分子生物学 (分子遗传学 )中心法则
反映了从 DNA?RNA?蛋白质的遗传信息
主流，揭示了生物体内遗传信息的贮存、传递
和表达的规律 。
转录
RNA
翻译
蛋白质 DNA
RNA
（ 病毒）
复制
复制
翻译 蛋白质
（病毒）
反转录
第一节 DNA的生物合成
? DNA→DNA
DNA复制
? RNA→DNA
反转录
两种方式
一,DNA的半保留复制
2.半保留复制的实验证据,
1.定义,
1958年 Meselson和 Stahl用同位素 15N标记 大
肠杆菌 DNA,首先证明了 DNA的半保留复制。
以 亲代 DNA双链 为模板以 碱基互补 方式合成子
代 DNA,这样新形成的子代 DNA中，一条链来自亲
代 DNA,而另一条链则是新合成的，这种复制方
式叫 半保留复制 。
DNA半保留复制
DNA的复制的方式 ------
1958,Messelson and Stahl
实验证实
细菌的 DNA双链
(蓝 线的代表含 15N)
含 15N-DNA的细菌
培养于普
通培养液
第一代 重 DNA
普通 DNA
普通 DNA
DNA半保留复制的证据
可排除全保留式
Why?
混合式
重 DNA
普通 DNA
重 DNA
第二代
半保留式
第一代
故可排除混合式复制方式
培养第一代
结果
重 DNA
普通 DNA 母链
全保留式 半保留式 混合式
重 DNA
普通 DNA
排除全保留式
细菌的 DNA双链
(蓝 线的代表含 15N)
(红 线的代表含 14N)
含 15N-DNA的细菌
培养于普
通培养液
继续培养于
普通培养液
第二代 重 DNA
第一代 重 DNA
普通 DNA
普通 DNA
DNA半保留复制的证据
排除混合式
Why?
DNA的半保留复制的生物学意义,
? DNA在代谢上的稳定性并非指 DNA
是一种惰性物质。
? DNA的半保留复制表明 DNA在代谢上
的 稳定性,是 保证亲代的遗传信息稳
定地传递给后代必要措施。
? 必须具备的基本条件
? 模板,母链 DNA
? 原料, dNTP(包括 dATP,dGTP,dCTP
,dTTP)
? 酶和蛋白质因子,
? 引物,一小段 RNA
? 能量 （ ATP） 及某些 无机离子
参与 DNA复制的酶类与蛋白质因子
及其主要作用
1,拓扑异构酶 （ topoisomerase,Topo）
无 ATP时,作用相当于 TopoⅠ,但切割的
是 双链 DNA某一部位 (断双链 )。
有 ATP时,使带断口、松弛状的 DNA分
子旋紧转变成负超螺旋结构，再连接断端。
不需耗能 (ATP),切割 (断 )
双链 DNA中的 一链,松解螺旋,封闭切口。
又称 切割封口酶 。
TopoⅠ 的作用
TopoⅡ (又称旋转酶 )的作用
2,解链酶 (又称 解螺旋酶或螺旋酶,helicase)
解链酶
作用,断裂互补碱基间的氢键,使 DNA双链分离形
成 ? 复制叉 ? 。
A B C
拓扑异 构酶 II+ATP
拓扑异 构酶 I
DNA的松弛状态与超螺旋
3,单链 DNA结合蛋白 (DNA结合蛋白 )
(single stranded DNA-binding protein,SSB)
作用, 防止重新形成双 链和防止单链模板
被核酸酶水解,维持 DNA单链状态和完整性
4.引物酶 (Primase)
5′ 3′
5′
5′ 5′ 3′
RNA的合成：需引物酶，它是一种特殊
的 RNA聚合酶。
DNA不能从无 → 有合成，需在一小段
RNA基础上合成 DNA
5,DNA聚合酶 （ DNA polymerase,DNA pol）
即依赖于 DNA的 DNA聚合酶（ DDDP）
? 原核生物 （ E.coli） 迄今已知只有 3种：
DNA polⅠ, DNA polⅡ, DNA polⅢ 。
? 真核生物 亦发现有多种 DDDP：
DDDP?,?,?,?,? 。
? 其性质与功能 见表 13-1和表 13-2
?原料,四种脱氧核苷三磷酸
（ dATP,dGTP dCTP dTTP)
?需要模板,以 DNA为模板链，合成子代 DNA,模板可
以是双链，也可以是单链 DNA。 合成产物与模板互补。
? 需要引物,一小段 RNA(或 DNA） 为引物，在大肠杆
菌中,DNA的合成需要一段 RNA链作为引物，引物含
3’ -OH,
?合成方向,5 ? ? 3 ?
(一 ) DNA聚合酶,1956年 Kornberg等在大肠杆菌中
首先发现 DNA聚合酶，其后发现该酶在许多生物中广
泛存在。 该酶的催化性质如下,
表 13-1 大肠杆菌中 DNA聚合酶某些性质
────────────────────────
DNA聚合酶
性 质 ----------------------------------------------------
Ⅰ Ⅱ Ⅲ
────────────────────────
酶分子 /细胞 400 40 20
酶分子量 (kd) 109 90 140
5' →3 '聚合功能 有 有 有
5 ' →3 '外切酶活性 有 有 无
3 ' →5 '外切酶活性 有 有 有
聚合核苷酸数 /分钟 /分子 (37℃ ) 1000 50 15000
主要功能 修复等 修复作用 复制
────────────────────────
表 13-2 真核细胞中 DNA聚合酶的性质
─────────────────────
DNA聚合酶
性质 -------------------------------------------------------
α β γ δ ε
─────────────────────
分布 细胞核 细胞核 线粒体 细胞核 细胞核
分子量 (kd) >250 36-38 160-300 170 256
3’ →5 ’外切酶活性 无 无 有 有 有
5’ →3 ’ 聚合作用 有 有 有 有 有
主要功能 复制 损伤修复 复制 复制 复制,损伤修复
(随从链 ) (领头链 )
─────────────────────
DDDP 5′?3′聚合作用示意图
3′ 模板链 5 ′
5′ 3′
DDDP 的 5′?3′外切及 3′?5′外切 作用示意图
3′?5′外切
5′? 3′外切
5′
3′
C
A
3′
6,DNA连接酶 (DNA Ligase)
作用,在有模板指导的条件下，催化 2个
DNA片段 (两片段间的距离为 1个 3',5' -
磷酸二酯键的键长 )的连接。
原理：在一个 DNA片段的 3' -OH末端和另一
个 DNA片段的 5'-P末端形成 3',5'-磷酸
二酯键，从而实现连接。
特点,原核细胞,需辅助因子 NAD+
真核细胞,不 需辅助因子 NAD+,但需耗
能 (ATP)
表 13-4 参与 DNA复制的酶及蛋白质
─────────────────────
酶或蛋白质 主要作用
─────────────────────
拓扑异构酶类 克服解链时打结及缠绕、松驰或引
进负超螺旋
解链酶类 解开 DNA双链
单链 DNA结合蛋白 维持已解开单链 DNA的稳定
引物酶 合成 RNA引物
DNA聚合酶 Ⅲ DNA复制
DNA聚合酶 Ⅰ 水解引物、填补空隙、修复作用
DNA连接酶 催化双链 DNA中单链缺口的连接
─────────────────────
（五）、参
与 DNA复制
的酶与蛋白
因子总览图
DNA的复制过程
? 复制的起始
? 链的延长
? 复制的终止
复制的起始
1.在拓扑异构酶、解链酶及单链 DNA
结合蛋白的共同作用下,DNA解旋、
解链,形成复制叉 。
2.依赖于单链模板，由引物酶催化按碱
基配对规律 合成 一小段 RNA引物
(原核细胞引物长 50-100个碱基，真
核约 10个碱基 )。
DNA的复制过程, （以大肠杆菌为例）
? 复制的终止,
? 复制的起始
1、起始复合物的形成：称为引发
2,RNA引物的合成
? 链的延伸,
复制起始阶段的特点
真核细胞, 具有多个
起始位点
原核细胞, 仅有一个复制起始位点，但往往是双向复制
链的延长
?引物合成后，由 DNA polⅢ （ 真核细胞
为 DNA聚合酶 ?或 ?)催化，在引物 3'-
OH末端逐一添加与模板链对应互补的
脱氧核苷磷酸,使新合成的链不断延长。
领头链,链的 延长方向 (5' ? 3')与 解链方向 (复制
叉移动方向 )相同,为 连续 合成。
随从链, 链的 延长方向 (5'?3')与 解链方向 (复制
叉移动方向 )相反,为 不连续 合成。
?分段合成的 DNA片段,最初被命名为 冈
崎片段
或领头链
III
三,DNA复制的半不连续性
前导链
滞后链
冈崎片段
前导链,以 3’ → 5’ 方向的
亲代链为模板连续合成的子代链。
滞后链,以 5’ → 3’方向
的亲代链为模板的子代链先逆
复制叉移动方向合成冈崎片段，
再连接成滞后链。
DNA链的延伸
在 DNA聚合酶 Ш 的催化下，
以四种 5’ -脱氧核苷三磷
酸为底物，在 RNA引物的 3’
端以磷酸二酯键连接上脱
氧核糖核苷酸并释放出焦
磷酸。 DNA链的延伸同时进
行前导链和滞后链的合成。
两条链方向相反。
? 前导链
? 滞后链
? 冈崎片段
? 半不连续复制
冈崎模型
复制的终止
1.水解引物及填补空隙
冈崎片段合成后，由 DNA polⅠ (真核细胞
可能是 DNA聚合酶 ?)水解去除 RNA引物,
并 填补 留下的 空隙 (5'? 3')聚合。
2.完整双链 DNA分子的形成
填补空隙后,DNA片段与片段之间还有一
个缺口 (一个 3',5'-磷酸二酯键的长度 ),由
DNA连接酶 催化连接成完整的链，从而产
生 完整的双链 DNA分子 。
DNA复制的精确性（高保真复制）
1、碱基的配对规律,摸板链与新生链之间的碱基配
对保证碱基配错几率约为 1/104～ 1/105。
2,DNA聚合酶的 3’ →5 ’ 外切酶活性的校对功能,使
碱基的错配几率又降低 100～ 1000倍。
3,DNA的损伤修复系统。
DNA复制必须具有 高度精确性,在大肠杆菌的细胞
DNA复制中其 错误率约为 1/109～ 1/1010,即每 109～
1010个核苷酸才出现一个错误，也就是大肠杆菌染色
体 DNA复制 1000～ 10000次才出现一个核苷酸的错误。
这么高的精确性的保证主要与下列因素有关,
二、反转录
(reverse transcription) 概念
以 RNA为模板,dNTP为原料，反转录酶
催化，按碱基配对规律合成 DNA的过程。
反转录酶,又称为 依赖 RNA的 DNA聚合酶
(RNA-dependent DNA polymerase,RDDP)
DNA 转录 RNA
RNA(病毒 )
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
.,
.,
.,
.,
.,
RDDP
引物,4种
dNTP
RDDP
RNase H 4种 dNTP
RDDP或 DDDP
病毒 RNA RNA-DNA
杂化分子
cDNA 前病毒
(双链 DNA)
酶催化反应示意图
反向转录酶存在于 所有致癌 RNA病
毒 中,其功能可能与病毒的恶性转化作用
有关 ;
但它也存在于 某些正常细胞 中，在细胞分化
与胚胎发生中可能起某些作用。
反转录病毒和反转录酶的发现,提出了一个
重要的医学问题 ──病毒致癌及癌基因
反转录的医学意义
反转录的医学意义
癌基因 (oncogene):能在体外引起细胞恶性
转化,在体内诱发肿瘤的基因,
细胞癌基因 (c-onc)或原癌基因 (pro-onc),存
在于生物正常细胞基因组中的癌基因, 正常
情况下 基因处于静止或低表达的状态, 当受
到致癌刺激 被活化并发生异常 时则可发生细
胞癌变,
病毒癌基因 (v-onc),存在于致瘤病毒中的
能使靶细胞发生恶性转化的基因,
用三个小写字母表示癌基因名称,如 myc,fos,ras,src等
抑癌基因, 是一类抑制细胞过度生长,增殖
从而遏制肿瘤形成的基因,如 Rb,P53,P16等
癌基因与抑癌基因之间一般处于动态平衡状态
是一种 反转录病毒,可引起获得性免疫缺陷
综合征 (AIDS,艾滋病 ),
反转录酶在 基因工程,分子病的 基因治疗 方面
也有重要作用,
人类免疫缺陷病毒 (HIV)
反转录的医学意义
O
N
H
N O
C H 3
R
P O
N
H
N O
C H 3
R
O
N
H
N O
C H 3
R
P
N
H
N O R
O
C H 3
UV
引起 DNA损伤的因素
紫外线 (常产生嘧啶二聚体 )
电离辐射 (断磷酸二酯键 )
物理因素
胸腺嘧啶二聚体的产生
第二节 DNA的损伤与修复
一,DNA的损伤
生物体受某些理化和生物等外源性
因素或机体内环境改变的影响，引起
DNA分子结构的任何异常改变称为 DNA
损伤 (DNA damage)
概念
化学因素,均能干扰复制与转录功能
▲烷化剂, (如氮芥类,CTX),使鸟嘌呤的
N7烷基化后脱落，成为无鸟嘌呤的位点
▲亚硝酸盐,使碱基脱氨
原 G-C配对最终变为 A-T配对，导致 错配
C→ U
A→ I
G→ X
C O
HN
C
CH
CH N
O
U
C O
N
C
CH
CH N
NH2
C A
N
NH2
N
N N
N
O
HN
N N
I
N
OH
N
N N
H
H2N
G
N
OH
N
N N
H
HO
X
化学因素,均能干扰复制与转录功能
▲烷化剂, (如氮芥类,CTX),使鸟嘌呤的
N7烷基化后脱落，成为无鸟嘌呤的位点
▲亚硝酸盐,使碱基脱氨
原 G-C配对最终变为 A-T配对，导致 错配
C→ U
A→ I
G→ X
▲丝裂霉素,与 DNA共价连接引起链交联
目前多指 病毒
糖苷键自行断裂；自发脱氨基作用,
C?U,A?I。
生物因素
生理因素 机率极低
突变 (mutation), 有机体基因组可遗传的
改变，即 DNA序列的改变,
根据引发的 原因,可将突变分为,
诱发突变 和 自发突变 。
缺失
根据 DNA分子的改变，突变可分为 4类,
点突变
颠换,异型碱基间变异,
转换,同型碱基间变异,
缺失或插入的碱基数不是 3的整
倍数时，则引起 移码突变 插入
倒位 (或易位 )
基因突变可能出现的后果
? 生物体致死
? 生物体某些功能丧失
? 仅改变基因型，表现型不受影响
? 改变生物物种，出现新的生物特征
? DNA复制过程所发生的突变 (碱基配对
错误 )，由核内 DNA聚合酶 Ⅰ 以其 校读功能
予以纠正,
? 若碱基错配 频频发生 或 损伤范围大,则
需采用 以下修复方式 进行修复,
二,DNA损伤的修复
TT 光复活酶 （ 可见光 ） T + T
DNA修复方式
1,光修复,
2.切除修复,由 3种 酶 共同参与完成。
特异性核酸内切酶
DNA pol I
DNA连接酶
5'
5' 3'
3'
5'
5' 3'
3'
5'
5' 3'
3'
5'
5' 3'
3'
5'
3'
3'
5'
5'
3'
3'
5'
5'
3'
3'
5'
5'
3'
3'
5'
5'
3'
3'
5'
5'
3'
3'
5'
5'
3'
3'
5'
复制 重组 DDDP I
DNA
连接酶
重组修复过程
3.重组修复,亦称 复制后修复
4,SOS修复, DNA分子受到较大范围的损
伤，细胞对危急状态所作出的反应。
机制
引起 DNA较长期的、广泛的突变。
SOS调节网诱导产生的 DNA聚合酶 特异性
低，识别碱基能力差,使修复部位仍存在较
多错配的碱基，但细胞能继续生存。
后果
第二节 RNA的生物合成
? DNA→RNA 转录
? RNA→RNA RNA复制
两种方式
存在于绝大多数生物体
存在于某些病毒体内
一、转 录
（一）概念
在 DNA指导的 RNA聚合酶 催化下，以
DNA的模板链为 模板, 4种 NTP为 原料,按
碱基配对规律 (T-A,A-U,G-C)合成一条 与模
板链互补的 RNA链的过程 。
⒈ RNA聚合酶 常称为转录酶 (transcriptase) 其全称为, DNA依赖的 RNA聚合酶
(DNA-dependent RNA polymerase,DDRP)
▲ E.Coli的 DDRP 由 5 个亚基组成
（二）参与转录的酶和有关因子
+ζ因子 α2ββ'(核心酶 ) ζα2ββ'(全酶 )
表 13-6 大肠杆菌 RNA聚合酶亚基组成及其功能
────────────────────────
类型 亚基 /酶分子 主 要 功 能
────────────────────────
α 2 决定哪些基因被转录
β 1 参与转录的全过程
β' 1 与模板 DNA结合 被 利福平
ζ 1 识别转录起始点 被 利福霉素
────────────────────────
真核生物 DDRP的种类与功能
种类 存在部位 转录产物 对鹅膏蕈碱
的敏感性
RNA聚合酶 Ⅰ 核仁 45S rRNA 不 敏感
RNA聚合酶 Ⅱ 核质 hnRNA和 snRNA 极 敏感
RNA聚合酶 Ⅲ 核质 tRNA和 5S-rRNA 中度 敏感
DDRP无 3’ →5 ’ 外切酶活性,有什么结果?
RNA聚合酶的主要功能
? 能 识别并结合 于 DNA模板的 启动子 部位
（真核生物还需要转录因子的帮助）
? 解开转录起始点下游一小段 (约 17bp)
DNA双螺旋，产生单链模板 ;
? 不需引物,催化形成第一个 3',5'-磷酸二酯
键，沿 5'→3 '方向延伸 RNA链
? 能 识别 DNA模板上的转录 终止信号 (依赖
于 ζ因子 )
? 在基因表达中，参与转录水平的调控
⒉ ρ因子 (Rho factor)
功能
(1)能帮助 DDRP识别终止信号并停止转录
(2)具有 ATP酶和解链酶活性，使 RNA-DNA
杂化分子解链，从而释放转录产物 RNA分子
3,转录的 DNA模板
? 细胞内 DNA不是其全长都可作为转录
模板
? DNA双链中，可作为模板转录成 RNA
的一条链，称为模板链 (或反意义链 )
? 同一 DNA双链中与模板链相对 (互补 )的
一条链称为编码链 (或有意义链 )，可见
转录是不对称的
? 模板链 =反意义链 =负链
? 编码链 =有意义链 =正链
为何称模板链为反意义链,编码链为有意义链？
可从下图理解,
５ ' … GCA GTA CAT GTC … 3 ' 编码链
3 ' … CGT CAT GTA CAG … ５ ' 模板链 DNA
转录
５ ' … GCA GUA CAU GUC … 3 ' mRNA
翻译
N … 丙 － 缬 － 组 － 缬 … C 肽
比较编码链和 RNA 链的碱基序列可见，除了以
Ｕ代Ｔ外，其余均一致。基因组序列均以编码链 (
正链 )表示,
不对称转录的两方面含义,
5 ' 3 '
3 ' 5 '
模板链（含结构基因）
编码链
? DNA 分子上的一条链可转录，另一条
不转录
? 模板链并非永远在同一单链上
1,启动子（ promoter）
RNA 聚合酶与模板 DNA结合的特定部位，是基
因转录的开始部位。
一般可
分为
两类
DDRP 能直接识别的启动子
需蛋白质辅助因子的帮助,DDRP 才
能识别的启动子
（四）启动子及终止信号
确保转录精确而有效地起始的 DNA 序列
原核生物启动子的 3个功能部位
? 转录起始点,常标以 +1,第 1个核苷酸
为嘌呤核苷酸 (A或 G),上游或下游,
+或 -表示
? 结合部位,长度为 7bp,位于 -10bp处,
有一 共有序列 (-TATAAT-,Pribnow
盒 )
? RNA聚合酶的识别部位,由约 6bp,
位于 -35bp,也有 共有序列 (-
TTGACA-)
编码链 5 ' 3 '
启动子
5 ' MeGPPP
RNA产物
原核生物启动子
转录起始部位
+1
基因转录区
-10区
TATAAT
Pribnow 盒
结合部位
TGTTGACA
-35区
识别部位
DNA
模板链 3 ' 5 '
编码链 5 ' 3 '
DNA
模板链 3 ' 5 '
CCAAT
CAAT盒
-70
真核生物启动子
RNA产物
转录起始部位
+1
基因
转录区
TATA
TATA盒
-25
Hogness盒
结合部位
GAGCCACCC
GC盒
(少数 )
2,终止信号 (终止子 )
DNA分子中决定 RNA聚合酶终止转录
的特定碱基序列。
原核生物终止信号碱基组成特点
有反向重复序列 决定转录产物的回折形成茎 -环 (或称发夹 )结构
AT富集区 GC富集区
反向重复序列
AT富集区 GC富集区
一般认为由终止子
引导的转录终止是
不依赖 ρ因子的
(五 ) 转录过程
?起始
?延长
?终止
(以大肠杆菌的转录为例）
1,转录起始
形成 转录空泡 （ DNA解链长约 20bp)
DDRP(ζ亚基 )辨认并结合于启动子部位
由 DDRP催化,头 2 个 NTP直接在起始点形成
第一个 磷酸二酯键 (不需引物，由模板指导 ),形
成 转录起始复合物
ζ亚基脱落（参与下一轮转录）
由核心酶 (α2ββ')催化链的延伸
第
一
个
总
是GT
P
全酶 ( ζα2ββ' )-DNA模板 (启动子 )-pppGpN'-OH
3 ' 5 ' DNA
5 ' 3 ' DNA
起始点 RNA聚合酶
pppG
pppN'
pppN''
5'pppGpN'
转录起始时 pppGpN-OH的生成
CN 3 ' 5 ' 模板链
` CN 3 ' 5 ' 模板链
进一步延长
起始
2,链的延长
? 转录起始时形成的“转录泡”仍保留
? RNA链的延长由核心酶催化
? 核心酶 沿模板链 3'→5 '方向移动,RNA
链 按碱基配对规律 沿 5'→3 '方向延伸
? 新生链与模板链形成杂化双链 (该杂化
分子结构不稳定,RNA链游离后，
DNA双链重新形成 )
? 随“转录泡”和 DDRP不断移动 (单链
模板不断暴露 )，转录连续不断地进行
要
点
? 不依赖于 ?因子的终止
见前述 ? 因子的
功能及右图
依赖 ?因子的
终止作用机理
l 作用机理,终止信号区特殊碱基
序列决定 RNA形成发夹形二级结构,
这是阻止转录继续向下游推进的关键；
l RNA-DNA杂化双链不稳定因素,
? DNA复性,RNA自身形成双链；
? RNA3'端，连续多个不稳定的 rU,
dA 碱基配对，使转录复合体解体 。
不依赖 ?因子的终止
转录过程
RNA 蛋白质
蛋白质 RNA
DNA 复制
复制
反转录
转录
翻译
翻译
遗传信息传递的 中心法则
蛋白质的生物合成
一 蛋白质生物合成体系
?
一,mRNA（ messenger RNA）
—— 蛋白质生物合成的 直接模板
DNA
mRNA
蛋白质
一,mRNA
* mRNA分子中 每三个相临碱基 组成一个
密码子,代表一种 氨基酸,或 起始 信号,
或 终止 信号。
* mRNA上的四种 碱基 可组成 64(43)个密码子,
其中 61个代表不同的氨基酸，其余三个
代表终止信号。
通
用
遗
传
密
码
子
l 遗传密码的 5个特点,
,1,通用性,
从简单生物到人类使用同一套密码子。
,2,方向性,
mRNA中密码子的阅读方向是 5′→3′ 。
由此可推测所有生物来源于一个共同的祖先。
,3,简并性,
除 Met,Trp外，其余氨基酸由 2个以上
密码子编码。 同义密码子
（ 但每一个密码子仅对应一个氨基酸）
生物学意义, 保证属的稳定性 。
,4,连续性,
密码子的排列是连续的，不间隔，也不
重叠。
5′…,UCACGACAUAUG….3′
5′…,UCAGCGACAUAUG….3′
丝 精 组 蛋
丝 丙 苏 酪
5′…,UCAGACAUAUG….3′
丝 天 异亮
* 移码突变 是最严重的突变！
插入
缺失
,5,起始 密码子与 终止 密码子,
起始 密码子, AUG,GUG,UUC。
终止 密码子, UAA,UGA, UAG。
单顺反子,真核 生物 中，一条 mRNA链只
能为 一 种蛋白质编码 。
多顺反子,原核 生物 中，一条 mRNA链往
往为功能相关的 几 种蛋白质编码 。
氨基酸臂
反密码子环
二,tRNA（ transfer RNA）
— 蛋白质生物合成的
, 高级搬运工,
l tRNA的功能,
· 活化 氨基酸，跨越能障，使肽键的
形成变得容易。
? 特定 的 tRNA搬运 特定 的氨基酸,
保证了 遗传信息传递 的 准确性 。
? 将 密码子 信息 转换 为对应 氨基酸 的符号
—— 接合体，接合器，适配器 (adaptor)等。
即 tRNA能与专一的氨基酸结合并识别
mRNA分子上的密码子,
l tRNA搬运功能的 忠实性 是通过以下
两条途径实现的,
· tRNA的 反密码子 识别 mRNA的 密码子 。
? 不同的 tRNA有不同的碱基组成，并由
不同的 氨基酰 tRNA合成酶 识别。
既能识别 特异 的 tRNA,
又能识别 特异 的 氨基酸 。
l tRNA上的 反密码子 识别 mRNA上的
密码子 遵循 不稳定 或 摆动 （ wobbling）
配对 原则。
* 一种 tRNA仅转运一种 氨基酸,
而一种 氨基酸 可由几种 tRNA转运。
ACG 5′ 3′
5′
3′
UGU
mRNA
tRNA反密码环
反密码子的
第一碱基
密码子的
第三碱基
U A或 G
I U,C或 A
G C或 U
* 在 大肠杆菌 中,与 Met特异结合的 tRNA有两种,
tRNAfMet 和 tRNAMet
CH3
S
CH2
CH2
CH H2N COO tRNAfMet
转甲酰基酶
N10-CHO-FH4
CH3
S
CH2
CH2
CH H-C-HN COO tRNAfMet
O
+ Met-tRNAMet上的 Met则 不被甲酰化 ！
tRNAiMet,真核 细胞中起始 tRNA,不被甲酰化
三、核糖体（ ribosome）
—— 蛋白质生物合成的 场所
l 组成、结构与功能特点,
,1,结构复杂而精密
由 3种的 rRNA（ 占 60%左右）
及数十种 蛋白质 组成。
,2,rRNA起着 主导 的作用,蛋白质
协助维持 rRNA的功能区域。
,3,转肽酶是 RNA而不是蛋白质。
Et Ep
P A
mRNA
mRNA
结合位点
细胞
内膜
系统
三,核糖体 — 蛋白质生物合成的 场所
T
A,受位,氨基酰位；
P,给位,肽位； Et,tRNA出口 Ep:多肽链出口 ;
T,转肽酶。
四,参与蛋白质生物合成的 其他组分
3 1,氨基酰 tRNA合成酶
3 2,GTP,ATP
3 3,起始因子（ IF）
3 4,延长因子（ EF）
3 5,释放因子（ RF）
……
或称为终止因子（ TF）
第二节 蛋白质生物合成过程
一,氨基酸 的 活化 与 转运
二,多肽链 的形成 — 核糖体循环
三,翻译后加工
一,氨基酸的 活化 与 转运
氨基酰 tRNA
合成酶
ATP PPi
H2N-CH-C-OH
R O
H2N-CH-C-AMP-E
R O
H2N-CH-C~O-ACC-tRNA
R O
氨基酰 tRNA合成酶
高度特异性
氨基酰 tRNA
合成酶
tRNA
氨基酸
tRNA
消耗 2个高
能磷酸键
二,核糖体循环 （ ribosome cycle）
活化氨基酸在核糖体上缩合形成多肽链的过程
1,起始
2,肽链 延长
3,终止
(一 ) 起始阶段 起始氨基酰 -tRNA 与 mRNA
结合到核糖体上,形成起始复合物的过程
原料, fMet-tRNA,IF(1,2,3),GTP,Mg2+
1,小亚基 识别并结合 mRNA
30S
50S
50S +
mRNA 解聚
30S
* 小亚基 识别并结合 mRNA起始密码子上游 10nt富含
嘌呤碱基的 SD序列, IF3加固这一作用。
IF-1 IF-3
小亚基的 16S rRNA
3′端的 UCCU序列
2,fMet-tRNAfMet与 小 亚基结合
fMet
IF-2,
3,大小亚基 聚合
50S 起始复合物
GTP AUG AUG
fMet
AUG
fMet
AUG
fMet
IF-2
* 真核生物 与 原核生物 核糖体循环的
起始过程 的不同点,
,1,起始 Met-tRNAMet不需甲酰化；
,2,起始因子 不少于 10种；
,3,小亚基 先与 Met-tRNAMet结合，再与
mRNA结合；
,4,ATP供能。
（二） 肽链延长阶段,
原料,各种 氨基酰 -tRNA,EF（ Tu,Ts,G）,
GTP,Mg2+,K+。
1,进位
Tu-GDP
GDP
Ts
Tu-Ts
Tu-GTP
GTP
Pi
Tu-GTP
特异的氨基酰 -tRNA进入 A位
p A
AUG
AUG
Tu-GTP
2,转肽
Mg2+,K+
转肽酶
CH2CH2-CH
O
C = O
CH-R
NH2
O=
O
C
H2N
CH3
S
AUG
UAC
给 受
O
C O =
R-CH
NH
OH
C O=
H3CSCH2CH2-CH
NH2
AUG
UAC
给 受
3,移位
OH
EFG,GTP
AUG
A
2 1
5′→3′
OH 2 1
AUG 5′ 3′
AUG
2 1
3
AUG
3
1 2
AUG
2 1 3
进位
转肽
移位
转肽 N→C 延长
通过进位 -转肽 -移位不断重复,
肽链自 N→C 端不断延长
OH
EFG,GTP
OH
A
每生成 1个肽键,要消耗 2分子 GTP(进位 和 移
位 ),而氨基酸活化需消耗 2个 高能磷酸键，每增加
1个氨基酸残基实际消耗 4个 高能磷酸键
* 真核生物 与 原核生物 核糖体循环的
肽链延长阶段 的不同点,
,1,进位时 延长因子 是 EF-1,
可分为 ?,?和 ?三类；
,2,移位时 延长因子 为 EF-2,
其活性可被 白喉毒素 抑制
三、终止阶段
RF-3,促使 RF-1 或 RF-2从 核糖体 上结合
* 真核生物 仅有一个 释放因子, eRF,
可识别三种密码子,并需 GTP参与。
RF-1,UAA,UAG
RF-2,UAA,UGA
当 mRNA的任一终止信号进入 A位时，
没有任何 tRNA能与之识别，只有释放因子
(RF)识别这种信号,进入终止阶段,
1,终止密码子的辨认
RF-1
或 RF-2
UAA
O
C O =
R-CH
A
O
C O =
R-CH
UAA
RF
H-OH
转肽酶
2,肽链的水解和脱落
OH
RF
C O =
R-CH
O
RF
R-CH
C-OH O =
3,tRNA,RF,mRNA的释放，核糖体
大小亚基的解聚
OH
RF-3,IF-3
EF-G RF OH
RF
核糖体循环,
fMet
AUG
1,起始 2,肽链延长
3,终止
三,多核糖体
5′ 3′
意义,提高翻译效率 。
同时结合到同一条 mRNA上多个成串的
核糖体
四,翻译后加工
（一） 切割
（二） 修饰
（三） 新生肽链 的 折叠
1,去除 N末端 蛋氨酸残基
2,信号肽 及 其他肽段 的切除
1,二硫键 的形成
2,辅助因子 的连接和 亚基 聚合
3,多肽链中 个别氨基酸 的修饰
四,翻译后加工
（一） 切割
原核生物
1,去除 N末端 蛋氨酸残基
脱甲
酰基酶 Met- fMet- 氨基肽酶
真核细胞
2,信号肽 及 部分肽段 的切除
l 分泌性蛋白 前体 的两个特点,
o 1,N端含有 信号肽 （ signal peptide）
信号肽 富含 疏 水氨基酸,其作用是
使新合成的多肽链 易于穿过膜系统，
随后被 信号肽酶 切除。
o 2,往往还含有一段 与活性无关 的其
他肽段，必须将其切除才能形成 有
活性的蛋白质 。
胰岛素的前体 胰岛素
切去
C肽段
C肽段 A肽段 B肽段
l 分泌性蛋白 穿过膜系统的 两种机制
o 1,分泌性蛋白
在 信号肽 的
介导下 直接
穿透膜系统
小亚基
大亚基
信号肽
内质网膜内侧
（二）修饰
,1,二硫键 的形成
Cys
SH
Cys
SH
Cys
S
Cys
S -2H
二硫键
异构酶等
,2,辅助因子 的连接和 亚基 聚合
o 蛋白质与糖、脂类、核酸、血红素等
辅助因子结合形成 糖蛋白, 脂蛋白,
核蛋白, 血红蛋白 等 结合蛋白质 。
o 具有 四级结构 的蛋白质需进行 亚基 之间
的聚合。如血红蛋白 4个亚基的聚合。
,3,多肽链中 个别氨基酸 的修饰
o 磷酸化,丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸
o 羟基化,脯氨酸，赖氨酸
o 酰基化,组氨酸
o 甲基化,色氨酸
o 核糖基化,精氨酸
意义,或者是蛋白
质所固有的，或者
在调节蛋白质功能
时起重要作用。
（三） 新生肽链 的 折叠 （ folding）
* 蛋白质的生物活性 不仅依赖于他们的氨基酸
顺序,而且依赖于他们的空间结构 。
* 新生肽链 必需经过一系列严格而复杂的 折叠
过程，才能形成具有正确空间结构的有活性
的 蛋白质 。
* 多肽链的氨基酸顺序如何决定蛋白质的空间
结构 —— 第二遗传密码？
—— 中心法则 研究中有待解决的重大问题
补充内容
* 新生肽链的折叠 需要 分子伴侣
和 折叠酶类 的参与
` 分子伴侣（ molecular chaperone）,
帮助 新生肽链 进行 非共价折叠 的一类
蛋白质。如：热休克蛋白，前导肽等
` 折叠酶（ foldase） 类,
目前只有两个,1,二硫键异构酶 (PDI),
2,脯氨酰异构酶 (PPI)。
催化与 折叠 直接有关的化学反应的酶。
分子伴侣 帮助 新生肽链 正确折叠
分子伴侣
新生肽链
正确
折叠
的蛋
白质
错误 折叠的
蛋白质
基因工程基本原理
一、基因工程的定义及主要内容
二、重组 DNA分子引入宿主细胞和筛选鉴定
三、克隆基因的表达
四、基因工程的成就和展望
一、基因工程定义及主要内容
? 基因工程也称基因重组技术、基因克隆
或分子克隆
? 是指利用 DNA重组技术生产或改造生物产
品、创建或改良动植物品种以及开发特
殊用途的微生物等
? 是生物工程的重要内容之一
? 主要步骤,
1、构建 DNA重组分子
2、重组 DNA分子引入宿主细胞和筛选鉴定
3、基因的表达
一、基因工程定义及主要内容
返回
返回
基
因
工
程
基
本
程
序
真核染色体 DNA
克隆载体
（质粒）
限制酶切割
限制酶切割并
分离所需片断
重组载体
细菌宿主细
胞的转化
细胞分离
培养增值
构建 DNA重组分子
? 工具酶
? 目的基因的制备
? 克隆载体
? DNA分子的体外重组
返回
工具酶
? 限制性内切酶是基因工程中最主要的工
具酶
? DNA连接酶（ DNA ligase）,DNA聚合酶
Ⅰ （ DNA polymeraseⅠ ）,末端转移酶
（ terminal transferase）,逆转录酶
（ reverse transcriptase）,核酸酶 S1
（ nuclease S1） 和核酸外切酶 Ⅶ
（ exonucleaseⅦ ）
返回
限制性核酸内切酶 ? 能识别 DNA特定核苷酸序列的核酸内切酶
? 分布：主要在微生物中 。
? 特点：特异性, 即识别特定核苷酸序列,
切割特定切点 。
? 结果：产生黏性未端 （ 碱基互补配对 ） 。
? 举例：大肠杆菌的一种限制酶能识别 GAATTC
序列, 并在 G和 A之间切开 。
限制性核酸内切酶
? 由 Smith在 1970年从流感噬血菌中发现
? 细菌体内有特异的限制修饰系统，这种修饰
系统是通过特殊的修饰酶在细菌本身 DNA的特
异识别序列处进行甲基化修饰，从而与外源
DNA相区别。这样，限制性核酸内切酶就能去
切割破坏外源 DNA,而对本身无影响。
? 目前已从原核生物中分离出 400～ 500多种限
制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶
? 限制性内切酶可识别 4或 6个特异核苷酸序列
? 粘性末端：指限制性内切酶的切割部位不在识
别序列的中心轴，在断段产生一个短的单股突
伸出来的不齐末端。
? 钝性末端：指限制性内切酶的切割部位在识别
序列的中心轴处，即产生平齐末端。
返回
几种限制性内切酶的作用位点
返回
几种限制性内切酶的作用位点
返回
目的基因的制备
? 目的基因就是所需要克隆的外源基因
? 制备方法,
1,人工合成法
2,逆转录法
3,用限制性内切酶直接从染色体 DNA中分
离
4,用 PCR法扩增目的基因片段
返回
目的基因的制备：人工合成法
? 较小分子基因可用人工化学合成的方法
获得
? DNA化学人工合成的方法已经自动化
? 人工合成目的基因的先决条件是基因的
核苷酸序列是已知的
? 缺点是,1、不能合成太大的基因； 2、
合成基因时遗传密码的兼并现象会为选
择密码带来很大困难； 3、费用较高
返回
目的基因的制备：逆转录法
? 若所需基因较大，人工合成有困难，从组织中
分离提取也不容易，则可利用逆转录法合成。
? 该法是：以编码某特异多肽的 mRNA为模板，在
逆转录酶的作用下反转录成该多肽 mRNA的互补
DNA（ cDNA）； 再以 cDNA为模板，在逆转录酶
或 DNA聚合酶 I（ 或其 KIenow片段）作用下，最
终合成编码该多肽的双链 DNA（ dsDNA）。
? 可用于真核生物目的基因的获得
返回
目的基因的制备：逆转录法
返回
返回
目的基因的制备,逆转录法
? 用逆转录法合成 cDNA的主要问题是,
1,mRNA必需提得很纯
2、逆转录中常产生各种不完全的逆转录产
物,
3、以单链 cDNA为模板往往难以合成与单链
cDNA一样长的 ds－ cDNA,这与实验技术
有关。
返回
用限制酶切法直接从染色体 DNA中分离
? 此方法主要适用于制备原核基因
? 对于物理图谱已清楚的原核基因，可用限制酶
把目的基因切出来
? 鸟枪法是指把目的基因从已用限制酶降解的染
色体片段群中分离纯化出的方法，即把包括目
的基因在内的全部 DNA片段插入到载体 DNA（ 如
pBR322） 中，转化大肠杆菌，做成基因文库。
再用目的基因的转录产物作探针，通过分子杂
交，选择出含有所需基因的 DNA片段。
用限制酶切法直接从染色体 DNA中分离
? 此方法的优点是获得的目的基因的组织
结构与天然基因一样，也具有间隔顺序。
? 此方法的缺点是：由于含有插入顺序，
原始转录本不能被原核细胞识别，并将
插入顺序切除，以形成成熟转录本，因
此也得不到目的基因的产物多肽或蛋白
质。
返回
用 PCR方法 扩增目的基因片段
? PCR是聚合酶链反应的缩写
? 是一种在体外模拟天然 DNA复制过程的核酸扩
增技术
? 在有少量 DNA模板、引物、四种 dNTP,TaqDNA
聚合酶、合适的缓冲系统下，通过仪器控制
DNA变性、退火及延伸的温度与时间，来合成
新的 DNA链，新合成的 DNA链又可作为下一轮循
环的模板。理论上经 n次循环后,DNA链可达 2n
返回
用 PCR方法扩增目的基因片段
返回
克隆载体
? 目的基因若无合适的载体协助，就很难进入受
体细胞；
? 为了保证目的基因能够繁殖，必需将它与载体
连接
? 理想的载体
1、较小的、能进行复制的分子，具有高拷贝数
2、具有较少的限制酶的切点，最好是单一切割
点，以便所要克隆的 DNA片段能被插入载体
克隆载体
? 3、外源 DNA片段插入载体后，不得使载体的
复制功能丧失
? 4、具有某种明显的标志，例如抗药性标记，
以便利用这些标志筛选阳性克隆
? 5、携带外源 DNA的幅度较宽
? 6、生物防护是安全的
克隆载体
克隆载体
? 常用的克隆载体有：质粒、噬菌体及病毒
? 质粒是某些细菌中独立于染色体外的共价闭合
环状双链 DNA。 质粒具有复制能力，它的存在
与否一般对细菌的生存没有决定性影响。
? λ 噬菌体是一种能感染大肠杆菌的病毒，其
DNA中的 1/3对噬菌体的生长并非绝对需要，因
此可被外源性 DNA所替代，同时它可在体外包
装成病毒颗粒，高效感染大肠杆菌。克隆容量
小于 23kb
克隆载体
? 粘性质粒（ Cosmid）,是人工构建的、
兼具质粒与噬菌体双重特性的大容量载
体。克隆容量可达 45kb。
? 酵母人工染色体,20世纪 80年代发展起
来的大片段外源基因克隆体系，其克隆
容量可达 200~1000kb。
返回
DNA分子的 体外重组
? 所谓重组 DNA分子就是把外源 DNA分子
（目的基因）插入到载体中，使两种 DNA
分子连接起来
? 体外 DNA分子重组有两种方法,
1,粘性末端连接法
2,平头末端连接法
返回
粘性末端连接法
? 用同一种或两种限制酶去消化载体和外源 DNA
分子，可产生相同的粘性末端，这些粘性末端
能退火互补，进一步用 DNA连接酶将断端封口，
即可获得重组 DNA分子。
? 用同一种限制酶处理外源 DNA和载体，重组时
可导致外源 DNA特别是质粒的自我环化
? 用碱性磷酸脂酶（不处理外源 DNA分子）处理
粘性末端的 5‘ 磷酸基，能促使载体与外源 DNA
分子连接。重组体每条链仍残留的一个缺口，
待进入宿主细胞内可被修复
返回
磷
酸
脂
酶
能
防
止
载
体
的
自
我
环
化
返回
用
两
种
限
制
酶
处
理
载
体
也
可
防
止
环
化
钝性末端连接法
? 用前述的化学合成法、逆转录法获得的 DNA或
cDNA片断，以及某些限制酶切生成的 DNA片断，
均为钝性末端，可用 T4DNA连接酶连接，也可
将其改造成粘性末端再行连接,
1、加接头：这种人工接头含某种限制酶的单切
点，用限制酶消化该接头可产生粘性末端。
2、加尾巴：应用末端转移酶在载体与外源 DNA分
子上加上互补的同聚核苷酸，经过退火可使两
者形成重组体 返回
钝性末端连接法
返回
末端转移酶处理
退火
二、重组 DNA引入宿主细胞和筛选鉴定
? 重组 DNA引入宿主细胞
1、转染：将噬菌体 DNA引入宿主细胞的过程
2、转化：将质粒或染色体 DNA引入宿主细胞的过
程
? 重组体克隆的筛选与鉴定
1,插入灭活法
2、噬菌斑形成筛选法
3、核酸杂交法
返回
插入灭活法
? 目前使用的质粒载体都有抗药标记。被
转化的细菌在含有这种（些）抗生素的
培养基中能够生长，而未被转化的细菌
则不能生长或被杀死。然而，当限制酶
作用于载体 DNA的某一抗药基因上并在此
插入外源 DNA时，载体上原有的抗药基因
即被破坏。由此重组体转化的宿主细胞，
则对这个抗生素敏感，这样便可筛选出
转化菌株。
返回
返回
插
入
灭
活
法
限制酶切
转化
含四环素
T A＋ T
三、克隆基因的表达
? 外源基因在大肠杆菌体系中的表
达
? 外源基因在真核细胞体系中的表
达
返回
四、基因工程的成就与展望
? 在农业上的成就与意义
? 在工业方面的成就与意义
? 在制药工业中的成就与意义
? 癌症的研究与治疗
? 遗传病的预防与治疗
插入灭活法
? 目前使用的质粒载体都有抗药标记。被
转化的细菌在含有这种（些）抗生素的
培养基中能够生长，而未被转化的细菌
则不能生长或被杀死。然而，当限制酶
作用于载体 DNA的某一抗药基因上并在此
插入外源 DNA时，载体上原有的抗药基因
即被破坏。由此重组体转化的宿主细胞，
则对这个抗生素敏感，这样便可筛选出
转化菌株。
返回
反映了从 DNA?RNA?蛋白质的遗传信息
主流，揭示了生物体内遗传信息的贮存、传递
和表达的规律 。
转录
RNA
翻译
蛋白质 DNA
RNA
（ 病毒）
复制
复制
翻译 蛋白质
（病毒）
反转录
第一节 DNA的生物合成
? DNA→DNA
DNA复制
? RNA→DNA
反转录
两种方式
一,DNA的半保留复制
2.半保留复制的实验证据,
1.定义,
1958年 Meselson和 Stahl用同位素 15N标记 大
肠杆菌 DNA,首先证明了 DNA的半保留复制。
以 亲代 DNA双链 为模板以 碱基互补 方式合成子
代 DNA,这样新形成的子代 DNA中，一条链来自亲
代 DNA,而另一条链则是新合成的，这种复制方
式叫 半保留复制 。
DNA半保留复制
DNA的复制的方式 ------
1958,Messelson and Stahl
实验证实
细菌的 DNA双链
(蓝 线的代表含 15N)
含 15N-DNA的细菌
培养于普
通培养液
第一代 重 DNA
普通 DNA
普通 DNA
DNA半保留复制的证据
可排除全保留式
Why?
混合式
重 DNA
普通 DNA
重 DNA
第二代
半保留式
第一代
故可排除混合式复制方式
培养第一代
结果
重 DNA
普通 DNA 母链
全保留式 半保留式 混合式
重 DNA
普通 DNA
排除全保留式
细菌的 DNA双链
(蓝 线的代表含 15N)
(红 线的代表含 14N)
含 15N-DNA的细菌
培养于普
通培养液
继续培养于
普通培养液
第二代 重 DNA
第一代 重 DNA
普通 DNA
普通 DNA
DNA半保留复制的证据
排除混合式
Why?
DNA的半保留复制的生物学意义,
? DNA在代谢上的稳定性并非指 DNA
是一种惰性物质。
? DNA的半保留复制表明 DNA在代谢上
的 稳定性,是 保证亲代的遗传信息稳
定地传递给后代必要措施。
? 必须具备的基本条件
? 模板,母链 DNA
? 原料, dNTP(包括 dATP,dGTP,dCTP
,dTTP)
? 酶和蛋白质因子,
? 引物,一小段 RNA
? 能量 （ ATP） 及某些 无机离子
参与 DNA复制的酶类与蛋白质因子
及其主要作用
1,拓扑异构酶 （ topoisomerase,Topo）
无 ATP时,作用相当于 TopoⅠ,但切割的
是 双链 DNA某一部位 (断双链 )。
有 ATP时,使带断口、松弛状的 DNA分
子旋紧转变成负超螺旋结构，再连接断端。
不需耗能 (ATP),切割 (断 )
双链 DNA中的 一链,松解螺旋,封闭切口。
又称 切割封口酶 。
TopoⅠ 的作用
TopoⅡ (又称旋转酶 )的作用
2,解链酶 (又称 解螺旋酶或螺旋酶,helicase)
解链酶
作用,断裂互补碱基间的氢键,使 DNA双链分离形
成 ? 复制叉 ? 。
A B C
拓扑异 构酶 II+ATP
拓扑异 构酶 I
DNA的松弛状态与超螺旋
3,单链 DNA结合蛋白 (DNA结合蛋白 )
(single stranded DNA-binding protein,SSB)
作用, 防止重新形成双 链和防止单链模板
被核酸酶水解,维持 DNA单链状态和完整性
4.引物酶 (Primase)
5′ 3′
5′
5′ 5′ 3′
RNA的合成：需引物酶，它是一种特殊
的 RNA聚合酶。
DNA不能从无 → 有合成，需在一小段
RNA基础上合成 DNA
5,DNA聚合酶 （ DNA polymerase,DNA pol）
即依赖于 DNA的 DNA聚合酶（ DDDP）
? 原核生物 （ E.coli） 迄今已知只有 3种：
DNA polⅠ, DNA polⅡ, DNA polⅢ 。
? 真核生物 亦发现有多种 DDDP：
DDDP?,?,?,?,? 。
? 其性质与功能 见表 13-1和表 13-2
?原料,四种脱氧核苷三磷酸
（ dATP,dGTP dCTP dTTP)
?需要模板,以 DNA为模板链，合成子代 DNA,模板可
以是双链，也可以是单链 DNA。 合成产物与模板互补。
? 需要引物,一小段 RNA(或 DNA） 为引物，在大肠杆
菌中,DNA的合成需要一段 RNA链作为引物，引物含
3’ -OH,
?合成方向,5 ? ? 3 ?
(一 ) DNA聚合酶,1956年 Kornberg等在大肠杆菌中
首先发现 DNA聚合酶，其后发现该酶在许多生物中广
泛存在。 该酶的催化性质如下,
表 13-1 大肠杆菌中 DNA聚合酶某些性质
────────────────────────
DNA聚合酶
性 质 ----------------------------------------------------
Ⅰ Ⅱ Ⅲ
────────────────────────
酶分子 /细胞 400 40 20
酶分子量 (kd) 109 90 140
5' →3 '聚合功能 有 有 有
5 ' →3 '外切酶活性 有 有 无
3 ' →5 '外切酶活性 有 有 有
聚合核苷酸数 /分钟 /分子 (37℃ ) 1000 50 15000
主要功能 修复等 修复作用 复制
────────────────────────
表 13-2 真核细胞中 DNA聚合酶的性质
─────────────────────
DNA聚合酶
性质 -------------------------------------------------------
α β γ δ ε
─────────────────────
分布 细胞核 细胞核 线粒体 细胞核 细胞核
分子量 (kd) >250 36-38 160-300 170 256
3’ →5 ’外切酶活性 无 无 有 有 有
5’ →3 ’ 聚合作用 有 有 有 有 有
主要功能 复制 损伤修复 复制 复制 复制,损伤修复
(随从链 ) (领头链 )
─────────────────────
DDDP 5′?3′聚合作用示意图
3′ 模板链 5 ′
5′ 3′
DDDP 的 5′?3′外切及 3′?5′外切 作用示意图
3′?5′外切
5′? 3′外切
5′
3′
C
A
3′
6,DNA连接酶 (DNA Ligase)
作用,在有模板指导的条件下，催化 2个
DNA片段 (两片段间的距离为 1个 3',5' -
磷酸二酯键的键长 )的连接。
原理：在一个 DNA片段的 3' -OH末端和另一
个 DNA片段的 5'-P末端形成 3',5'-磷酸
二酯键，从而实现连接。
特点,原核细胞,需辅助因子 NAD+
真核细胞,不 需辅助因子 NAD+,但需耗
能 (ATP)
表 13-4 参与 DNA复制的酶及蛋白质
─────────────────────
酶或蛋白质 主要作用
─────────────────────
拓扑异构酶类 克服解链时打结及缠绕、松驰或引
进负超螺旋
解链酶类 解开 DNA双链
单链 DNA结合蛋白 维持已解开单链 DNA的稳定
引物酶 合成 RNA引物
DNA聚合酶 Ⅲ DNA复制
DNA聚合酶 Ⅰ 水解引物、填补空隙、修复作用
DNA连接酶 催化双链 DNA中单链缺口的连接
─────────────────────
（五）、参
与 DNA复制
的酶与蛋白
因子总览图
DNA的复制过程
? 复制的起始
? 链的延长
? 复制的终止
复制的起始
1.在拓扑异构酶、解链酶及单链 DNA
结合蛋白的共同作用下,DNA解旋、
解链,形成复制叉 。
2.依赖于单链模板，由引物酶催化按碱
基配对规律 合成 一小段 RNA引物
(原核细胞引物长 50-100个碱基，真
核约 10个碱基 )。
DNA的复制过程, （以大肠杆菌为例）
? 复制的终止,
? 复制的起始
1、起始复合物的形成：称为引发
2,RNA引物的合成
? 链的延伸,
复制起始阶段的特点
真核细胞, 具有多个
起始位点
原核细胞, 仅有一个复制起始位点，但往往是双向复制
链的延长
?引物合成后，由 DNA polⅢ （ 真核细胞
为 DNA聚合酶 ?或 ?)催化，在引物 3'-
OH末端逐一添加与模板链对应互补的
脱氧核苷磷酸,使新合成的链不断延长。
领头链,链的 延长方向 (5' ? 3')与 解链方向 (复制
叉移动方向 )相同,为 连续 合成。
随从链, 链的 延长方向 (5'?3')与 解链方向 (复制
叉移动方向 )相反,为 不连续 合成。
?分段合成的 DNA片段,最初被命名为 冈
崎片段
或领头链
III
三,DNA复制的半不连续性
前导链
滞后链
冈崎片段
前导链,以 3’ → 5’ 方向的
亲代链为模板连续合成的子代链。
滞后链,以 5’ → 3’方向
的亲代链为模板的子代链先逆
复制叉移动方向合成冈崎片段，
再连接成滞后链。
DNA链的延伸
在 DNA聚合酶 Ш 的催化下，
以四种 5’ -脱氧核苷三磷
酸为底物，在 RNA引物的 3’
端以磷酸二酯键连接上脱
氧核糖核苷酸并释放出焦
磷酸。 DNA链的延伸同时进
行前导链和滞后链的合成。
两条链方向相反。
? 前导链
? 滞后链
? 冈崎片段
? 半不连续复制
冈崎模型
复制的终止
1.水解引物及填补空隙
冈崎片段合成后，由 DNA polⅠ (真核细胞
可能是 DNA聚合酶 ?)水解去除 RNA引物,
并 填补 留下的 空隙 (5'? 3')聚合。
2.完整双链 DNA分子的形成
填补空隙后,DNA片段与片段之间还有一
个缺口 (一个 3',5'-磷酸二酯键的长度 ),由
DNA连接酶 催化连接成完整的链，从而产
生 完整的双链 DNA分子 。
DNA复制的精确性（高保真复制）
1、碱基的配对规律,摸板链与新生链之间的碱基配
对保证碱基配错几率约为 1/104～ 1/105。
2,DNA聚合酶的 3’ →5 ’ 外切酶活性的校对功能,使
碱基的错配几率又降低 100～ 1000倍。
3,DNA的损伤修复系统。
DNA复制必须具有 高度精确性,在大肠杆菌的细胞
DNA复制中其 错误率约为 1/109～ 1/1010,即每 109～
1010个核苷酸才出现一个错误，也就是大肠杆菌染色
体 DNA复制 1000～ 10000次才出现一个核苷酸的错误。
这么高的精确性的保证主要与下列因素有关,
二、反转录
(reverse transcription) 概念
以 RNA为模板,dNTP为原料，反转录酶
催化，按碱基配对规律合成 DNA的过程。
反转录酶,又称为 依赖 RNA的 DNA聚合酶
(RNA-dependent DNA polymerase,RDDP)
DNA 转录 RNA
RNA(病毒 )
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
.,
.,
.,
.,
.,
RDDP
引物,4种
dNTP
RDDP
RNase H 4种 dNTP
RDDP或 DDDP
病毒 RNA RNA-DNA
杂化分子
cDNA 前病毒
(双链 DNA)
酶催化反应示意图
反向转录酶存在于 所有致癌 RNA病
毒 中,其功能可能与病毒的恶性转化作用
有关 ;
但它也存在于 某些正常细胞 中，在细胞分化
与胚胎发生中可能起某些作用。
反转录病毒和反转录酶的发现,提出了一个
重要的医学问题 ──病毒致癌及癌基因
反转录的医学意义
反转录的医学意义
癌基因 (oncogene):能在体外引起细胞恶性
转化,在体内诱发肿瘤的基因,
细胞癌基因 (c-onc)或原癌基因 (pro-onc),存
在于生物正常细胞基因组中的癌基因, 正常
情况下 基因处于静止或低表达的状态, 当受
到致癌刺激 被活化并发生异常 时则可发生细
胞癌变,
病毒癌基因 (v-onc),存在于致瘤病毒中的
能使靶细胞发生恶性转化的基因,
用三个小写字母表示癌基因名称,如 myc,fos,ras,src等
抑癌基因, 是一类抑制细胞过度生长,增殖
从而遏制肿瘤形成的基因,如 Rb,P53,P16等
癌基因与抑癌基因之间一般处于动态平衡状态
是一种 反转录病毒,可引起获得性免疫缺陷
综合征 (AIDS,艾滋病 ),
反转录酶在 基因工程,分子病的 基因治疗 方面
也有重要作用,
人类免疫缺陷病毒 (HIV)
反转录的医学意义
O
N
H
N O
C H 3
R
P O
N
H
N O
C H 3
R
O
N
H
N O
C H 3
R
P
N
H
N O R
O
C H 3
UV
引起 DNA损伤的因素
紫外线 (常产生嘧啶二聚体 )
电离辐射 (断磷酸二酯键 )
物理因素
胸腺嘧啶二聚体的产生
第二节 DNA的损伤与修复
一,DNA的损伤
生物体受某些理化和生物等外源性
因素或机体内环境改变的影响，引起
DNA分子结构的任何异常改变称为 DNA
损伤 (DNA damage)
概念
化学因素,均能干扰复制与转录功能
▲烷化剂, (如氮芥类,CTX),使鸟嘌呤的
N7烷基化后脱落，成为无鸟嘌呤的位点
▲亚硝酸盐,使碱基脱氨
原 G-C配对最终变为 A-T配对，导致 错配
C→ U
A→ I
G→ X
C O
HN
C
CH
CH N
O
U
C O
N
C
CH
CH N
NH2
C A
N
NH2
N
N N
N
O
HN
N N
I
N
OH
N
N N
H
H2N
G
N
OH
N
N N
H
HO
X
化学因素,均能干扰复制与转录功能
▲烷化剂, (如氮芥类,CTX),使鸟嘌呤的
N7烷基化后脱落，成为无鸟嘌呤的位点
▲亚硝酸盐,使碱基脱氨
原 G-C配对最终变为 A-T配对，导致 错配
C→ U
A→ I
G→ X
▲丝裂霉素,与 DNA共价连接引起链交联
目前多指 病毒
糖苷键自行断裂；自发脱氨基作用,
C?U,A?I。
生物因素
生理因素 机率极低
突变 (mutation), 有机体基因组可遗传的
改变，即 DNA序列的改变,
根据引发的 原因,可将突变分为,
诱发突变 和 自发突变 。
缺失
根据 DNA分子的改变，突变可分为 4类,
点突变
颠换,异型碱基间变异,
转换,同型碱基间变异,
缺失或插入的碱基数不是 3的整
倍数时，则引起 移码突变 插入
倒位 (或易位 )
基因突变可能出现的后果
? 生物体致死
? 生物体某些功能丧失
? 仅改变基因型，表现型不受影响
? 改变生物物种，出现新的生物特征
? DNA复制过程所发生的突变 (碱基配对
错误 )，由核内 DNA聚合酶 Ⅰ 以其 校读功能
予以纠正,
? 若碱基错配 频频发生 或 损伤范围大,则
需采用 以下修复方式 进行修复,
二,DNA损伤的修复
TT 光复活酶 （ 可见光 ） T + T
DNA修复方式
1,光修复,
2.切除修复,由 3种 酶 共同参与完成。
特异性核酸内切酶
DNA pol I
DNA连接酶
5'
5' 3'
3'
5'
5' 3'
3'
5'
5' 3'
3'
5'
5' 3'
3'
5'
3'
3'
5'
5'
3'
3'
5'
5'
3'
3'
5'
5'
3'
3'
5'
5'
3'
3'
5'
5'
3'
3'
5'
5'
3'
3'
5'
复制 重组 DDDP I
DNA
连接酶
重组修复过程
3.重组修复,亦称 复制后修复
4,SOS修复, DNA分子受到较大范围的损
伤，细胞对危急状态所作出的反应。
机制
引起 DNA较长期的、广泛的突变。
SOS调节网诱导产生的 DNA聚合酶 特异性
低，识别碱基能力差,使修复部位仍存在较
多错配的碱基，但细胞能继续生存。
后果
第二节 RNA的生物合成
? DNA→RNA 转录
? RNA→RNA RNA复制
两种方式
存在于绝大多数生物体
存在于某些病毒体内
一、转 录
（一）概念
在 DNA指导的 RNA聚合酶 催化下，以
DNA的模板链为 模板, 4种 NTP为 原料,按
碱基配对规律 (T-A,A-U,G-C)合成一条 与模
板链互补的 RNA链的过程 。
⒈ RNA聚合酶 常称为转录酶 (transcriptase) 其全称为, DNA依赖的 RNA聚合酶
(DNA-dependent RNA polymerase,DDRP)
▲ E.Coli的 DDRP 由 5 个亚基组成
（二）参与转录的酶和有关因子
+ζ因子 α2ββ'(核心酶 ) ζα2ββ'(全酶 )
表 13-6 大肠杆菌 RNA聚合酶亚基组成及其功能
────────────────────────
类型 亚基 /酶分子 主 要 功 能
────────────────────────
α 2 决定哪些基因被转录
β 1 参与转录的全过程
β' 1 与模板 DNA结合 被 利福平
ζ 1 识别转录起始点 被 利福霉素
────────────────────────
真核生物 DDRP的种类与功能
种类 存在部位 转录产物 对鹅膏蕈碱
的敏感性
RNA聚合酶 Ⅰ 核仁 45S rRNA 不 敏感
RNA聚合酶 Ⅱ 核质 hnRNA和 snRNA 极 敏感
RNA聚合酶 Ⅲ 核质 tRNA和 5S-rRNA 中度 敏感
DDRP无 3’ →5 ’ 外切酶活性,有什么结果?
RNA聚合酶的主要功能
? 能 识别并结合 于 DNA模板的 启动子 部位
（真核生物还需要转录因子的帮助）
? 解开转录起始点下游一小段 (约 17bp)
DNA双螺旋，产生单链模板 ;
? 不需引物,催化形成第一个 3',5'-磷酸二酯
键，沿 5'→3 '方向延伸 RNA链
? 能 识别 DNA模板上的转录 终止信号 (依赖
于 ζ因子 )
? 在基因表达中，参与转录水平的调控
⒉ ρ因子 (Rho factor)
功能
(1)能帮助 DDRP识别终止信号并停止转录
(2)具有 ATP酶和解链酶活性，使 RNA-DNA
杂化分子解链，从而释放转录产物 RNA分子
3,转录的 DNA模板
? 细胞内 DNA不是其全长都可作为转录
模板
? DNA双链中，可作为模板转录成 RNA
的一条链，称为模板链 (或反意义链 )
? 同一 DNA双链中与模板链相对 (互补 )的
一条链称为编码链 (或有意义链 )，可见
转录是不对称的
? 模板链 =反意义链 =负链
? 编码链 =有意义链 =正链
为何称模板链为反意义链,编码链为有意义链？
可从下图理解,
５ ' … GCA GTA CAT GTC … 3 ' 编码链
3 ' … CGT CAT GTA CAG … ５ ' 模板链 DNA
转录
５ ' … GCA GUA CAU GUC … 3 ' mRNA
翻译
N … 丙 － 缬 － 组 － 缬 … C 肽
比较编码链和 RNA 链的碱基序列可见，除了以
Ｕ代Ｔ外，其余均一致。基因组序列均以编码链 (
正链 )表示,
不对称转录的两方面含义,
5 ' 3 '
3 ' 5 '
模板链（含结构基因）
编码链
? DNA 分子上的一条链可转录，另一条
不转录
? 模板链并非永远在同一单链上
1,启动子（ promoter）
RNA 聚合酶与模板 DNA结合的特定部位，是基
因转录的开始部位。
一般可
分为
两类
DDRP 能直接识别的启动子
需蛋白质辅助因子的帮助,DDRP 才
能识别的启动子
（四）启动子及终止信号
确保转录精确而有效地起始的 DNA 序列
原核生物启动子的 3个功能部位
? 转录起始点,常标以 +1,第 1个核苷酸
为嘌呤核苷酸 (A或 G),上游或下游,
+或 -表示
? 结合部位,长度为 7bp,位于 -10bp处,
有一 共有序列 (-TATAAT-,Pribnow
盒 )
? RNA聚合酶的识别部位,由约 6bp,
位于 -35bp,也有 共有序列 (-
TTGACA-)
编码链 5 ' 3 '
启动子
5 ' MeGPPP
RNA产物
原核生物启动子
转录起始部位
+1
基因转录区
-10区
TATAAT
Pribnow 盒
结合部位
TGTTGACA
-35区
识别部位
DNA
模板链 3 ' 5 '
编码链 5 ' 3 '
DNA
模板链 3 ' 5 '
CCAAT
CAAT盒
-70
真核生物启动子
RNA产物
转录起始部位
+1
基因
转录区
TATA
TATA盒
-25
Hogness盒
结合部位
GAGCCACCC
GC盒
(少数 )
2,终止信号 (终止子 )
DNA分子中决定 RNA聚合酶终止转录
的特定碱基序列。
原核生物终止信号碱基组成特点
有反向重复序列 决定转录产物的回折形成茎 -环 (或称发夹 )结构
AT富集区 GC富集区
反向重复序列
AT富集区 GC富集区
一般认为由终止子
引导的转录终止是
不依赖 ρ因子的
(五 ) 转录过程
?起始
?延长
?终止
(以大肠杆菌的转录为例）
1,转录起始
形成 转录空泡 （ DNA解链长约 20bp)
DDRP(ζ亚基 )辨认并结合于启动子部位
由 DDRP催化,头 2 个 NTP直接在起始点形成
第一个 磷酸二酯键 (不需引物，由模板指导 ),形
成 转录起始复合物
ζ亚基脱落（参与下一轮转录）
由核心酶 (α2ββ')催化链的延伸
第
一
个
总
是GT
P
全酶 ( ζα2ββ' )-DNA模板 (启动子 )-pppGpN'-OH
3 ' 5 ' DNA
5 ' 3 ' DNA
起始点 RNA聚合酶
pppG
pppN'
pppN''
5'pppGpN'
转录起始时 pppGpN-OH的生成
CN 3 ' 5 ' 模板链
` CN 3 ' 5 ' 模板链
进一步延长
起始
2,链的延长
? 转录起始时形成的“转录泡”仍保留
? RNA链的延长由核心酶催化
? 核心酶 沿模板链 3'→5 '方向移动,RNA
链 按碱基配对规律 沿 5'→3 '方向延伸
? 新生链与模板链形成杂化双链 (该杂化
分子结构不稳定,RNA链游离后，
DNA双链重新形成 )
? 随“转录泡”和 DDRP不断移动 (单链
模板不断暴露 )，转录连续不断地进行
要
点
? 不依赖于 ?因子的终止
见前述 ? 因子的
功能及右图
依赖 ?因子的
终止作用机理
l 作用机理,终止信号区特殊碱基
序列决定 RNA形成发夹形二级结构,
这是阻止转录继续向下游推进的关键；
l RNA-DNA杂化双链不稳定因素,
? DNA复性,RNA自身形成双链；
? RNA3'端，连续多个不稳定的 rU,
dA 碱基配对，使转录复合体解体 。
不依赖 ?因子的终止
转录过程
RNA 蛋白质
蛋白质 RNA
DNA 复制
复制
反转录
转录
翻译
翻译
遗传信息传递的 中心法则
蛋白质的生物合成
一 蛋白质生物合成体系
?
一,mRNA（ messenger RNA）
—— 蛋白质生物合成的 直接模板
DNA
mRNA
蛋白质
一,mRNA
* mRNA分子中 每三个相临碱基 组成一个
密码子,代表一种 氨基酸,或 起始 信号,
或 终止 信号。
* mRNA上的四种 碱基 可组成 64(43)个密码子,
其中 61个代表不同的氨基酸，其余三个
代表终止信号。
通
用
遗
传
密
码
子
l 遗传密码的 5个特点,
,1,通用性,
从简单生物到人类使用同一套密码子。
,2,方向性,
mRNA中密码子的阅读方向是 5′→3′ 。
由此可推测所有生物来源于一个共同的祖先。
,3,简并性,
除 Met,Trp外，其余氨基酸由 2个以上
密码子编码。 同义密码子
（ 但每一个密码子仅对应一个氨基酸）
生物学意义, 保证属的稳定性 。
,4,连续性,
密码子的排列是连续的，不间隔，也不
重叠。
5′…,UCACGACAUAUG….3′
5′…,UCAGCGACAUAUG….3′
丝 精 组 蛋
丝 丙 苏 酪
5′…,UCAGACAUAUG….3′
丝 天 异亮
* 移码突变 是最严重的突变！
插入
缺失
,5,起始 密码子与 终止 密码子,
起始 密码子, AUG,GUG,UUC。
终止 密码子, UAA,UGA, UAG。
单顺反子,真核 生物 中，一条 mRNA链只
能为 一 种蛋白质编码 。
多顺反子,原核 生物 中，一条 mRNA链往
往为功能相关的 几 种蛋白质编码 。
氨基酸臂
反密码子环
二,tRNA（ transfer RNA）
— 蛋白质生物合成的
, 高级搬运工,
l tRNA的功能,
· 活化 氨基酸，跨越能障，使肽键的
形成变得容易。
? 特定 的 tRNA搬运 特定 的氨基酸,
保证了 遗传信息传递 的 准确性 。
? 将 密码子 信息 转换 为对应 氨基酸 的符号
—— 接合体，接合器，适配器 (adaptor)等。
即 tRNA能与专一的氨基酸结合并识别
mRNA分子上的密码子,
l tRNA搬运功能的 忠实性 是通过以下
两条途径实现的,
· tRNA的 反密码子 识别 mRNA的 密码子 。
? 不同的 tRNA有不同的碱基组成，并由
不同的 氨基酰 tRNA合成酶 识别。
既能识别 特异 的 tRNA,
又能识别 特异 的 氨基酸 。
l tRNA上的 反密码子 识别 mRNA上的
密码子 遵循 不稳定 或 摆动 （ wobbling）
配对 原则。
* 一种 tRNA仅转运一种 氨基酸,
而一种 氨基酸 可由几种 tRNA转运。
ACG 5′ 3′
5′
3′
UGU
mRNA
tRNA反密码环
反密码子的
第一碱基
密码子的
第三碱基
U A或 G
I U,C或 A
G C或 U
* 在 大肠杆菌 中,与 Met特异结合的 tRNA有两种,
tRNAfMet 和 tRNAMet
CH3
S
CH2
CH2
CH H2N COO tRNAfMet
转甲酰基酶
N10-CHO-FH4
CH3
S
CH2
CH2
CH H-C-HN COO tRNAfMet
O
+ Met-tRNAMet上的 Met则 不被甲酰化 ！
tRNAiMet,真核 细胞中起始 tRNA,不被甲酰化
三、核糖体（ ribosome）
—— 蛋白质生物合成的 场所
l 组成、结构与功能特点,
,1,结构复杂而精密
由 3种的 rRNA（ 占 60%左右）
及数十种 蛋白质 组成。
,2,rRNA起着 主导 的作用,蛋白质
协助维持 rRNA的功能区域。
,3,转肽酶是 RNA而不是蛋白质。
Et Ep
P A
mRNA
mRNA
结合位点
细胞
内膜
系统
三,核糖体 — 蛋白质生物合成的 场所
T
A,受位,氨基酰位；
P,给位,肽位； Et,tRNA出口 Ep:多肽链出口 ;
T,转肽酶。
四,参与蛋白质生物合成的 其他组分
3 1,氨基酰 tRNA合成酶
3 2,GTP,ATP
3 3,起始因子（ IF）
3 4,延长因子（ EF）
3 5,释放因子（ RF）
……
或称为终止因子（ TF）
第二节 蛋白质生物合成过程
一,氨基酸 的 活化 与 转运
二,多肽链 的形成 — 核糖体循环
三,翻译后加工
一,氨基酸的 活化 与 转运
氨基酰 tRNA
合成酶
ATP PPi
H2N-CH-C-OH
R O
H2N-CH-C-AMP-E
R O
H2N-CH-C~O-ACC-tRNA
R O
氨基酰 tRNA合成酶
高度特异性
氨基酰 tRNA
合成酶
tRNA
氨基酸
tRNA
消耗 2个高
能磷酸键
二,核糖体循环 （ ribosome cycle）
活化氨基酸在核糖体上缩合形成多肽链的过程
1,起始
2,肽链 延长
3,终止
(一 ) 起始阶段 起始氨基酰 -tRNA 与 mRNA
结合到核糖体上,形成起始复合物的过程
原料, fMet-tRNA,IF(1,2,3),GTP,Mg2+
1,小亚基 识别并结合 mRNA
30S
50S
50S +
mRNA 解聚
30S
* 小亚基 识别并结合 mRNA起始密码子上游 10nt富含
嘌呤碱基的 SD序列, IF3加固这一作用。
IF-1 IF-3
小亚基的 16S rRNA
3′端的 UCCU序列
2,fMet-tRNAfMet与 小 亚基结合
fMet
IF-2,
3,大小亚基 聚合
50S 起始复合物
GTP AUG AUG
fMet
AUG
fMet
AUG
fMet
IF-2
* 真核生物 与 原核生物 核糖体循环的
起始过程 的不同点,
,1,起始 Met-tRNAMet不需甲酰化；
,2,起始因子 不少于 10种；
,3,小亚基 先与 Met-tRNAMet结合，再与
mRNA结合；
,4,ATP供能。
（二） 肽链延长阶段,
原料,各种 氨基酰 -tRNA,EF（ Tu,Ts,G）,
GTP,Mg2+,K+。
1,进位
Tu-GDP
GDP
Ts
Tu-Ts
Tu-GTP
GTP
Pi
Tu-GTP
特异的氨基酰 -tRNA进入 A位
p A
AUG
AUG
Tu-GTP
2,转肽
Mg2+,K+
转肽酶
CH2CH2-CH
O
C = O
CH-R
NH2
O=
O
C
H2N
CH3
S
AUG
UAC
给 受
O
C O =
R-CH
NH
OH
C O=
H3CSCH2CH2-CH
NH2
AUG
UAC
给 受
3,移位
OH
EFG,GTP
AUG
A
2 1
5′→3′
OH 2 1
AUG 5′ 3′
AUG
2 1
3
AUG
3
1 2
AUG
2 1 3
进位
转肽
移位
转肽 N→C 延长
通过进位 -转肽 -移位不断重复,
肽链自 N→C 端不断延长
OH
EFG,GTP
OH
A
每生成 1个肽键,要消耗 2分子 GTP(进位 和 移
位 ),而氨基酸活化需消耗 2个 高能磷酸键，每增加
1个氨基酸残基实际消耗 4个 高能磷酸键
* 真核生物 与 原核生物 核糖体循环的
肽链延长阶段 的不同点,
,1,进位时 延长因子 是 EF-1,
可分为 ?,?和 ?三类；
,2,移位时 延长因子 为 EF-2,
其活性可被 白喉毒素 抑制
三、终止阶段
RF-3,促使 RF-1 或 RF-2从 核糖体 上结合
* 真核生物 仅有一个 释放因子, eRF,
可识别三种密码子,并需 GTP参与。
RF-1,UAA,UAG
RF-2,UAA,UGA
当 mRNA的任一终止信号进入 A位时，
没有任何 tRNA能与之识别，只有释放因子
(RF)识别这种信号,进入终止阶段,
1,终止密码子的辨认
RF-1
或 RF-2
UAA
O
C O =
R-CH
A
O
C O =
R-CH
UAA
RF
H-OH
转肽酶
2,肽链的水解和脱落
OH
RF
C O =
R-CH
O
RF
R-CH
C-OH O =
3,tRNA,RF,mRNA的释放，核糖体
大小亚基的解聚
OH
RF-3,IF-3
EF-G RF OH
RF
核糖体循环,
fMet
AUG
1,起始 2,肽链延长
3,终止
三,多核糖体
5′ 3′
意义,提高翻译效率 。
同时结合到同一条 mRNA上多个成串的
核糖体
四,翻译后加工
（一） 切割
（二） 修饰
（三） 新生肽链 的 折叠
1,去除 N末端 蛋氨酸残基
2,信号肽 及 其他肽段 的切除
1,二硫键 的形成
2,辅助因子 的连接和 亚基 聚合
3,多肽链中 个别氨基酸 的修饰
四,翻译后加工
（一） 切割
原核生物
1,去除 N末端 蛋氨酸残基
脱甲
酰基酶 Met- fMet- 氨基肽酶
真核细胞
2,信号肽 及 部分肽段 的切除
l 分泌性蛋白 前体 的两个特点,
o 1,N端含有 信号肽 （ signal peptide）
信号肽 富含 疏 水氨基酸,其作用是
使新合成的多肽链 易于穿过膜系统，
随后被 信号肽酶 切除。
o 2,往往还含有一段 与活性无关 的其
他肽段，必须将其切除才能形成 有
活性的蛋白质 。
胰岛素的前体 胰岛素
切去
C肽段
C肽段 A肽段 B肽段
l 分泌性蛋白 穿过膜系统的 两种机制
o 1,分泌性蛋白
在 信号肽 的
介导下 直接
穿透膜系统
小亚基
大亚基
信号肽
内质网膜内侧
（二）修饰
,1,二硫键 的形成
Cys
SH
Cys
SH
Cys
S
Cys
S -2H
二硫键
异构酶等
,2,辅助因子 的连接和 亚基 聚合
o 蛋白质与糖、脂类、核酸、血红素等
辅助因子结合形成 糖蛋白, 脂蛋白,
核蛋白, 血红蛋白 等 结合蛋白质 。
o 具有 四级结构 的蛋白质需进行 亚基 之间
的聚合。如血红蛋白 4个亚基的聚合。
,3,多肽链中 个别氨基酸 的修饰
o 磷酸化,丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸
o 羟基化,脯氨酸，赖氨酸
o 酰基化,组氨酸
o 甲基化,色氨酸
o 核糖基化,精氨酸
意义,或者是蛋白
质所固有的，或者
在调节蛋白质功能
时起重要作用。
（三） 新生肽链 的 折叠 （ folding）
* 蛋白质的生物活性 不仅依赖于他们的氨基酸
顺序,而且依赖于他们的空间结构 。
* 新生肽链 必需经过一系列严格而复杂的 折叠
过程，才能形成具有正确空间结构的有活性
的 蛋白质 。
* 多肽链的氨基酸顺序如何决定蛋白质的空间
结构 —— 第二遗传密码？
—— 中心法则 研究中有待解决的重大问题
补充内容
* 新生肽链的折叠 需要 分子伴侣
和 折叠酶类 的参与
` 分子伴侣（ molecular chaperone）,
帮助 新生肽链 进行 非共价折叠 的一类
蛋白质。如：热休克蛋白，前导肽等
` 折叠酶（ foldase） 类,
目前只有两个,1,二硫键异构酶 (PDI),
2,脯氨酰异构酶 (PPI)。
催化与 折叠 直接有关的化学反应的酶。
分子伴侣 帮助 新生肽链 正确折叠
分子伴侣
新生肽链
正确
折叠
的蛋
白质
错误 折叠的
蛋白质
基因工程基本原理
一、基因工程的定义及主要内容
二、重组 DNA分子引入宿主细胞和筛选鉴定
三、克隆基因的表达
四、基因工程的成就和展望
一、基因工程定义及主要内容
? 基因工程也称基因重组技术、基因克隆
或分子克隆
? 是指利用 DNA重组技术生产或改造生物产
品、创建或改良动植物品种以及开发特
殊用途的微生物等
? 是生物工程的重要内容之一
? 主要步骤,
1、构建 DNA重组分子
2、重组 DNA分子引入宿主细胞和筛选鉴定
3、基因的表达
一、基因工程定义及主要内容
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基
因
工
程
基
本
程
序
真核染色体 DNA
克隆载体
（质粒）
限制酶切割
限制酶切割并
分离所需片断
重组载体
细菌宿主细
胞的转化
细胞分离
培养增值
构建 DNA重组分子
? 工具酶
? 目的基因的制备
? 克隆载体
? DNA分子的体外重组
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工具酶
? 限制性内切酶是基因工程中最主要的工
具酶
? DNA连接酶（ DNA ligase）,DNA聚合酶
Ⅰ （ DNA polymeraseⅠ ）,末端转移酶
（ terminal transferase）,逆转录酶
（ reverse transcriptase）,核酸酶 S1
（ nuclease S1） 和核酸外切酶 Ⅶ
（ exonucleaseⅦ ）
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限制性核酸内切酶 ? 能识别 DNA特定核苷酸序列的核酸内切酶
? 分布：主要在微生物中 。
? 特点：特异性, 即识别特定核苷酸序列,
切割特定切点 。
? 结果：产生黏性未端 （ 碱基互补配对 ） 。
? 举例：大肠杆菌的一种限制酶能识别 GAATTC
序列, 并在 G和 A之间切开 。
限制性核酸内切酶
? 由 Smith在 1970年从流感噬血菌中发现
? 细菌体内有特异的限制修饰系统，这种修饰
系统是通过特殊的修饰酶在细菌本身 DNA的特
异识别序列处进行甲基化修饰，从而与外源
DNA相区别。这样，限制性核酸内切酶就能去
切割破坏外源 DNA,而对本身无影响。
? 目前已从原核生物中分离出 400～ 500多种限
制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶
? 限制性内切酶可识别 4或 6个特异核苷酸序列
? 粘性末端：指限制性内切酶的切割部位不在识
别序列的中心轴，在断段产生一个短的单股突
伸出来的不齐末端。
? 钝性末端：指限制性内切酶的切割部位在识别
序列的中心轴处，即产生平齐末端。
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几种限制性内切酶的作用位点
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几种限制性内切酶的作用位点
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目的基因的制备
? 目的基因就是所需要克隆的外源基因
? 制备方法,
1,人工合成法
2,逆转录法
3,用限制性内切酶直接从染色体 DNA中分
离
4,用 PCR法扩增目的基因片段
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目的基因的制备：人工合成法
? 较小分子基因可用人工化学合成的方法
获得
? DNA化学人工合成的方法已经自动化
? 人工合成目的基因的先决条件是基因的
核苷酸序列是已知的
? 缺点是,1、不能合成太大的基因； 2、
合成基因时遗传密码的兼并现象会为选
择密码带来很大困难； 3、费用较高
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目的基因的制备：逆转录法
? 若所需基因较大，人工合成有困难，从组织中
分离提取也不容易，则可利用逆转录法合成。
? 该法是：以编码某特异多肽的 mRNA为模板，在
逆转录酶的作用下反转录成该多肽 mRNA的互补
DNA（ cDNA）； 再以 cDNA为模板，在逆转录酶
或 DNA聚合酶 I（ 或其 KIenow片段）作用下，最
终合成编码该多肽的双链 DNA（ dsDNA）。
? 可用于真核生物目的基因的获得
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目的基因的制备：逆转录法
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目的基因的制备,逆转录法
? 用逆转录法合成 cDNA的主要问题是,
1,mRNA必需提得很纯
2、逆转录中常产生各种不完全的逆转录产
物,
3、以单链 cDNA为模板往往难以合成与单链
cDNA一样长的 ds－ cDNA,这与实验技术
有关。
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用限制酶切法直接从染色体 DNA中分离
? 此方法主要适用于制备原核基因
? 对于物理图谱已清楚的原核基因，可用限制酶
把目的基因切出来
? 鸟枪法是指把目的基因从已用限制酶降解的染
色体片段群中分离纯化出的方法，即把包括目
的基因在内的全部 DNA片段插入到载体 DNA（ 如
pBR322） 中，转化大肠杆菌，做成基因文库。
再用目的基因的转录产物作探针，通过分子杂
交，选择出含有所需基因的 DNA片段。
用限制酶切法直接从染色体 DNA中分离
? 此方法的优点是获得的目的基因的组织
结构与天然基因一样，也具有间隔顺序。
? 此方法的缺点是：由于含有插入顺序，
原始转录本不能被原核细胞识别，并将
插入顺序切除，以形成成熟转录本，因
此也得不到目的基因的产物多肽或蛋白
质。
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用 PCR方法 扩增目的基因片段
? PCR是聚合酶链反应的缩写
? 是一种在体外模拟天然 DNA复制过程的核酸扩
增技术
? 在有少量 DNA模板、引物、四种 dNTP,TaqDNA
聚合酶、合适的缓冲系统下，通过仪器控制
DNA变性、退火及延伸的温度与时间，来合成
新的 DNA链，新合成的 DNA链又可作为下一轮循
环的模板。理论上经 n次循环后,DNA链可达 2n
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用 PCR方法扩增目的基因片段
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克隆载体
? 目的基因若无合适的载体协助，就很难进入受
体细胞；
? 为了保证目的基因能够繁殖，必需将它与载体
连接
? 理想的载体
1、较小的、能进行复制的分子，具有高拷贝数
2、具有较少的限制酶的切点，最好是单一切割
点，以便所要克隆的 DNA片段能被插入载体
克隆载体
? 3、外源 DNA片段插入载体后，不得使载体的
复制功能丧失
? 4、具有某种明显的标志，例如抗药性标记，
以便利用这些标志筛选阳性克隆
? 5、携带外源 DNA的幅度较宽
? 6、生物防护是安全的
克隆载体
克隆载体
? 常用的克隆载体有：质粒、噬菌体及病毒
? 质粒是某些细菌中独立于染色体外的共价闭合
环状双链 DNA。 质粒具有复制能力，它的存在
与否一般对细菌的生存没有决定性影响。
? λ 噬菌体是一种能感染大肠杆菌的病毒，其
DNA中的 1/3对噬菌体的生长并非绝对需要，因
此可被外源性 DNA所替代，同时它可在体外包
装成病毒颗粒，高效感染大肠杆菌。克隆容量
小于 23kb
克隆载体
? 粘性质粒（ Cosmid）,是人工构建的、
兼具质粒与噬菌体双重特性的大容量载
体。克隆容量可达 45kb。
? 酵母人工染色体,20世纪 80年代发展起
来的大片段外源基因克隆体系，其克隆
容量可达 200~1000kb。
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DNA分子的 体外重组
? 所谓重组 DNA分子就是把外源 DNA分子
（目的基因）插入到载体中，使两种 DNA
分子连接起来
? 体外 DNA分子重组有两种方法,
1,粘性末端连接法
2,平头末端连接法
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粘性末端连接法
? 用同一种或两种限制酶去消化载体和外源 DNA
分子，可产生相同的粘性末端，这些粘性末端
能退火互补，进一步用 DNA连接酶将断端封口，
即可获得重组 DNA分子。
? 用同一种限制酶处理外源 DNA和载体，重组时
可导致外源 DNA特别是质粒的自我环化
? 用碱性磷酸脂酶（不处理外源 DNA分子）处理
粘性末端的 5‘ 磷酸基，能促使载体与外源 DNA
分子连接。重组体每条链仍残留的一个缺口，
待进入宿主细胞内可被修复
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磷
酸
脂
酶
能
防
止
载
体
的
自
我
环
化
返回
用
两
种
限
制
酶
处
理
载
体
也
可
防
止
环
化
钝性末端连接法
? 用前述的化学合成法、逆转录法获得的 DNA或
cDNA片断，以及某些限制酶切生成的 DNA片断，
均为钝性末端，可用 T4DNA连接酶连接，也可
将其改造成粘性末端再行连接,
1、加接头：这种人工接头含某种限制酶的单切
点，用限制酶消化该接头可产生粘性末端。
2、加尾巴：应用末端转移酶在载体与外源 DNA分
子上加上互补的同聚核苷酸，经过退火可使两
者形成重组体 返回
钝性末端连接法
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末端转移酶处理
退火
二、重组 DNA引入宿主细胞和筛选鉴定
? 重组 DNA引入宿主细胞
1、转染：将噬菌体 DNA引入宿主细胞的过程
2、转化：将质粒或染色体 DNA引入宿主细胞的过
程
? 重组体克隆的筛选与鉴定
1,插入灭活法
2、噬菌斑形成筛选法
3、核酸杂交法
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插入灭活法
? 目前使用的质粒载体都有抗药标记。被
转化的细菌在含有这种（些）抗生素的
培养基中能够生长，而未被转化的细菌
则不能生长或被杀死。然而，当限制酶
作用于载体 DNA的某一抗药基因上并在此
插入外源 DNA时，载体上原有的抗药基因
即被破坏。由此重组体转化的宿主细胞，
则对这个抗生素敏感，这样便可筛选出
转化菌株。
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插
入
灭
活
法
限制酶切
转化
含四环素
T A＋ T
三、克隆基因的表达
? 外源基因在大肠杆菌体系中的表
达
? 外源基因在真核细胞体系中的表
达
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四、基因工程的成就与展望
? 在农业上的成就与意义
? 在工业方面的成就与意义
? 在制药工业中的成就与意义
? 癌症的研究与治疗
? 遗传病的预防与治疗
插入灭活法
? 目前使用的质粒载体都有抗药标记。被
转化的细菌在含有这种（些）抗生素的
培养基中能够生长，而未被转化的细菌
则不能生长或被杀死。然而，当限制酶
作用于载体 DNA的某一抗药基因上并在此
插入外源 DNA时，载体上原有的抗药基因
即被破坏。由此重组体转化的宿主细胞，
则对这个抗生素敏感，这样便可筛选出
转化菌株。
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