生化技术
绪论
? 1定义
? 生化技术 ——在生物化学及其相关学科
应用的各种技术, 主要指生物体内物质
及其代谢产物, 特别是生物大分子的分
离, 检测, 制备与改造技术 。
2发展过程
? 1923 Svedberg设计超速离心机
? 1925 Warberg发明微量检压仪
? 1930 放射性同位素技术在生物化学过程中应用
? 1931 Kuhn柱层析分离 α,β-胡萝卜素
? 1940 电泳, 层析技术
? 50-52 气相色谱 （ GC）
? 1956 Sanger x射线衍射技术确定蛋白质一级结构
? 1953 Watson,Crick x射线衍射技术 DNA双螺旋结构
? 1960 操纵子学说
? 1964 人工合成胰岛素
? 1969 固定化酶, 细胞技术
? 1973 基因工程
? 1975 细胞工程 （ 杂交瘤技术 ）
? 1990 启动人类基因组计划
? 1996,多莉, 羊诞生
第一篇 生化分离技术
? 第一章 生物大分子的提取与沉淀分离
技术
? 生物大分子：蛋白质、酶、核酸、多糖
和脂类
第一节 细胞破碎
? 细胞破碎的原因,
? 破碎的主要方法：机械法, 物理法, 化
学法, 酶法
1 机械破碎方法
? 1,1高速组织捣碎机
? 原理
? 操作：装料, 低速 →高速
? 效果：作用强烈, 活性物质易受破坏
? 1,2匀浆器
? 原理,
? 效果：破碎程度较捣碎机高, 破坏较少
? 1,3研磨器
2 物理破碎
? 2.1温度差破碎法
? 2.2压力差破碎法
? 2.3超声波破碎法
? 影响因素：样品浓度, 超声波频率, 功
率, 破碎时间
? 操作：冰浴, 间歇进行
? 适用于悬浮细胞破碎
? 3化学破碎法
? 原理：化学试剂改变或破坏细胞膜结构
? 常用试剂：有机溶剂, 表面活性剂
? 4 酶学破碎法
? 外加酶制剂或自溶法
第二节 提取
1 提取的基本概念与影响因素
? 提取 （ 抽提或萃取 ）,
? 主要影响因素,
? a 欲提取的物质在所用的溶剂中的溶解度； b该
物质向溶剂扩散的难易
? 溶解度大小,a 溶剂：相似相溶； b 温度 c等
电点
2 蛋白质和酶的提取
? 提取方法：水溶液提取, 有机溶剂提取, 混合
提取
? 选择方法依据：存在部位, 分子结构和溶解性
质
2.1水溶液提取
? 水, 稀盐, 稀酸, 稀碱溶液
? 常用稀盐溶液和缓冲液，应注意控制盐
浓度、温度,pH
? 2.1.1盐浓度的选择
? 一般用等渗盐溶液 。 但根据溶解度, 有
些蛋白质要用较高浓度盐溶液提取, 而
有些则用纯水提取 。
? 2.1.2 pH的选择
? 不在等电点附近, 但不宜太高或太低 。
? pH3~4有利于离子键分离
? 2.1.3温度的选择
? 一般 0~10℃ （ 常用 4℃ ）, 对于耐高温的
蛋白质和酶, 可适当提高温度, 可使杂
蛋白变性分离, 有利于提取和进一步纯
化 。
? 2.1.4添加底物或辅酶有利于酶的提取
? 2.2有机溶剂提取
? 常用有机溶剂：乙醇, 丙酮, 丁醇等
? 注意：蛋白质提取应根据不同蛋白质的
不同性质选用不同的提取条件
3 核酸的提取
? 类化合物都溶于水而不溶于有机溶液, 一般用
水溶液提取 。 提取的一般都是 核蛋白 。
? DNA-Pro.与 RNA-Pro.在不同浓度电解质溶液中
溶解度有明显差别,
? 0.14mol/L NaCl,RNA-Pro,溶 解度相 当大,
DNA-Pro.溶解度仅为水中 1％ 。
? 1 mol/L NaCl,RNA-Pro.溶解度小, DNA-Pro.溶
解度比水中大 2倍 。
? DNA-Pro.与 RNA-Pro.在不同 pH下溶解度不同
? RNA-Pro,PH2.0-2.5 S最小
? DNA-Pro,PH4.2 S最小
? 应选择不同的条件提取分离 DNA-Pro.与 RNA-
Pro,
3.1 RNA提取
? 细胞破碎 →水溶 →过滤去渣 →调 pH5 →
tRNA↓
? mRNA,rRNA,
? 3.1.1 稀盐溶液提取
? 细胞破碎 → 匀浆 0.14 mol/L NaCl→RNA-
Pro提取液 →分离 DNA-Pro,Pro,多糖
? RNA, tRNA15%, mRNA5%,
rRNA80%
? 3.1.2 苯酚水溶液提取
? 细胞破碎 → 匀浆 等体积 90％ 苯酚水溶液振荡
→RNA,Pro分开 →RNA,多糖 （ 水层 ） ；
DNA,Pro（ 苯酚层 ）
? 冷酚法, 热酚法, 注意苯酚除杂
? 3.2 DNA提取
? 浓盐法,1mol/L氯化钠溶液提取，＋含少量辛
醇或戊醇的氯仿一起振荡除去蛋白质
? 或：先用稀盐除去 RNA－ Pro，再用浓盐提取
? 也可用苯酚法，苯酚层得到 DNA,Pro
第三节 沉淀分离
? 分离纯化：除去各种杂质, 获得较高纯
度物质的过程
? 蛋白质和酶分离提纯方法：沉淀分离,
层析分离, 电泳分离, 超离心分离等 。
? 沉淀分离,通过改变某些条件或加入某
种物质，使溶液中某种溶质的溶解度降
低，从而从溶液中沉淀析出的技术。包
括盐析沉淀、等电点沉淀、有机溶剂沉
淀、复合沉淀法、金属盐沉淀法、选择
性变性沉淀等。
3.1 盐析沉淀法
? 蛋白质在水溶液中的溶解度受盐浓度影
响
? 盐溶,
? 盐析,
?
? 盐浓度改变蛋白质溶解度：改变蛋白质
分子表面电荷, 同时改变溶液中水的活
度, 改变水膜
? 蛋白质溶解度与溶液中离子强度关系,
? lg(S/S0)= -ksI
? lgS=lgS0-ksI=β-ksI
? β为常数, 取决于蛋白性质, T,pH
? ks为盐析常数, 与盐性质 （ 离子价数, 离子半
径等 ）, 蛋白结构有关
? ks越大, 盐析效果越好
? I=(1/2)∑mizi2
? 一定条件下, S取决于 I
? 分段盐析,ks分段盐析 （ β一定, pH,T一定 ） ；
β分段盐析 （ ks,I一定, 改变 pH,T）
? 3.1.2盐的选择
? 通常采用中性盐, 最常用 （ NH4） 2SO4，
原因,
? 水中 S大，温度对 S影响小，廉价易得，
不易引起蛋白质变性，分段效果好。
3.1.3盐析注意事项
? （ 1） 盐纯度高, 沉淀完全后再分离；
? （ 2） 分段盐析分离几种蛋白质, 与
等电点沉淀配合；
? （ 3） 室温或低温进行；
? （ 4） 选择合适浓度的样品；
? （ 5） 脱盐 （ 透析, 电渗析, 凝胶层
析, 超滤 ）
? 3.2 等电点沉淀法
? 3,3有机溶剂沉淀法
? 常用丙酮, 异丙酮, 乙醇, 甲醇等
? 适用范围,
? 缺点：易变性
? 操作：低温，沉淀分离后快稀释，添加
少量无机盐,pH接近 pI，用量试验确定，
可先浓缩。
? 3.4 选择性变性沉淀
? 杂蛋白变性沉淀, 不影响所需蛋白
三 核酸的沉淀分离
? 温度,0～ 4℃,防止变性和降解
? 加入核酸酶抑制剂防止核酸酶引起的水
解
? 1 有机溶液沉淀法
? 乙醇
? 2 等电点沉淀法
? 3 钙盐沉淀法（氯化钙＋乙醇）
? 4 选择性溶剂沉淀法
思考题
? 1 名词解释
? 提取；分离；盐溶；盐析
? 2 为何要进行细胞破碎？有哪些破碎方法？
? 3 影响物质提取的主要因素有哪些？
? 4 蛋白质和酶主要提取方法？沉淀分离方
法？
? 5 核酸主要提取方法？沉淀分离方法？
绪论
? 1定义
? 生化技术 ——在生物化学及其相关学科
应用的各种技术, 主要指生物体内物质
及其代谢产物, 特别是生物大分子的分
离, 检测, 制备与改造技术 。
2发展过程
? 1923 Svedberg设计超速离心机
? 1925 Warberg发明微量检压仪
? 1930 放射性同位素技术在生物化学过程中应用
? 1931 Kuhn柱层析分离 α,β-胡萝卜素
? 1940 电泳, 层析技术
? 50-52 气相色谱 （ GC）
? 1956 Sanger x射线衍射技术确定蛋白质一级结构
? 1953 Watson,Crick x射线衍射技术 DNA双螺旋结构
? 1960 操纵子学说
? 1964 人工合成胰岛素
? 1969 固定化酶, 细胞技术
? 1973 基因工程
? 1975 细胞工程 （ 杂交瘤技术 ）
? 1990 启动人类基因组计划
? 1996,多莉, 羊诞生
第一篇 生化分离技术
? 第一章 生物大分子的提取与沉淀分离
技术
? 生物大分子：蛋白质、酶、核酸、多糖
和脂类
第一节 细胞破碎
? 细胞破碎的原因,
? 破碎的主要方法：机械法, 物理法, 化
学法, 酶法
1 机械破碎方法
? 1,1高速组织捣碎机
? 原理
? 操作：装料, 低速 →高速
? 效果：作用强烈, 活性物质易受破坏
? 1,2匀浆器
? 原理,
? 效果：破碎程度较捣碎机高, 破坏较少
? 1,3研磨器
2 物理破碎
? 2.1温度差破碎法
? 2.2压力差破碎法
? 2.3超声波破碎法
? 影响因素：样品浓度, 超声波频率, 功
率, 破碎时间
? 操作：冰浴, 间歇进行
? 适用于悬浮细胞破碎
? 3化学破碎法
? 原理：化学试剂改变或破坏细胞膜结构
? 常用试剂：有机溶剂, 表面活性剂
? 4 酶学破碎法
? 外加酶制剂或自溶法
第二节 提取
1 提取的基本概念与影响因素
? 提取 （ 抽提或萃取 ）,
? 主要影响因素,
? a 欲提取的物质在所用的溶剂中的溶解度； b该
物质向溶剂扩散的难易
? 溶解度大小,a 溶剂：相似相溶； b 温度 c等
电点
2 蛋白质和酶的提取
? 提取方法：水溶液提取, 有机溶剂提取, 混合
提取
? 选择方法依据：存在部位, 分子结构和溶解性
质
2.1水溶液提取
? 水, 稀盐, 稀酸, 稀碱溶液
? 常用稀盐溶液和缓冲液，应注意控制盐
浓度、温度,pH
? 2.1.1盐浓度的选择
? 一般用等渗盐溶液 。 但根据溶解度, 有
些蛋白质要用较高浓度盐溶液提取, 而
有些则用纯水提取 。
? 2.1.2 pH的选择
? 不在等电点附近, 但不宜太高或太低 。
? pH3~4有利于离子键分离
? 2.1.3温度的选择
? 一般 0~10℃ （ 常用 4℃ ）, 对于耐高温的
蛋白质和酶, 可适当提高温度, 可使杂
蛋白变性分离, 有利于提取和进一步纯
化 。
? 2.1.4添加底物或辅酶有利于酶的提取
? 2.2有机溶剂提取
? 常用有机溶剂：乙醇, 丙酮, 丁醇等
? 注意：蛋白质提取应根据不同蛋白质的
不同性质选用不同的提取条件
3 核酸的提取
? 类化合物都溶于水而不溶于有机溶液, 一般用
水溶液提取 。 提取的一般都是 核蛋白 。
? DNA-Pro.与 RNA-Pro.在不同浓度电解质溶液中
溶解度有明显差别,
? 0.14mol/L NaCl,RNA-Pro,溶 解度相 当大,
DNA-Pro.溶解度仅为水中 1％ 。
? 1 mol/L NaCl,RNA-Pro.溶解度小, DNA-Pro.溶
解度比水中大 2倍 。
? DNA-Pro.与 RNA-Pro.在不同 pH下溶解度不同
? RNA-Pro,PH2.0-2.5 S最小
? DNA-Pro,PH4.2 S最小
? 应选择不同的条件提取分离 DNA-Pro.与 RNA-
Pro,
3.1 RNA提取
? 细胞破碎 →水溶 →过滤去渣 →调 pH5 →
tRNA↓
? mRNA,rRNA,
? 3.1.1 稀盐溶液提取
? 细胞破碎 → 匀浆 0.14 mol/L NaCl→RNA-
Pro提取液 →分离 DNA-Pro,Pro,多糖
? RNA, tRNA15%, mRNA5%,
rRNA80%
? 3.1.2 苯酚水溶液提取
? 细胞破碎 → 匀浆 等体积 90％ 苯酚水溶液振荡
→RNA,Pro分开 →RNA,多糖 （ 水层 ） ；
DNA,Pro（ 苯酚层 ）
? 冷酚法, 热酚法, 注意苯酚除杂
? 3.2 DNA提取
? 浓盐法,1mol/L氯化钠溶液提取，＋含少量辛
醇或戊醇的氯仿一起振荡除去蛋白质
? 或：先用稀盐除去 RNA－ Pro，再用浓盐提取
? 也可用苯酚法，苯酚层得到 DNA,Pro
第三节 沉淀分离
? 分离纯化：除去各种杂质, 获得较高纯
度物质的过程
? 蛋白质和酶分离提纯方法：沉淀分离,
层析分离, 电泳分离, 超离心分离等 。
? 沉淀分离,通过改变某些条件或加入某
种物质，使溶液中某种溶质的溶解度降
低，从而从溶液中沉淀析出的技术。包
括盐析沉淀、等电点沉淀、有机溶剂沉
淀、复合沉淀法、金属盐沉淀法、选择
性变性沉淀等。
3.1 盐析沉淀法
? 蛋白质在水溶液中的溶解度受盐浓度影
响
? 盐溶,
? 盐析,
?
? 盐浓度改变蛋白质溶解度：改变蛋白质
分子表面电荷, 同时改变溶液中水的活
度, 改变水膜
? 蛋白质溶解度与溶液中离子强度关系,
? lg(S/S0)= -ksI
? lgS=lgS0-ksI=β-ksI
? β为常数, 取决于蛋白性质, T,pH
? ks为盐析常数, 与盐性质 （ 离子价数, 离子半
径等 ）, 蛋白结构有关
? ks越大, 盐析效果越好
? I=(1/2)∑mizi2
? 一定条件下, S取决于 I
? 分段盐析,ks分段盐析 （ β一定, pH,T一定 ） ；
β分段盐析 （ ks,I一定, 改变 pH,T）
? 3.1.2盐的选择
? 通常采用中性盐, 最常用 （ NH4） 2SO4，
原因,
? 水中 S大，温度对 S影响小，廉价易得，
不易引起蛋白质变性，分段效果好。
3.1.3盐析注意事项
? （ 1） 盐纯度高, 沉淀完全后再分离；
? （ 2） 分段盐析分离几种蛋白质, 与
等电点沉淀配合；
? （ 3） 室温或低温进行；
? （ 4） 选择合适浓度的样品；
? （ 5） 脱盐 （ 透析, 电渗析, 凝胶层
析, 超滤 ）
? 3.2 等电点沉淀法
? 3,3有机溶剂沉淀法
? 常用丙酮, 异丙酮, 乙醇, 甲醇等
? 适用范围,
? 缺点：易变性
? 操作：低温，沉淀分离后快稀释，添加
少量无机盐,pH接近 pI，用量试验确定，
可先浓缩。
? 3.4 选择性变性沉淀
? 杂蛋白变性沉淀, 不影响所需蛋白
三 核酸的沉淀分离
? 温度,0～ 4℃,防止变性和降解
? 加入核酸酶抑制剂防止核酸酶引起的水
解
? 1 有机溶液沉淀法
? 乙醇
? 2 等电点沉淀法
? 3 钙盐沉淀法（氯化钙＋乙醇）
? 4 选择性溶剂沉淀法
思考题
? 1 名词解释
? 提取；分离；盐溶；盐析
? 2 为何要进行细胞破碎？有哪些破碎方法？
? 3 影响物质提取的主要因素有哪些？
? 4 蛋白质和酶主要提取方法？沉淀分离方
法？
? 5 核酸主要提取方法？沉淀分离方法？
