第七章 光学检测技术
? 利用物质所具有的各种光学性质，对物质
进行定性、定量及结构分析的技术。
? 包括：旋光检测、析光检测、荧光检测、
分光光度检测、散射光谱检测等。
? 生化领域常用：分光光度检测、旋光检测、
荧光检测
一 分光光度检测
? 又称分子吸收光谱检测，是利用物质分子
所特有的吸收光谱而对物质进行定性定量
测定的检测技术。
? 紫外分光光度检测（ 200～ 400nm）
? 可见光分光光度检测（ 400～ 760nm）
? 红外光分光光度检测（ 760～ 10000nm）
? 1 样品溶液的配备
? （ 1）对各种光有选择性吸收特性的物质
? （ 2）本身没有颜色的物质，转变为有色
的物质溶液
? 2 样品的检测
? 选择好入射光的波长，空白液调零，测
定。
? 3 待测物质的定性分析
? （ 1）将样品溶液在一定条件下（ pH、温度、
缓冲液等）测得的吸收光谱与物质的标准吸收
光谱相对照，推断样品是什么。
? （ 2）根据样品吸收光谱中峰顶与峰谷吸光度
之比值，与相当条件下资料所载的比值比较，
推断样品是什么。
? 如
? ATP,OD280/OD260=0.85,OD250/ OD260=0.90
? AMP,OD250/OD260=0.85,OD280/OD260=0.22
? (3)将分光光度检测与层析或电泳分离技术相配
合，综合判断。
? 4 待测物质的定量分析
? （ 1）标准曲线法
注意：对于存在有干扰物质的样品要进
行校正。
? （ 2） Lambert-Beer
E=KCL,K-消光系数
二 旋光检测技术
? 利用旋光计测量出 旋光物质（光学活性物质）
对偏振光旋转角度的方向（左旋或右旋）和大
小，从而进行定性与定量分析的技术，称为旋
光检测技术。
? 旋光物质对偏振光的旋转方向和角度大小是该
物质的固有特性。偏振光旋转的方向和角度称
为 旋光度。左旋（－），右旋（＋） 。
? 物质的旋光度主要取决于物质本身的结构，此
外与入射光的 波长及温度 有关，对溶液而言，
还与 溶液性质、溶液浓度和溶液厚度 有密切关
系。
? 溶剂确定后,
? α ＝ [α ]tλ LC/100
? α － 旋光度 L －溶液厚度（分米）
[α ]tλ －比旋光度，通常采用 [α ]20D
L －溶液厚度（分米）
C－溶液浓度,100mL溶液中所含物质
的克数。
? 根据物质的 [α ]20D 和实际测出的 α,可
计算得到 C= α × 100/ ([α ]tλ L)
? 操作要点,
? （ 1）样品液的配制
? （ 2）旋光度的测定
旋光法测定味精浓度
? 样品溶液配制
? 精确称取味精样品 10.00g，加 40～ 50mL蒸馏
水溶解，搅拌加入分析纯盐酸 16mL，使味精
全部溶解。冷却至室温，蒸馏水定容至 100mL。
? 旋光仪调零
? 预热 10min，放进滤光片。取 16mL分析纯盐酸
蒸馏水定容至 100mL。装满旋光管，调整零点。
? 样品液测定
? 样品洗涤旋光管三次，装满旋光管，放进样品
室，测定旋光度，记录温度。
? 计算
? C= α × 100/ ([α ]tλ L)
? [α ]tλ ＝ 32＋ 0.06× （ 20－ t)
? C味 =C× 187.13/147.13
? 味精纯度＝ C味 /样品重量
三 荧光检测技术
? 有些物质的分子吸收了一定波长的光
（辐射能），分子内电子被激发到较高
的能级以后，由于电子旋转或酸离解等
消耗一部分能量，当电子返回到低能级
状态时，重新放出较长波长的光，这就
是荧光。
? 不同物质放射的荧光光谱不同，荧光的
强度与物质的浓度有关。
? 检测方法
? 直接检测荧光性物质
? 利用非荧光物质与荧光试剂反应后检测
? 在荧光性物质溶液中加入消光物质，测定荧光
的减少
常用物质测定的荧光试剂 p183(自学）
思考题
? 生化中的光学检测方法主要有哪些?
? 分光光度法如何对物质进行定性定量?
? 旋光法如何测定光学活性物质含量 (计算 )?
? 荧光检测中蛋白质和氨基酸常用的荧光试
剂是什么?
? 利用物质所具有的各种光学性质，对物质
进行定性、定量及结构分析的技术。
? 包括：旋光检测、析光检测、荧光检测、
分光光度检测、散射光谱检测等。
? 生化领域常用：分光光度检测、旋光检测、
荧光检测
一 分光光度检测
? 又称分子吸收光谱检测，是利用物质分子
所特有的吸收光谱而对物质进行定性定量
测定的检测技术。
? 紫外分光光度检测（ 200～ 400nm）
? 可见光分光光度检测（ 400～ 760nm）
? 红外光分光光度检测（ 760～ 10000nm）
? 1 样品溶液的配备
? （ 1）对各种光有选择性吸收特性的物质
? （ 2）本身没有颜色的物质，转变为有色
的物质溶液
? 2 样品的检测
? 选择好入射光的波长，空白液调零，测
定。
? 3 待测物质的定性分析
? （ 1）将样品溶液在一定条件下（ pH、温度、
缓冲液等）测得的吸收光谱与物质的标准吸收
光谱相对照，推断样品是什么。
? （ 2）根据样品吸收光谱中峰顶与峰谷吸光度
之比值，与相当条件下资料所载的比值比较，
推断样品是什么。
? 如
? ATP,OD280/OD260=0.85,OD250/ OD260=0.90
? AMP,OD250/OD260=0.85,OD280/OD260=0.22
? (3)将分光光度检测与层析或电泳分离技术相配
合，综合判断。
? 4 待测物质的定量分析
? （ 1）标准曲线法
注意：对于存在有干扰物质的样品要进
行校正。
? （ 2） Lambert-Beer
E=KCL,K-消光系数
二 旋光检测技术
? 利用旋光计测量出 旋光物质（光学活性物质）
对偏振光旋转角度的方向（左旋或右旋）和大
小，从而进行定性与定量分析的技术，称为旋
光检测技术。
? 旋光物质对偏振光的旋转方向和角度大小是该
物质的固有特性。偏振光旋转的方向和角度称
为 旋光度。左旋（－），右旋（＋） 。
? 物质的旋光度主要取决于物质本身的结构，此
外与入射光的 波长及温度 有关，对溶液而言，
还与 溶液性质、溶液浓度和溶液厚度 有密切关
系。
? 溶剂确定后,
? α ＝ [α ]tλ LC/100
? α － 旋光度 L －溶液厚度（分米）
[α ]tλ －比旋光度，通常采用 [α ]20D
L －溶液厚度（分米）
C－溶液浓度,100mL溶液中所含物质
的克数。
? 根据物质的 [α ]20D 和实际测出的 α,可
计算得到 C= α × 100/ ([α ]tλ L)
? 操作要点,
? （ 1）样品液的配制
? （ 2）旋光度的测定
旋光法测定味精浓度
? 样品溶液配制
? 精确称取味精样品 10.00g，加 40～ 50mL蒸馏
水溶解，搅拌加入分析纯盐酸 16mL，使味精
全部溶解。冷却至室温，蒸馏水定容至 100mL。
? 旋光仪调零
? 预热 10min，放进滤光片。取 16mL分析纯盐酸
蒸馏水定容至 100mL。装满旋光管，调整零点。
? 样品液测定
? 样品洗涤旋光管三次，装满旋光管，放进样品
室，测定旋光度，记录温度。
? 计算
? C= α × 100/ ([α ]tλ L)
? [α ]tλ ＝ 32＋ 0.06× （ 20－ t)
? C味 =C× 187.13/147.13
? 味精纯度＝ C味 /样品重量
三 荧光检测技术
? 有些物质的分子吸收了一定波长的光
（辐射能），分子内电子被激发到较高
的能级以后，由于电子旋转或酸离解等
消耗一部分能量，当电子返回到低能级
状态时，重新放出较长波长的光，这就
是荧光。
? 不同物质放射的荧光光谱不同，荧光的
强度与物质的浓度有关。
? 检测方法
? 直接检测荧光性物质
? 利用非荧光物质与荧光试剂反应后检测
? 在荧光性物质溶液中加入消光物质，测定荧光
的减少
常用物质测定的荧光试剂 p183(自学）
思考题
? 生化中的光学检测方法主要有哪些?
? 分光光度法如何对物质进行定性定量?
? 旋光法如何测定光学活性物质含量 (计算 )?
? 荧光检测中蛋白质和氨基酸常用的荧光试
剂是什么?
