电泳技术
? 1 电泳：带电粒子在电场中向着与其本身电荷
相反的电极移动的过程。
? 2 电泳技术优点：快速、准确、重现性好
? 3 电泳方法分类
按电场分：常压（ <500V，适用大分子）、高
压（ >500V，适用小分子）
支持体分：自由电泳、区带电泳
仪器装置分：水平式、垂直式、悬架式
? 4 电泳条件：水溶液（缓冲液）、支持物（区
带电泳）、电场（电泳仪、电泳槽）
一 电泳的基本原理
? 电泳分离,
? 移动方向：带电性质决定
? 泳动度：带电颗粒在单位电场强度下的移动速
度。
μ ＝ v/E=(d/t)/(V/l)=(dl)/Vt
? 影响 μ的因素,
? 1颗粒本身：带电、大小、形状
? 2 外界因素：电场强度 E,pH、离子强度 I,电
渗,缓冲液粘度及温度等。
二 纸电泳
? 以滤纸为支持体的电泳技术
? 操作要点,
? 1 选择缓冲液
? 对显色剂和紫外光吸收等观察区带的方法无影
响
? A 分离蛋白质,pI≈ 5，选 pH8.6的缓冲液
（巴比妥缓冲液 pH8.6、硼酸 pH8.6、磷酸
pH7.4)
? B 分离氨基酸：邻苯二甲酸氢钠、磷酸 — 醋
酸,pH5.9
? C 分离核苷酸巴比妥－醋酸 pH2.5，柠檬酸
pH2~3
? D 分离糖类,HAC-NaAC,pH3~5
? 2 滤纸的选择与处理
? 层析用滤纸，纸宽 2～ 3cm/样品组分，长短影响电场
强度。
? 3 点样
点圆点（量少）、点条状（一般），点中间（未知样
品）、点一边（已知样品）
干法、湿法
? 4 电泳
电桥水平、加盖、电压稳定、注意时间
? 5 显色及分析
蛋白：溴酚兰、氨黑 10B、偶氮胭脂红 B
Aa：茚三酮、靛红
核酸：紫外光下观察
? 一般洗脱定量
三 薄膜电泳
? 支持体：薄膜
? 优点：分辨力较高、简便、快速、区带清晰、
易于定量、便于保存
? 广泛应用于蛋白质和同工酶等的分离分析
? 操作
? 1 薄膜的处理与放置
? 2 点样
平衡
? 3 电泳,E 10~25V/cm,0.5～ 2h
? 4 显色
四 薄层电泳
? 将支持物与缓冲液调制成适当厚度的薄层进行
电泳。
? 常用支持物：淀粉、琼脂、纤维素粉、硅胶等
? 操作,
? 1 缓冲液选择
? 离子强度较高的缓冲液
? 2 支持物处理
? 精制品
? 3 薄层板制作
? 4加样：挖沟、混合样品、填埋
? 5 电泳
? 6分析：印染法
五 凝胶电泳
? 支持物：多孔凝胶
? 聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶等
? 具有电泳和分子筛的双重作用，分辨力高
? 最常用聚丙烯酰胺凝胶，原因,
? 机械强度好，透明有弹性，稳定，无吸附作用
和电渗作用，可制成不同孔径的凝胶。
? 分类：垂直管型盘状电泳、垂直板型电泳；
? 连续、不连续、梯度,SDS凝胶电泳
? 1 聚丙烯酰胺凝胶的制备
? 丙稀酰胺（单体）＋ N,N-甲叉双丙稀酰胺
（交联剂） → （催化剂） → 聚合
? 催化剂,
? （ 1）过硫酸铵＋四甲基乙二胺（ TEMED）
? （ 2）核黄素（ VitB2）＋光
? 改变单体浓度可改变凝胶孔径
? 交联剂对孔径有影响,5％最小
? 根据要分离物质的相对分子质量选择合适
的单体浓度。
? 2 不连续电泳中样品压缩成层的原理
? 不连续电泳含两层或三层不同孔径的凝
胶，用不同 pH值的缓冲液,
? 样品胶：大孔径,pH6.7～ 6.8Tris-HCl缓
冲液
? 浓缩胶：与样品胶相同
? 分离胶：小孔径,pH8.8～ 8.9 Tris-HCl
缓冲液
? 样品压缩成层原理,
? 电极缓冲液,pH8.3Tris-甘氨酸
? HCl→ ( 解离） → Cl －, Cl － 泳动速度最快（快离子）
? CH2(NH2)COOH → ( 样品胶、浓缩胶 pH6.7~6.8） →
CH2(NH2)COO－ （ 0.1％～ 1.0％）泳动速度最慢（慢
离子）
? 蛋白质（ P）泳动速度介于快慢离子之间
? 电泳时,Cl － 超过 P走在最前面，其后形成一个 离子
浓度较低的低电导区 → 较高电位梯度 → P和慢离子加
速移动 → P压缩成层
? 样品进入分离胶后,pH为 9.5（电泳过程实测）,
CH2(NH2)COO－ 增加，泳动速度增大，很快超过 P,P
在均一的电位梯度和 pH条件下分离
SDS-凝胶电泳原理
? 聚丙烯酰胺凝胶系统中加入 SDS,P电泳迁移
率取决于其分子量，而与形状及所带电荷无关。
? 加入 SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇使 P二硫键
还原,SDS使氢键、疏水键打开，并结合到 P
分子上，形成 P-SDS，带上相同密度负电荷，
形状为长椭圆形，短轴一定，长轴长度正比于
P分子量。
? 分离测定,
? 测分子量（与标准蛋白比较）
? 鉴定样品纯度（条带数目）
? 测定样品 P含量：扫描定量（比色）
凝胶电泳的操作要点
? 1 凝胶制备
? 2 电极缓冲液
? 3 样品处理及加样
? 4 电泳
? 5 染色与固定
? 6 脱色
? 7 分析
烟曲霉菌中抗真菌活性肽类物质的分离与纯化
六 等电点聚焦电泳
? 电泳系统中加进两性电解质载体，当通已直流
电时，两性电解质载体即形成一个 由阳极到阴
极连续增高的 pH梯度 。 P进入时，不同的 P移
动到与其等电点相当的 pH位置上，从而使不
同等电点的 P得以分离。
? 优点：分辨率高，区带清晰、窄，加样部位自
由，重现性好，可测定 P或多肽的等电点。
? 缺点：需无盐溶液，不适用于在等电点不溶解
或发生变性的 P。
? 1 稳定的 pH梯度的形成
? 2 两性电解质载体
要求,
由多乙烯多胺与丙烯酸加成制备（有不同 pH
范围的商品两性电解质载体）
? 3 支持 pH梯度的介质
密度梯度溶液（用于自由电泳）
凝胶（如聚丙烯酰胺凝胶）
? 4 操作要点
pH梯度支持介质的制备
聚焦电泳
检测
两性电解质载体的除去
电泳技术思考题
? 1名词解释
电泳、电泳分离技术、泳动度、电渗、区带电
泳、相对迁移率、不连续凝胶电泳
? 2 影响泳动度的主要因素有哪些？
? 3 区带电泳的操作步骤一般有哪些？
? 4 如何制备聚丙烯酰胺凝胶？
? 5 不连续电泳样品压缩成层原理。
? 6 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。
? 7 采用电泳技术如何测定蛋白质分子量？如何
测定蛋白质等电点？
? 1 电泳：带电粒子在电场中向着与其本身电荷
相反的电极移动的过程。
? 2 电泳技术优点：快速、准确、重现性好
? 3 电泳方法分类
按电场分：常压（ <500V，适用大分子）、高
压（ >500V，适用小分子）
支持体分：自由电泳、区带电泳
仪器装置分：水平式、垂直式、悬架式
? 4 电泳条件：水溶液（缓冲液）、支持物（区
带电泳）、电场（电泳仪、电泳槽）
一 电泳的基本原理
? 电泳分离,
? 移动方向：带电性质决定
? 泳动度：带电颗粒在单位电场强度下的移动速
度。
μ ＝ v/E=(d/t)/(V/l)=(dl)/Vt
? 影响 μ的因素,
? 1颗粒本身：带电、大小、形状
? 2 外界因素：电场强度 E,pH、离子强度 I,电
渗,缓冲液粘度及温度等。
二 纸电泳
? 以滤纸为支持体的电泳技术
? 操作要点,
? 1 选择缓冲液
? 对显色剂和紫外光吸收等观察区带的方法无影
响
? A 分离蛋白质,pI≈ 5，选 pH8.6的缓冲液
（巴比妥缓冲液 pH8.6、硼酸 pH8.6、磷酸
pH7.4)
? B 分离氨基酸：邻苯二甲酸氢钠、磷酸 — 醋
酸,pH5.9
? C 分离核苷酸巴比妥－醋酸 pH2.5，柠檬酸
pH2~3
? D 分离糖类,HAC-NaAC,pH3~5
? 2 滤纸的选择与处理
? 层析用滤纸，纸宽 2～ 3cm/样品组分，长短影响电场
强度。
? 3 点样
点圆点（量少）、点条状（一般），点中间（未知样
品）、点一边（已知样品）
干法、湿法
? 4 电泳
电桥水平、加盖、电压稳定、注意时间
? 5 显色及分析
蛋白：溴酚兰、氨黑 10B、偶氮胭脂红 B
Aa：茚三酮、靛红
核酸：紫外光下观察
? 一般洗脱定量
三 薄膜电泳
? 支持体：薄膜
? 优点：分辨力较高、简便、快速、区带清晰、
易于定量、便于保存
? 广泛应用于蛋白质和同工酶等的分离分析
? 操作
? 1 薄膜的处理与放置
? 2 点样
平衡
? 3 电泳,E 10~25V/cm,0.5～ 2h
? 4 显色
四 薄层电泳
? 将支持物与缓冲液调制成适当厚度的薄层进行
电泳。
? 常用支持物：淀粉、琼脂、纤维素粉、硅胶等
? 操作,
? 1 缓冲液选择
? 离子强度较高的缓冲液
? 2 支持物处理
? 精制品
? 3 薄层板制作
? 4加样：挖沟、混合样品、填埋
? 5 电泳
? 6分析：印染法
五 凝胶电泳
? 支持物：多孔凝胶
? 聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶等
? 具有电泳和分子筛的双重作用，分辨力高
? 最常用聚丙烯酰胺凝胶，原因,
? 机械强度好，透明有弹性，稳定，无吸附作用
和电渗作用，可制成不同孔径的凝胶。
? 分类：垂直管型盘状电泳、垂直板型电泳；
? 连续、不连续、梯度,SDS凝胶电泳
? 1 聚丙烯酰胺凝胶的制备
? 丙稀酰胺（单体）＋ N,N-甲叉双丙稀酰胺
（交联剂） → （催化剂） → 聚合
? 催化剂,
? （ 1）过硫酸铵＋四甲基乙二胺（ TEMED）
? （ 2）核黄素（ VitB2）＋光
? 改变单体浓度可改变凝胶孔径
? 交联剂对孔径有影响,5％最小
? 根据要分离物质的相对分子质量选择合适
的单体浓度。
? 2 不连续电泳中样品压缩成层的原理
? 不连续电泳含两层或三层不同孔径的凝
胶，用不同 pH值的缓冲液,
? 样品胶：大孔径,pH6.7～ 6.8Tris-HCl缓
冲液
? 浓缩胶：与样品胶相同
? 分离胶：小孔径,pH8.8～ 8.9 Tris-HCl
缓冲液
? 样品压缩成层原理,
? 电极缓冲液,pH8.3Tris-甘氨酸
? HCl→ ( 解离） → Cl －, Cl － 泳动速度最快（快离子）
? CH2(NH2)COOH → ( 样品胶、浓缩胶 pH6.7~6.8） →
CH2(NH2)COO－ （ 0.1％～ 1.0％）泳动速度最慢（慢
离子）
? 蛋白质（ P）泳动速度介于快慢离子之间
? 电泳时,Cl － 超过 P走在最前面，其后形成一个 离子
浓度较低的低电导区 → 较高电位梯度 → P和慢离子加
速移动 → P压缩成层
? 样品进入分离胶后,pH为 9.5（电泳过程实测）,
CH2(NH2)COO－ 增加，泳动速度增大，很快超过 P,P
在均一的电位梯度和 pH条件下分离
SDS-凝胶电泳原理
? 聚丙烯酰胺凝胶系统中加入 SDS,P电泳迁移
率取决于其分子量，而与形状及所带电荷无关。
? 加入 SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇使 P二硫键
还原,SDS使氢键、疏水键打开，并结合到 P
分子上，形成 P-SDS，带上相同密度负电荷，
形状为长椭圆形，短轴一定，长轴长度正比于
P分子量。
? 分离测定,
? 测分子量（与标准蛋白比较）
? 鉴定样品纯度（条带数目）
? 测定样品 P含量：扫描定量（比色）
凝胶电泳的操作要点
? 1 凝胶制备
? 2 电极缓冲液
? 3 样品处理及加样
? 4 电泳
? 5 染色与固定
? 6 脱色
? 7 分析
烟曲霉菌中抗真菌活性肽类物质的分离与纯化
六 等电点聚焦电泳
? 电泳系统中加进两性电解质载体，当通已直流
电时，两性电解质载体即形成一个 由阳极到阴
极连续增高的 pH梯度 。 P进入时，不同的 P移
动到与其等电点相当的 pH位置上，从而使不
同等电点的 P得以分离。
? 优点：分辨率高，区带清晰、窄，加样部位自
由，重现性好，可测定 P或多肽的等电点。
? 缺点：需无盐溶液，不适用于在等电点不溶解
或发生变性的 P。
? 1 稳定的 pH梯度的形成
? 2 两性电解质载体
要求,
由多乙烯多胺与丙烯酸加成制备（有不同 pH
范围的商品两性电解质载体）
? 3 支持 pH梯度的介质
密度梯度溶液（用于自由电泳）
凝胶（如聚丙烯酰胺凝胶）
? 4 操作要点
pH梯度支持介质的制备
聚焦电泳
检测
两性电解质载体的除去
电泳技术思考题
? 1名词解释
电泳、电泳分离技术、泳动度、电渗、区带电
泳、相对迁移率、不连续凝胶电泳
? 2 影响泳动度的主要因素有哪些？
? 3 区带电泳的操作步骤一般有哪些？
? 4 如何制备聚丙烯酰胺凝胶？
? 5 不连续电泳样品压缩成层原理。
? 6 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。
? 7 采用电泳技术如何测定蛋白质分子量？如何
测定蛋白质等电点？
