第十章 吸光光度法
教学目的：掌握光度法的基本原理，了解光度分析条件的控制，分光光度法的应用范围。
教学重点：Beer定律；光度分析的应用。
教学难点：光吸收原理；光度分析的准确度。
吸光光度法：基于物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法，包括比色法和分光光度法。
分光光度法的优点：灵敏、准确、快速、选择性好、适于微量组分的测定。
10.1 吸光光度法的特点
一、 吸光光度法的特点
1．光的基本性质
紫外光：200-400nm 可见光：400-750nm 红外：0.75-50(m
单色光：单一波长的光。 复合光：由不同波长的光组成的光。
互补色光：按一定比例混合，能够组成白光的两种光互称为互补色光。
溶液呈现的颜色是它吸收光的互补色。
两互补色按一定比例混合后，可得到白色。
二、光吸收的基本定律
朗伯－比尔定律
1790年，Lambert用实验指出，当光通过透明介质时，光的减弱程度与光通过介质的光程成正比。1852年，Beer研究证明了，光的吸收程度与透明介质中光所遇到的吸光质点的数目成正比，在溶液中即与吸光质点的浓度成正比。
吸光度： 透光率：
2．摩尔吸收系数和桑德尔灵敏度
（1）摩尔吸收（光）系数(
A＝Kbc b：cm c：mol/L
A=(bc (:摩尔吸收系数，只与波长有关。单位：L.cm-1.mol-1
物理意义：一定(下，b＝1cm，c＝1 mol/L时的吸光度。
实际工作中不能用c＝1 mol/L的溶液测吸光度(A＝0.2-0.7)。(能反映方法的灵敏度，光度法测定(：104，一般(:105已很灵敏。
2．吸光度的加和性
共存的多种吸光物质对同一波长光吸收的光度值分别为A1，A2，…An，则总吸光度为：
A=A1+A2+…+An （据此可进行多组分的测定）
3、偏离朗伯－比尔定律的原因
(1)．非单色光
(2)．化学因素
介质不均匀或由于溶液本身的化学反应引起的偏离。溶液本身离解、缔合、络合
10.3 显色反应和显色条件的选择
一、显色反应要求
显色反应：将待测组分转化成有色化合物的的反应。M＋L＝ML
1.要求：（1）选择性好；（2）灵敏度高，(>104；（3）有色化合物ML要稳定，不分解；
（4）ML的组成要一定（只ML无MLn）；（5）ML与L颜色差别大,吸收峰波长差：((>90nm.
2．显色剂：满足以上要求。有机显色剂
二、显色条件的选择
1.溶液的酸度：M＋L＝ML（显色剂L存在酸效应(L（H））
影响显色剂的溶度
影响M的存在状态
影响ML的组成和稳定性，如Fe3＋－磺基水杨酸 pH 组成 颜色
2-3 1：1 紫红
4-8 1：2 棕褐
8-10 1：3 黄色
2.显色剂用量：显色剂过多有时会引起副反应，加入量要严格控制，可通过实验确定。
3.温度：通过实验确定温度范围，通常在室温下进行。
4．溶剂：一般螯合物在有机溶剂中溶解度大，提高显色反应的灵敏度。如Cu(SCN)42－在水中大部分离解，几乎无色；在丙酮中呈蓝色。
5.显色时间：通过实验找出适宜的显色时间。
9．干扰组分：共存组分与显色剂生成有色络合物，正干扰；生成无色络合物，负干扰。
干扰的消除：
控制一定酸度，使干扰组分不生色。
掩蔽剂，与干扰组分生成无色物。
（3） 选择适当的波长。
（4） 选择适当的参比液
（5） 分离干扰组分
10.4 测量条件的选择
一、测量波长的选择
(1)“最大吸收原则”：选择被测物质的最大吸收波长的光作为入射光。(无干扰)
(2)”吸收最大，干扰最小”：在最大波长处有其他物质干扰时。
二、参比溶液的选择
1．M、L均无色，可用蒸馏水作参比。
2. L无色，M有色，可用不加显色剂的被测试液作参比溶液。
3. L有色，M无色，可选择不加试样溶液的试剂空白作参比溶液。
4．L、M均有色，可将一份试液加入适当掩蔽剂，将被测组分掩蔽起来，使之不再与显色剂作用，而显色剂及其他试剂均按试液测定方法加入，以此作为参比溶液。
改变加入试剂的顺序，使被测组分不发生显色反应，可以此溶液作为参比溶液消除于扰。
吸光度范围的选择
吸光度范围的选择：A:0.2-0.8（T为95%-15%）(相对误差较小)
10.5 目视比色法和光度计的基本部件
一、目视比色法：比较透过光的强度
标准色阶：在相同条件下显色，目视比较。
特点：灵敏度高，准确度低，不同人看，结果不同，不符合朗伯－比尔定律也可用目视比色法，因为比较的是透过光。
二、分光光度法
1．分光光度法的原理和特点
(1).光电比色法：比较溶液对某一波长光的吸收情况。比目视比色法的准确度和选择性好。
(2).吸光光度法：与光电比色法的原理相同，只是二者获得单色光的方法不同，前者使用滤光片，后者使用光栅、棱镜，因而比光电比色法的准确度和选择性好。
2.光度计的基本部件：光源－单色器－比色皿（吸收池）－检测器－显示器
（1）光源 钨丝灯：可见、红外 400－1000nm氢灯或氘灯：紫外 190－350nm
（2）单色器
滤光片：有机玻璃片或薄膜，利用颜色互补原理。
棱镜：根据物质的折射率与光的波长有关。玻璃棱镜:可见,石英棱镜:紫外、可见
光栅：在玻璃片或金属片上刻划均匀的线，1200条/mm, 衍射、干涉原理
（3）吸收池：玻璃:可见, 石英:紫外、可见
（4）检测器：光电转换器件（光电管、光电倍增光，光电二极管阵列）。利用光电效应，光照产生光电流，测定光电流的大小。
（5）显示器：检流计：72型。数字显示：722型。数字打印：UV－240。
10.6 吸光光度法的应用
一、示差分光光度法
1．原理(高浓度示差分光光度法)
选用比cx浓度稍小的c0为参比,调透光率100%,相当于标尺扩大10倍。
a.先做((~(c标准曲线；b.测待测溶液的((；c.从标准曲线查出相应的(c；d.cx=c0+ (c
设普通光度法和示差光度法的测量误差为x%普通光度法结果：，示差光度法结果：
二、多组分分析
1．原理：当没有合适的参比溶液时可选择双波长吸光光度法；广泛运用于环境试样和生物试样的分析
应用：（1）单组分的测定；（2）两组分共存时的分别测定。
作业：p233 1，2，3，4，5，6
