第七章
动物基因工程
第一节 基因工程概述
基因工程 (Genetic engineering)是一种 DNA重组技术, 它
是在分子水平上进行的遗传操作, 即把供体细胞中的
基因或基因组提取出来, 按照预先设计的蓝图, 经过
体外加工重组, 或者把人工合成的基因转移到受体细
胞并获得新的遗传特性的技术 。 由于被转移的基因必
须与载体 DNA重组后才能实现转移, 所以基因工程也
叫做重组 DNA技术 。
基因工程的基本操作程序包括,(1) 目的基因的分离或合
成； (2)用工具酶对目的基因和载体 （ Vector） 进行加
工处理, 把目的基因与载体结合成重组 DNA分子； (3)
把重组 DNA分子引入受体细胞, 并使目的基因和载体
上其他基因得以表达； （ 4） 转化体细胞的扩增； （ 5）
重组体细胞的鉴定与筛选 。
? 基因克隆示意图
目的基因
载体 DNA
( 限制性内切酶切开 )
重组体
宿主细胞
已转化的宿主细胞
繁殖
阳性克隆株
表达
第二节 工具酶
限制性核酸内切酶 切割 DNA
DNA连接酶 生成 3′- 5′磷酸二酯键
DNA聚合酶 Ⅰ 探针标记、补平 3′末端
反转录酶 cDNA合成
多聚核苷酸激酶 5′磷酸化、探针标记
末端转移酶 3′末端多聚尾
碱性磷酸酶 切除末端磷酸基
常用的工具酶
限制性核酸内切酶
细菌限制修饰体系
限制性核酸内切酶 甲基化酶
识别特异的位点 — 酶切位点
回文结构 4～ 6 bp
出现两种末端
粘性末端 粘端
平头末端 平端
配伍末端
G A A T T C
C T T A A G
E c o R Ⅰ
C C C G G G
G G G C C C
S m a l Ⅰ
二,DNA聚合酶
（ 一 ） DNA聚合酶 I (全酶 ) (E,coli DNA Polymease)
（ 二 ） K1enow片段 (E.co1i)
（ 三 ） T4 DNA聚合酶 (T4噬茵体感染的 E,co1i)
（ 四 ） Taq DNA聚合酶 (Thermusaqraticus)
（ 五 ） 逆转录酶 （ reverse transcriptase）
（ 六 ） 末端转移酶
三,DNA连接酶
在大肠杆菌和动物细胞中都发现了 DNA连接酶, 这种酶能够催
化 DNA中相邻的 3’一 OH和 5’一磷酸基末端之间形成磷酸二酯键 。
连接反应的最适温度是 37℃, 但在此温度下粘性末端之间氢键结
合很不稳定 。 实验表明, 15℃ 对于连接反应和粘性末端氢键结合
的稳定性都是合适的 。
四,甲基化酶
细胞的限制一修饰系统中的修饰作用是由甲基化酶 (methylase)
米完成的。甲基化酶同限制性内切酶具有完全相同的识别顺序。
甲基化酶使识别顺序中的某个碱基发生甲基化，保护 DNA不被限
制性内切酶切开。真核生物中目前只发现 5甲基胞嘧啶 (M5C)。
五、核酸酶
（一）核酸酶 S1 (Nuclease S1)
核酸酶 S1主要用于,(1)分析 DNA,RNA杂交体结构。通过降解成熟
mRNA与放射性标记基因组,DNA的杂交体确定内含子部位。 (2)切除
DNA片段上的单链末端，形成平末端。 (3)切开 cDNA合成过程中形成的
发夹环。 (4)在限制酶位点上产生小缺失。
(二 )核酸外切酶 III
（ 三 ） 核酸外切酶 VII
（四） DNA酶 I
（五） RNA酶 A (牛胰 )
（六） RNA酶 TI
（七） RNA酶 H
第三节基因工程的载体
（ Vector）
? 到目前为止, 用于基因工程的载体有 8类,
? ① 细菌质粒载体；包括大肠杆菌和枯草杆菌质粒载体 。
? ② λ噬菌体衍生载体 。
? ③ 柯斯质粒 (Cosmid)载体：一种由质粒和 A噬菌体 cos尾巴构建
? 的复合载体 。
? ④ 噬菌体 M13衍生载体一类专门用于 Sanger法测序的载体 。
? ⑤ Phag9m5d载体：一类由噬菌体功能片段和质粒构建的复合
? 载体 。
? ⑥ 酵母质粒载体：由酵母 2u质粒构建的酵母基因工程载体 。
? ⑦ 真核病毒载体：包括动物病毒, 植物病毒衍生载体 。
? ⑧ 杆状病毒和 Bacmid载体；
作为基因工程的载体它们都具备以下一些
共同的基本特点,
作为基因工程的载体它们都具备以下一些共同
的基本特点,
① 在宿主细胞中能独立自主地复制 。
② 表达载体含有强启动于, 能驱动靶基因在宿
主细胞中表达 。
③ 容易从宿主细胞中分离纯化 。
④ 载体 DNA基因组中有一段不影响它们复制
的非必需区域, 插在其中的靶片段能被动地
跟着载体 DNA一起复制, 就像载体的正常成
分一样 。
一、质粒载体 (plasmid vector)
（ 1） 质粒的一般性质
1,质粒的概念 质粒是细菌细胞染色体外存在
于细胞质中能进行自我复制的一类小型 DNA分
子, 大部分质粒为双链环状 。
2,质粒的大小
3,质粒的拷贝数
4,质粒的不亲和性
5,质粒的宿主范围
质粒 — 存在于细菌染色体外的小型环状双
链 DNA分子
理想的质粒
1.拷贝数多 ;
2.两三个抗药性基因 terr ampr
筛选标志
3.合适的限制性内切酶酶切位点（单一）
p B R 3 2 2
E c o R Ⅰ
Hi n d Ⅲ
B a m H Ⅰ
Av a Ⅰ
P v u Ⅱ
S a l Ⅰ
P s t Ⅰ
O r i
氨苄青霉素
抗性基因
四环素
抗性基因
（二） ?噬菌体载体 (? Phage
vector)
?噬菌体是一种温和噬菌体, 由于它的遗
传结构和宿主大肠杆菌的遗传结构研究得比较
清楚, 并能在细菌中大量繁殖, 所以成为广泛
采用的载体 。 ?噬菌体还有一大优点, 即使它
的 DNA丢失 25％ 仍不失活, 这部分丢失的空档
正好可以装载外源 DNA。
? 与质粒载体相比, λ 噬菌体作为载体可以克隆
更大一些的 DNA片段, 欲构件一个基因文库,
往往可以减少文库中克隆的数量 。
（三）柯斯质粒载体（ Cosmid
vector）
柯斯质粒载体又叫粘粒载体，这是
一种由人工构建的含有 DNA的 cos序列和
质粒复制子的特殊类型的质粒载体。柯
斯质粒在结构组成上具有 ?噬菌体的特性、
也具有质粒载体的特性和高容量的克隆
能力，一般可插入 35～ 40kb的外源基因，
这是构建真核生物基因文库的主要载体。
柯斯质粒适用于作基因簇和大基因的克
隆。
（四） YAC载体
YAC 是酵母人工染色体 （ Yeast artificial
chromosome） 的缩写, 是目前能容纳最大外源 DNA片段
的载体 。 简单地说, 酵母人工染色体载体有两个臂,
之间有着丝粒, 每个臂的末端有一个端粒, 另外, 染
色体上还有供选择的标记基因；当外源 DNA片段连接进
两个臂中以后, 通过选择标记人们可以从酵母宿主细
胞中筛选出重组的人工染色体 。
实验结果证明, 每个 YAC都可以装进 100万碱基以上
的 DNA片段, 这种大小比柯斯质粒的装载能力要大数倍,
所以可以保证基因结构的完整性 。
(五 ) 动物病毒
动物病毒作为载体可用于外源基因向真核细胞的
转入 。 作为基因介导的动物 DNA载体, 必须具备以下
条件,(1)具有动物病毒的复制起始部位及启动子, 以
便外源基因能有效的转染动物细胞, 以及提供必要的
转录信号,(2)具有可供选择的标志基因, 因为重建的
病毒转染力很低, 一般仅为 105～ 107,只有利用标志
基因才能选出转化细胞株； (3)具有适当的多种单一内
切酶位点供外源基因插入 。
目前常用的基因转移载体有,(1)猴空泡病毒
(Simian virus 40简称 SV40)； (2)腺病毒 (Adenovirus)；
(3) 乳头 状病毒 (Papilloma virus) ； (4) 逆 转录病 毒
(Retrovirus); (5) 牛痘 (Vaccinia)病毒 ; (6) 牛疣病毒
(Bovine papilloma virus)等 。
三、获得目的基因的方法
(一 )利用理化方法分离基因
理化方法分离基因是依据 DNA双链结构
的特点和四种碱基互补的氢键差异, 其
方法有以下四种,
1,密度梯度超速离心法
2,单链酶法
3,多聚赖氨酸法
4,分子杂交法
(二 )利用生物学方法分离基因
利用噬菌体转染或质粒转化等微生物学技
术分离基因的方法, 我们把它叫做生物学方法 。
这种方法应用于原核基因的分离提取 。
用 适 当 的 限 制 性 内 切 酶 (Restriction
endonuclease )将整个染色体或 DNA分子切成
许多相当于一个或略大于一个基因的片段, 然
后把全部 DNA片段与质粒组成重组 DNA分子, 并
转化到某特定基因营养缺陷型受体菌内, 进行
纯系繁殖, 再经分离鉴定, 选出所需基因 。
(三 )基因的人工合成
1,化学合成法
2,逆转录法 (Reverse transcription)
逆转录法也叫 cDNA法，它是一种酶促合
成法，即以 mRNA为模板，在反转录酶的
作用下，以四种脱氧核苷三磷酸为材料
合成 DNA(cDNA)，再经复制后即成双链
DNA。
3,聚合酶链式反应 (PCR)
四、重组 DNA分子
1,粘性末端连接 连接效率高
相同酶切末端
配伍末端
2.平端连接 连接效率低
3.同聚物接尾法
4.人工接头法
目的基因载体 DNA
+d G T P
+d C T P
P o ly G
P o ly C
3′
3′
3′
3′
五、基因的转移 (Gene transfer)
? (一 )、重组 DNA向细菌细胞转入
? 把以质粒为载体的重组 DNA分子引入受体细胞
的过程叫做转化 (Transformation)；把以噬菌
体或病毒为载体的重组 DNA分子引入受体细胞
的过程叫做转染 (Transfetion)。
? 对细菌细胞进行转化或转染的关键是细胞处在
感受态, 所谓感受态细胞, 就是受体细胞处于
摄入外源 DNA的状态 。 一般用 0.01～ 0.05 M/L
氯化钙处理受体细胞, 可以引起细胞膨胀, 增
大细胞的通透性, 使重组 DNA进入细胞, 提高
转化效率 。
转导作用 transduction
病毒、噬菌体介导
溶菌途径
溶原菌途径
裂解
溶原
(二 )、外源目的基因向真核细
胞转入
向真核细胞中转移基因的方法可分为
两大类, — 类需借助于载体, 另 — 类不
需借助于载体 。
1,借助于载体的基因转移
2,不需载体的基因转移
① 磷酸钙沉淀法
② 脂质体介导法
③ 血影细胞 (Blood shadow cell)介导法
六、转化细胞的筛选与鉴定
? 转化或转染的效率是很低的 (一般为 105～
106)，也就是说，只有极少数细胞接受到
重组 DNA分子，能实现基因的转移。所
以必须从大量的培养细胞中筛选出已被
外源 DNA转化了的细胞，然后建立无性
繁殖系，使所需基因大量扩增和表达。
重组体的筛选 screening/selection
1,直接选择法
抗药性标志选择
标志补救 表达产物与营养缺陷互补
α— 互补 蓝白斑筛选
分子杂交 探针
原位杂交 /Southern印迹法
限制性酶切图谱 /PCR
2.非直接选择法 免疫学方法
七 克隆基因的表达
载体有转录、翻译的元件
密码子通用
1, 原核表达体系
原核表达载体的标准
? 合适的筛选标志
? 强启动子
? 翻译控制序列
? 多克隆位点
融合蛋白 包涵体
大肠杆菌表达体系的不足
1,缺乏转录后加工机制，只能表达
cDNA
2,缺乏翻译后加工机制，不能折叠和糖
基化
3,融合蛋白形成包涵体，复性后才有活
性
4,很难表达大量的可容性蛋白
2 真核表达体系
筛选标志 Neor G418
转染方法
磷酸钙沉淀
DEAE葡聚糖介导转染
电穿孔
脂质体转染
显微注射
瞬时转染 目的基因不整合进宿主基因组
稳定转染 目的基因整合进宿主基因组
第三节 转基因动物技术
一、转基因动物的概念
转基因技术是将外源 DNA导入细胞的一种技
术 。 它是在 DNA重组技术的基础上发展起来的 。
1981年 Gordon 和 Ruddle首次用显微注射法
(Microinjection)把外源基因导入小鼠受精卵的
雄核, 并将注射后的受精卵植入假孕母鼠子宫,
产生了的 78只小鼠, 其中有 2只的所有细胞中
(包括生殖细胞 )都含有外源基因, 但因缺乏启
动子而不能表达, 他们把出生后带外源基因的
小鼠叫做转基因小鼠 (Transgenic Mice),自此
以后, 凡带有外源基因的动物都叫做转基因动
物 (Transgenic animal)。
二、转基因动物技术的一般步骤
(1)选择能有效表达的蛋白质；
(2)克隆与分离编码这些蛋白质的基因；
(3)选择能与所需组织特异性表达方式相适应的基
因调节序列；
(4)把调节序列与结构基因重组拼接，并在培养细
胞或小鼠中预先检验其表达情况；
(5)把拼接的基因注射到受精卵的细胞核中；
(6)把注射后的受精卵移植到子宫，完成胚胎发
(7) 检测幼畜是否整合外源基因、外源基因的表达
情况以及外源基因在其后代中的传递情况。
三、导入基因的方法
导入外源基因的方法有多种，一些方
法已在上一节作过叙述，如：①反转录
病毒转染法；②磷酸钙沉淀法；③脂质
体介导法；④血影细胞 (Blood shadow
cell)介导法。在此再介绍一些方法,1）
DNA微注射法； 2）精子载体法； 3)胚胎
干细胞（ ES）介导法； 4) 染色体片段注
入法； 5) 电转移法等。在转基因动物中，
DNA微注射法比较常用。
四、基因的选择与转基因动物
的研究现状
(一 ) 转入基因的选择
(二 ) 转基因动物的研究意义
1,提高动物生长, 生产性能的研究
2,改变奶蛋白成分和性质的设想
3．利用家畜产品生产药物蛋白的研究
第四节 动物克隆技术
一、动物克隆的概念
所谓克隆 (Cloning)就是无性繁殖，
动物克隆 (Animal cloning)就是不经过
受精过程而获得动物新个体的方法。克
隆动物 (cloning animal)就是指不经过生
殖细胞而直接由体细胞获得新的动物个
体。
二、克隆动物的一般步骤
送入子宫，完成胚胎发育
克隆的动物
三、克隆动物的意义与前景
1,可以用于动物资源的种质保存, 可尽可能多
地保存地球生物圈内的多样性；
2,可以生产移植器官, 利用动物作生物反应器
生产药物和提供实验动物, 造福人类 。 还可
以对人类的某些顽症实施, 细胞治疗, 。
3,可以克隆家畜和濒临灭绝的动物, 如大熊猫
等 。
4,利用哺乳动物体细胞克隆技术, 可通过建立
转基因体细胞系的方式, 克隆转基因动物 。
5,体细胞克隆技术可以直接把优良物种特性传
递下去, 培育优良物种 。
动物基因工程
第一节 基因工程概述
基因工程 (Genetic engineering)是一种 DNA重组技术, 它
是在分子水平上进行的遗传操作, 即把供体细胞中的
基因或基因组提取出来, 按照预先设计的蓝图, 经过
体外加工重组, 或者把人工合成的基因转移到受体细
胞并获得新的遗传特性的技术 。 由于被转移的基因必
须与载体 DNA重组后才能实现转移, 所以基因工程也
叫做重组 DNA技术 。
基因工程的基本操作程序包括,(1) 目的基因的分离或合
成； (2)用工具酶对目的基因和载体 （ Vector） 进行加
工处理, 把目的基因与载体结合成重组 DNA分子； (3)
把重组 DNA分子引入受体细胞, 并使目的基因和载体
上其他基因得以表达； （ 4） 转化体细胞的扩增； （ 5）
重组体细胞的鉴定与筛选 。
? 基因克隆示意图
目的基因
载体 DNA
( 限制性内切酶切开 )
重组体
宿主细胞
已转化的宿主细胞
繁殖
阳性克隆株
表达
第二节 工具酶
限制性核酸内切酶 切割 DNA
DNA连接酶 生成 3′- 5′磷酸二酯键
DNA聚合酶 Ⅰ 探针标记、补平 3′末端
反转录酶 cDNA合成
多聚核苷酸激酶 5′磷酸化、探针标记
末端转移酶 3′末端多聚尾
碱性磷酸酶 切除末端磷酸基
常用的工具酶
限制性核酸内切酶
细菌限制修饰体系
限制性核酸内切酶 甲基化酶
识别特异的位点 — 酶切位点
回文结构 4～ 6 bp
出现两种末端
粘性末端 粘端
平头末端 平端
配伍末端
G A A T T C
C T T A A G
E c o R Ⅰ
C C C G G G
G G G C C C
S m a l Ⅰ
二,DNA聚合酶
（ 一 ） DNA聚合酶 I (全酶 ) (E,coli DNA Polymease)
（ 二 ） K1enow片段 (E.co1i)
（ 三 ） T4 DNA聚合酶 (T4噬茵体感染的 E,co1i)
（ 四 ） Taq DNA聚合酶 (Thermusaqraticus)
（ 五 ） 逆转录酶 （ reverse transcriptase）
（ 六 ） 末端转移酶
三,DNA连接酶
在大肠杆菌和动物细胞中都发现了 DNA连接酶, 这种酶能够催
化 DNA中相邻的 3’一 OH和 5’一磷酸基末端之间形成磷酸二酯键 。
连接反应的最适温度是 37℃, 但在此温度下粘性末端之间氢键结
合很不稳定 。 实验表明, 15℃ 对于连接反应和粘性末端氢键结合
的稳定性都是合适的 。
四,甲基化酶
细胞的限制一修饰系统中的修饰作用是由甲基化酶 (methylase)
米完成的。甲基化酶同限制性内切酶具有完全相同的识别顺序。
甲基化酶使识别顺序中的某个碱基发生甲基化，保护 DNA不被限
制性内切酶切开。真核生物中目前只发现 5甲基胞嘧啶 (M5C)。
五、核酸酶
（一）核酸酶 S1 (Nuclease S1)
核酸酶 S1主要用于,(1)分析 DNA,RNA杂交体结构。通过降解成熟
mRNA与放射性标记基因组,DNA的杂交体确定内含子部位。 (2)切除
DNA片段上的单链末端，形成平末端。 (3)切开 cDNA合成过程中形成的
发夹环。 (4)在限制酶位点上产生小缺失。
(二 )核酸外切酶 III
（ 三 ） 核酸外切酶 VII
（四） DNA酶 I
（五） RNA酶 A (牛胰 )
（六） RNA酶 TI
（七） RNA酶 H
第三节基因工程的载体
（ Vector）
? 到目前为止, 用于基因工程的载体有 8类,
? ① 细菌质粒载体；包括大肠杆菌和枯草杆菌质粒载体 。
? ② λ噬菌体衍生载体 。
? ③ 柯斯质粒 (Cosmid)载体：一种由质粒和 A噬菌体 cos尾巴构建
? 的复合载体 。
? ④ 噬菌体 M13衍生载体一类专门用于 Sanger法测序的载体 。
? ⑤ Phag9m5d载体：一类由噬菌体功能片段和质粒构建的复合
? 载体 。
? ⑥ 酵母质粒载体：由酵母 2u质粒构建的酵母基因工程载体 。
? ⑦ 真核病毒载体：包括动物病毒, 植物病毒衍生载体 。
? ⑧ 杆状病毒和 Bacmid载体；
作为基因工程的载体它们都具备以下一些
共同的基本特点,
作为基因工程的载体它们都具备以下一些共同
的基本特点,
① 在宿主细胞中能独立自主地复制 。
② 表达载体含有强启动于, 能驱动靶基因在宿
主细胞中表达 。
③ 容易从宿主细胞中分离纯化 。
④ 载体 DNA基因组中有一段不影响它们复制
的非必需区域, 插在其中的靶片段能被动地
跟着载体 DNA一起复制, 就像载体的正常成
分一样 。
一、质粒载体 (plasmid vector)
（ 1） 质粒的一般性质
1,质粒的概念 质粒是细菌细胞染色体外存在
于细胞质中能进行自我复制的一类小型 DNA分
子, 大部分质粒为双链环状 。
2,质粒的大小
3,质粒的拷贝数
4,质粒的不亲和性
5,质粒的宿主范围
质粒 — 存在于细菌染色体外的小型环状双
链 DNA分子
理想的质粒
1.拷贝数多 ;
2.两三个抗药性基因 terr ampr
筛选标志
3.合适的限制性内切酶酶切位点（单一）
p B R 3 2 2
E c o R Ⅰ
Hi n d Ⅲ
B a m H Ⅰ
Av a Ⅰ
P v u Ⅱ
S a l Ⅰ
P s t Ⅰ
O r i
氨苄青霉素
抗性基因
四环素
抗性基因
（二） ?噬菌体载体 (? Phage
vector)
?噬菌体是一种温和噬菌体, 由于它的遗
传结构和宿主大肠杆菌的遗传结构研究得比较
清楚, 并能在细菌中大量繁殖, 所以成为广泛
采用的载体 。 ?噬菌体还有一大优点, 即使它
的 DNA丢失 25％ 仍不失活, 这部分丢失的空档
正好可以装载外源 DNA。
? 与质粒载体相比, λ 噬菌体作为载体可以克隆
更大一些的 DNA片段, 欲构件一个基因文库,
往往可以减少文库中克隆的数量 。
（三）柯斯质粒载体（ Cosmid
vector）
柯斯质粒载体又叫粘粒载体，这是
一种由人工构建的含有 DNA的 cos序列和
质粒复制子的特殊类型的质粒载体。柯
斯质粒在结构组成上具有 ?噬菌体的特性、
也具有质粒载体的特性和高容量的克隆
能力，一般可插入 35～ 40kb的外源基因，
这是构建真核生物基因文库的主要载体。
柯斯质粒适用于作基因簇和大基因的克
隆。
（四） YAC载体
YAC 是酵母人工染色体 （ Yeast artificial
chromosome） 的缩写, 是目前能容纳最大外源 DNA片段
的载体 。 简单地说, 酵母人工染色体载体有两个臂,
之间有着丝粒, 每个臂的末端有一个端粒, 另外, 染
色体上还有供选择的标记基因；当外源 DNA片段连接进
两个臂中以后, 通过选择标记人们可以从酵母宿主细
胞中筛选出重组的人工染色体 。
实验结果证明, 每个 YAC都可以装进 100万碱基以上
的 DNA片段, 这种大小比柯斯质粒的装载能力要大数倍,
所以可以保证基因结构的完整性 。
(五 ) 动物病毒
动物病毒作为载体可用于外源基因向真核细胞的
转入 。 作为基因介导的动物 DNA载体, 必须具备以下
条件,(1)具有动物病毒的复制起始部位及启动子, 以
便外源基因能有效的转染动物细胞, 以及提供必要的
转录信号,(2)具有可供选择的标志基因, 因为重建的
病毒转染力很低, 一般仅为 105～ 107,只有利用标志
基因才能选出转化细胞株； (3)具有适当的多种单一内
切酶位点供外源基因插入 。
目前常用的基因转移载体有,(1)猴空泡病毒
(Simian virus 40简称 SV40)； (2)腺病毒 (Adenovirus)；
(3) 乳头 状病毒 (Papilloma virus) ； (4) 逆 转录病 毒
(Retrovirus); (5) 牛痘 (Vaccinia)病毒 ; (6) 牛疣病毒
(Bovine papilloma virus)等 。
三、获得目的基因的方法
(一 )利用理化方法分离基因
理化方法分离基因是依据 DNA双链结构
的特点和四种碱基互补的氢键差异, 其
方法有以下四种,
1,密度梯度超速离心法
2,单链酶法
3,多聚赖氨酸法
4,分子杂交法
(二 )利用生物学方法分离基因
利用噬菌体转染或质粒转化等微生物学技
术分离基因的方法, 我们把它叫做生物学方法 。
这种方法应用于原核基因的分离提取 。
用 适 当 的 限 制 性 内 切 酶 (Restriction
endonuclease )将整个染色体或 DNA分子切成
许多相当于一个或略大于一个基因的片段, 然
后把全部 DNA片段与质粒组成重组 DNA分子, 并
转化到某特定基因营养缺陷型受体菌内, 进行
纯系繁殖, 再经分离鉴定, 选出所需基因 。
(三 )基因的人工合成
1,化学合成法
2,逆转录法 (Reverse transcription)
逆转录法也叫 cDNA法，它是一种酶促合
成法，即以 mRNA为模板，在反转录酶的
作用下，以四种脱氧核苷三磷酸为材料
合成 DNA(cDNA)，再经复制后即成双链
DNA。
3,聚合酶链式反应 (PCR)
四、重组 DNA分子
1,粘性末端连接 连接效率高
相同酶切末端
配伍末端
2.平端连接 连接效率低
3.同聚物接尾法
4.人工接头法
目的基因载体 DNA
+d G T P
+d C T P
P o ly G
P o ly C
3′
3′
3′
3′
五、基因的转移 (Gene transfer)
? (一 )、重组 DNA向细菌细胞转入
? 把以质粒为载体的重组 DNA分子引入受体细胞
的过程叫做转化 (Transformation)；把以噬菌
体或病毒为载体的重组 DNA分子引入受体细胞
的过程叫做转染 (Transfetion)。
? 对细菌细胞进行转化或转染的关键是细胞处在
感受态, 所谓感受态细胞, 就是受体细胞处于
摄入外源 DNA的状态 。 一般用 0.01～ 0.05 M/L
氯化钙处理受体细胞, 可以引起细胞膨胀, 增
大细胞的通透性, 使重组 DNA进入细胞, 提高
转化效率 。
转导作用 transduction
病毒、噬菌体介导
溶菌途径
溶原菌途径
裂解
溶原
(二 )、外源目的基因向真核细
胞转入
向真核细胞中转移基因的方法可分为
两大类, — 类需借助于载体, 另 — 类不
需借助于载体 。
1,借助于载体的基因转移
2,不需载体的基因转移
① 磷酸钙沉淀法
② 脂质体介导法
③ 血影细胞 (Blood shadow cell)介导法
六、转化细胞的筛选与鉴定
? 转化或转染的效率是很低的 (一般为 105～
106)，也就是说，只有极少数细胞接受到
重组 DNA分子，能实现基因的转移。所
以必须从大量的培养细胞中筛选出已被
外源 DNA转化了的细胞，然后建立无性
繁殖系，使所需基因大量扩增和表达。
重组体的筛选 screening/selection
1,直接选择法
抗药性标志选择
标志补救 表达产物与营养缺陷互补
α— 互补 蓝白斑筛选
分子杂交 探针
原位杂交 /Southern印迹法
限制性酶切图谱 /PCR
2.非直接选择法 免疫学方法
七 克隆基因的表达
载体有转录、翻译的元件
密码子通用
1, 原核表达体系
原核表达载体的标准
? 合适的筛选标志
? 强启动子
? 翻译控制序列
? 多克隆位点
融合蛋白 包涵体
大肠杆菌表达体系的不足
1,缺乏转录后加工机制，只能表达
cDNA
2,缺乏翻译后加工机制，不能折叠和糖
基化
3,融合蛋白形成包涵体，复性后才有活
性
4,很难表达大量的可容性蛋白
2 真核表达体系
筛选标志 Neor G418
转染方法
磷酸钙沉淀
DEAE葡聚糖介导转染
电穿孔
脂质体转染
显微注射
瞬时转染 目的基因不整合进宿主基因组
稳定转染 目的基因整合进宿主基因组
第三节 转基因动物技术
一、转基因动物的概念
转基因技术是将外源 DNA导入细胞的一种技
术 。 它是在 DNA重组技术的基础上发展起来的 。
1981年 Gordon 和 Ruddle首次用显微注射法
(Microinjection)把外源基因导入小鼠受精卵的
雄核, 并将注射后的受精卵植入假孕母鼠子宫,
产生了的 78只小鼠, 其中有 2只的所有细胞中
(包括生殖细胞 )都含有外源基因, 但因缺乏启
动子而不能表达, 他们把出生后带外源基因的
小鼠叫做转基因小鼠 (Transgenic Mice),自此
以后, 凡带有外源基因的动物都叫做转基因动
物 (Transgenic animal)。
二、转基因动物技术的一般步骤
(1)选择能有效表达的蛋白质；
(2)克隆与分离编码这些蛋白质的基因；
(3)选择能与所需组织特异性表达方式相适应的基
因调节序列；
(4)把调节序列与结构基因重组拼接，并在培养细
胞或小鼠中预先检验其表达情况；
(5)把拼接的基因注射到受精卵的细胞核中；
(6)把注射后的受精卵移植到子宫，完成胚胎发
(7) 检测幼畜是否整合外源基因、外源基因的表达
情况以及外源基因在其后代中的传递情况。
三、导入基因的方法
导入外源基因的方法有多种，一些方
法已在上一节作过叙述，如：①反转录
病毒转染法；②磷酸钙沉淀法；③脂质
体介导法；④血影细胞 (Blood shadow
cell)介导法。在此再介绍一些方法,1）
DNA微注射法； 2）精子载体法； 3)胚胎
干细胞（ ES）介导法； 4) 染色体片段注
入法； 5) 电转移法等。在转基因动物中，
DNA微注射法比较常用。
四、基因的选择与转基因动物
的研究现状
(一 ) 转入基因的选择
(二 ) 转基因动物的研究意义
1,提高动物生长, 生产性能的研究
2,改变奶蛋白成分和性质的设想
3．利用家畜产品生产药物蛋白的研究
第四节 动物克隆技术
一、动物克隆的概念
所谓克隆 (Cloning)就是无性繁殖，
动物克隆 (Animal cloning)就是不经过
受精过程而获得动物新个体的方法。克
隆动物 (cloning animal)就是指不经过生
殖细胞而直接由体细胞获得新的动物个
体。
二、克隆动物的一般步骤
送入子宫，完成胚胎发育
克隆的动物
三、克隆动物的意义与前景
1,可以用于动物资源的种质保存, 可尽可能多
地保存地球生物圈内的多样性；
2,可以生产移植器官, 利用动物作生物反应器
生产药物和提供实验动物, 造福人类 。 还可
以对人类的某些顽症实施, 细胞治疗, 。
3,可以克隆家畜和濒临灭绝的动物, 如大熊猫
等 。
4,利用哺乳动物体细胞克隆技术, 可通过建立
转基因体细胞系的方式, 克隆转基因动物 。
5,体细胞克隆技术可以直接把优良物种特性传
递下去, 培育优良物种 。
