第六章 化学检测
? 根据物质的化学性质而对物质进行定量、
定性测定。
? 应用最早、最广泛的检测技术
? 简便、快速、操作容易
一 糖类的化学检测
? 糖类包括多糖、双糖、单糖
? 单糖和某些双糖具有游离羰基 —— 还原糖
? 多糖和蔗糖等无还原性 —— 非还原糖
? 糖类化学检测主要是利用游离羰基的还原
性质,与试剂(氧化剂)进行氧化还原反
应而进行测定的。
? 非还原糖必须转化为还原糖再进行测定
? 最常用的试剂:斐林( Fehling)试剂
? 基本组成,A,CuSO4溶液
B,NaOH和酒石酸钾钠溶

使用时 A,B等体积混合 (生成
酒石酸钾钠铜)
? 酒石酸钾钠铜是氧化剂,可与还原糖的
游离羰基发生氧化还原反应,而进行糖
的测定。
定糖常用方法
? 1 兰 —— 爱农( Lane-Eynon)法
? 次甲基蓝(亚甲基蓝、四甲基蓝)法、置换法、
直接滴定法
? 反应终点用次甲基蓝指示剂显示(还原糖滴定
斐林试剂,由于次甲基蓝氧化能力比二价铜弱,
待二价铜全部还原后,过量 1D还原糖使次甲基
蓝还原,蓝色消失)
? 多糖或其他非还原糖需转化为还原糖后再滴定
如淀粉,可用酸解或酶解
操作要点
? ( 1 )斐林试剂的标定
? ( a)标定预备试验
A,B各 5mL+ 10mL水( 250mL三角瓶中)摇匀,
加热至沸腾,+ 2D1%次甲基蓝溶液,用标准葡
萄糖液滴定至蓝色消失,耗标准葡萄糖液( 0.1
%或 0.2%) V1mL。
? ( b)标定
? A,B各 5mL+ 10mL水( 250mL三角瓶中)摇匀,
从滴定管中预先加入( V1-1)mL标准葡萄糖液,
摇匀后加热加热至沸腾,+ 2D1%次甲基蓝溶液,
用标准葡萄糖液滴定至蓝色消失(滴定在 1min
内完成),记录消耗标准葡萄糖液的总毫升数
V0
? (2) 定糖
? ( a)定糖预备试验
? A,B各 5mL+ 10mL样品糖液( 250mL三角瓶
中)摇匀,加热至沸腾,+ 2D1%次甲基蓝溶
液,用标准葡萄糖液滴定至蓝色消失,耗标准
葡萄糖液( 0.1%或 0.2%) V2mL。
? ( b)定糖
? A,B各 5mL+ 10mL样品糖液( 250mL三角瓶
中)摇匀,补加( V0-V2) mL水,并从滴定管
中预先加入( V2-1)mL标准葡萄糖液,摇匀后
加热加热至沸腾,+ 2D1%次甲基蓝溶液,用
标准葡萄糖液滴定至蓝色消失(滴定在 1min内
完成),记录消耗标准葡萄糖液的总毫升数 V
? (3) 计算
? 还原糖含量(以葡萄糖计)
=( V0-V) × c × (1/10 )× n
? 注意,
? ( a) AB分开储存,防止 Cu++变化,临用混合
? ( b)单标移液管吸液准确,外壁也需擦干净
? ( c)体积需控制在一定范围内,对 pH有影响
? ( d)煮沸时间要一致
? ( e)注意指示剂加入时间和加入量一致
? ( f)滴定速度一致(后滴定 0.5~ 1mL,1min
内完成)
? ( g)产物 Cu2O不稳定,次甲基蓝变色也不稳
定,暴露于空气或沸腾颜色变化,滴定过程不
能摇动,不可中途中止加热
? 斐林试剂快速法,
? 在斐林试剂中加入亚铁氰化钾(黄血盐)
反应终点为蓝色消失,淡黄色出现。反
应终点比兰-爱农法更为明显。
2 碘量法
? I2→ NaIO(氧化剂),其氧化能力较弱,
仅适用于醛糖的测定,与酮糖不起反应
? 操作要点,
? ( 1)标准硫代硫酸钠溶液配制,0.05
mol/L,沸腾后冷却水配制,存放在棕色
瓶中,一周后用标准重铬酸钾标定。
? ( 2)标准碘液配制,0.1mol/L
? ( 3)空白滴定:空白液,用硫代硫酸钠
滴定试剂中全部碘
? 碘量瓶中,10mL0.1mol/L碘液+ 15mL0.1
mol/LNaOH+ 5mL空白液,摇匀后暗反应 15min+
1mL1mol/L硫酸溶液,用 0.05mol/L硫代硫酸钠滴
定至浅黄色,加 0.2mL0.5%淀粉液作指示剂,滴定
至蓝色消失,记录 V0
? (4)样品滴定:以 5mL样品液代替空白液,V1
? (5) 计算,
? 醛糖含量= ( V0 - V1) C× M × n
? 注意:暗反应后需酸化再滴定,滴定时开始轻摇
(碘挥发),后再摇(淀粉吸附碘)
? 配合次甲基蓝法测定某些糖含量(如果糖)
3 铜试剂法
? 将还原糖与二价铜离子反应生成的 Cu2O
用碘氧化,再用硫代硫酸钠滴定反应液
中剩余的碘而测定样品还原糖的含量。
? ( 1)铜试剂的配制
主要提供二价铜离子及碘
? ( 2)标准曲线的制作
? ( a)标准葡萄糖液的配制
0.1%或 0.05%(根据所用铜离子试剂定)
? ( b)三角瓶编号 1 2 3 4 5 6
葡萄糖标准液( mL ) 0 1 2 3 4 5
蒸馏水( mL ) 5 4 3 2 1 0
铜试剂( mL ) 5 5 5 5 5 5
沸水浴 10min,冷却至室温
? ( c)各加入 0.5mol/L硫酸 5mL,振荡,待红色
Cu2O完全溶解后,用硫代硫酸钠滴定至终点,
记录耗用量 V
? (d) 绘标准曲线
? 葡萄糖含量( mg)为纵坐标,( V0-V)为横坐

二 蛋白质和氨基酸的化学检测
? 蛋白质含氮量几乎恒定,平均 16%
? 测出 N含量 × 6.25,即为蛋白质量
? 含氮量 每 gN相当 P
肉、蛋、豆 16% 6.25
? 面粉 17.6% 5.70
? 奶品 15.7% 6.38
? 花生 18.2% 5.50
? 鲑精蛋白 31.5% 3.17
蛋白质常用检测方法
1 定氮法(经典的,仲裁的)
常用凯氏定氮法或微量凯氏定氮法
( 1)原理
消化、蒸馏、吸收、滴定计算
( 2)操作要点
(a) 消化:凯氏定氮瓶,样品+ K2SO4-
CuSO4、浓 H2SO4,通风厨内进行,消化
液全部移入 100mL容量瓶定容。
? (b)蒸馏:防止漏气
? (c)吸收,5mL2% H3BO3+甲基红-溴甲酚绿几
滴或一定量标准酸溶液(如 25mL 0.05mol/L
H2SO4)
? (d)滴定计算,
H3BO3吸收,0.01mol/LHCl滴定至绿色 → 淡紫
红色
样品中的总氮量( mg)=( A-B)× C× 14× n
标准硫酸接收,0.1mol/L标准 NaOH滴定,甲
基红 → 黄色终点
样品中总氮量 =( C1V1-C2V2) × 14× n
? 粗蛋白含量=样品的总氮量 × 6.25
2 双缩脲试剂法测定蛋白质
? 缩脲+ CuSO4,NaOH→ 紫红色化合物
? A∝ C缩脲
? 蛋白质含有两个以上脲键,有双缩脲反应
? 蛋白质(多肽)+ CuSO4 → ( NaOH) → 铜
-钠-双缩脲络合物
? A∝ Cp,与蛋白质的分子量和氨基酸组成无关
? Tris缓冲液干扰 P的测定,测定范围 1~ 10
mg/mL
? 操作,
? ( 1)双缩脲试剂的配制
CuSO4、酒石酸钾钠,NaOH,0.1%KI
? (2) 标准曲线的制作
1%标准酪蛋白 (mL) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
蒸馏水 (mL) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0
双缩脲试剂 (mL) 4 4 4 4 4 4
室温反应 30min测 A540
? (3)样品测定 1mL+ 4mL双缩脲试剂, 30min,
测 A540
3 福林-酚试剂法测定蛋白质含量
? 双缩脲法的发展,灵敏 100倍,需时较长,
对双缩脲反应有干扰的物质对其影响更
大,酚类和柠檬酸也有干扰。
? 碱性铜试剂 —— 双缩脲反应
? 稀释的苯酚试剂 —— 与酪氨酸、色氨酸
等芳香族氨基酸反应呈蓝色
? 两种呈色反应可叠加
? 操作,
? ( 1)福林-酚试剂的配制
? 甲液:碱性铜试剂( A,NaOH,NaCO3,B、
CuSO4和酒石酸钾钠 )
? 乙液:稀释的苯酚试剂
? ( 2)标准蛋白溶液配制
? 结晶牛血清蛋白溶于 0.9% NaCl或用酪蛋白(凯
氏定氮法测定含量)
? ( 3)标准曲线制作
? ( 4)样品测定
? 1mL样品(含 P15~ 500 μ g)+ 5mL甲液,室
温 10min,+乙液 0.5mL,混匀,室温 30min,
测 A500~750
蛋白质的免疫化学检测
? 概念:免疫化学检测、抗体、抗原、凝集反应、
沉淀反应
? 检测方法,
? ( 1)凝集反应
? 效价测定,细菌、病毒分类
? ( 2)沉淀反应
? 沉淀反应、界面(环状)试验、免疫扩散、免
疫电泳、免疫亲和层析、免疫荧光检测等
氨基酸含量测定方法
? 1 茚三酮显色法
? 微酸性条件下,氨基酸茚三酮反应生成紫色化
合物,亚氨基酸(脯氨酸和羟脯氨酸)茚三酮
反应生成黄色化合物
? 取 1mL样品溶液(含氨基酸 0.1~ 50ug)加 1mL
缓冲液( pH5.0~ 6.7),再加 1mL茚三酮显色
液,100℃ 水浴 15min,自来水冷却后,加入
3mL60%乙醇溶液,测定 OD570,脯氨酸或羟
脯氨酸测 OD440
2 甲醛滴定法测定氨基酸
? 氨基酸是两性电解质,不能用一般酸碱
指示剂通过氢氧化钠来测定。
? 加进甲醛生成羟甲基衍生物,可以用碱
滴定。
? 注意:需用过量中性甲醛。
三 核酸的化学检测
? 根据核酸所含的磷及戊糖的化学性质,可用定磷
法、二苯胺法和地衣酚法等进行检测。
? 1 定磷法测定核酸含量
? ( 1)核酸的消化
? ( 2)磷的测定
定磷试剂,45 ℃ 水浴 25min,冷却至室温测 OD650
无机磷标准液作标准曲线
? ( 3)核酸含量的计算
一般 DNA含磷 9.5%,RNA含磷 9.2%,
RNA量=(总磷量-无机磷量) × 10.9
DNA量= (总磷量-无机磷量) × 10.5
2 二苯胺法测定 DNA含量
? DNA中的 2-脱氧核糖在酸性环境中与二苯胺试
剂一起加热产生蓝色反应,在 595nm处有最
大吸收峰。在 40~ 400μ g范围内,OD595与
DNA浓度成正比。少量乙醛可提高反应灵敏度。
? ( 1)二苯胺试剂的配制
? ( 2)标准曲线制作
? ( 3)样品 DNA含量测定
3 地衣酚法测定 RNA含量
? 核糖核酸在浓盐酸和三氯化铁的存在下,
与 3,5-二羟甲苯(地衣酚)反应,生
成绿色物质。一定浓度范围内,OD670
与 RNA浓度成正比。所有戊糖均可进行
此反应,注意干扰(如 DNA)。
? 操作,
地衣酚试剂配制;标准曲线制作;样品
RNA测定
思考题
? 1 如何区别还原糖与非还原糖?举出常见的还
原糖与非还原糖。
? 2 有哪些定糖方法?熟悉各种方法的原理,所
用试剂和操作要点。
? 3 如何测定薯类淀粉含量?
? 4 蛋白质含量测定有哪些方法?熟悉各种方法
的原理,所用试剂和操作要点。
? 5 如何用滴定法测定氨基酸含量?
? 7如何用定磷法测定 DNA或 RNA含量?
? 8 二苯胺测定 DNA和地衣酚测定 RNA原理?
? 9 三瓶未知液分别为蛋白质、糖和 RNA,如何
鉴定?