚；
(6)高香草酸
(7) α –萘酚派若宁
2.AKP常用的发色基团：
(1)BCIP（ 5-溴 -4-氯 -3-吲哚基磷酸 )
＋ NBT(硝基四氮唑蓝 )；
(2) α –萘酚 AS-BI磷酸盐＋快红或快蓝。
3.配制方法
(1)DAB:50mg DAB溶在 0.01M pH7.6
100ml Tris-Hcl中，加入 0.03% H2O2，显色 8～ 12min，终产物为不溶性棕褐色颗粒状。
(2)AEC:取 40mg AEC溶在 5ml二甲基甲酰胺中，待完全溶解后，加入 0.05mol/L
pH5.5醋酸盐缓冲液 50ml，最后加入 0.03%
H2O,终产物为红色可溶性。
(3)4-氯 -萘酚：取 100mg 4cl-1-萘酚溶于
10ml无水乙醇中，待完全溶解后加入
0.05M pH7.6 TB 190ml,过滤后加入
0.03% H2O2。
(二 )衬染剂的选择和配制
IHC染色后必须进行衬染，以衬托出组织形态结构，使形态与机能密切相关，
以利于结果的分析。
1.苏木素衬染色剂
(1)Mayer氏苏木素：取 1g Mayer氏苏木素加温溶于 100ml蒸馏水中，再加入 50g
碘酸钠和 50g钾明矾，溶解后加入枸橼酸和水合氯醛，溶解后过滤。
(2)Harris氏苏木素：取 2.5g Harris氏苏木素溶于 25ml无水乙醇中，另将钾明矾加温溶于 500ml蒸馏水中，待钾明矾全部溶解，再将二液混合在一起，加入氧化汞，
溶解 30min，冷却后过滤，使用时加醋酸
4ml，可增加染色强度。
2.甲基绿,取 2％甲基绿水溶液 20ml倾入洁净的分液漏斗，加入三氯甲烷充分摇荡混合，使甲基绿中的甲基紫溶于氯仿中而呈紫红色。旋动分液漏斗下部的砂塞，移去紫红色的三氯甲烷，如此反复更换氯仿，
直到氯仿为无色。
3.核固红,取 0.1g核固红溶于 100ml 15％
硫酸铝水溶液，加热溶解，冷却后过滤。
九,IHC常用缓冲液：
1.0.01M pH7.4 PBS
2.0.02M pH7.6 TBS
