实验十六 氯霉素（Chloramphenicol）的合成 一、目的要求 1.熟悉溴化、Delepine反应、乙酰化、羟甲基化、Meerwein-Ponndorf-Verley羰基还原、水解、拆分、二氯乙酰化等反应的原理。 2. 掌握各步反应的基本操作和终点的控制。 3. 熟悉氯霉素及其中间体的立体化学。 4. 了解播种结晶法拆分外消旋体的原理，熟悉操作过程。 5. 掌握利用旋光仪测定光学异构体质量的方法。 二、实验原理 氯霉素的化学名为1R，2-（-）-1-对硝基苯基-2-二氯乙酰胺基-1，3-丙二醇，（1R，2R）-（-）-p-nitropHenyl-2-dichloroacetamido-1，3-propanediol。氯霉素分子中有两个手性碳原子，有四个旋光异构体。化学结构式为：   上面四个异构体中仅1R，2R（-）〔或D（-）苏阿糖型〕有抗菌活性，为临床使用的氯霉素。 氯霉素为白色或微黄色的针状、长片状结晶或结晶性粉末，味苦。mp.149~153℃。易溶于甲醇、乙醇、丙酮或丙二醇中，微溶于水。比旋度〔α〕25-25.5°（乙酸乙酯）；〔α〕D25+18.5°~21.5°（无水乙醇）。 合成路线如下：  三、实验方法 （一）对硝基α-溴代苯乙酮的制备 在装有搅拌器、温度计、冷凝管、滴液漏斗的 250 mL四颈瓶中，加入对硝基苯乙酮10 g，氯苯75 mL，于25~28℃搅拌使溶解。从滴液漏斗中滴加溴9.7 g 。首先滴加溴2~3滴，反应液即呈棕红色，10 min内褪成橙色表示反应开始；继续滴加剩余的溴，约1~1.5 h加完，继续搅拌1.5 h，反应温度保持在25~28℃。反应完毕，水泵减压抽去溴化氢约30 min，得对硝基α-溴代苯乙酮氯苯溶液，备用。 注释： 1. 制备氯霉素的二、实验原理除以对硝基苯乙酮为原料的二、实验原理（对酮法）外，还有成肟法、苯乙烯法、肉桂醇法、溴苯乙烯法以及苯丝氨酸法等。 2. 冷凝管口上端装有气体吸收装置，吸收反应中生成的溴化氢。 3. 所用仪器应干燥，试剂均需无水。少量水分将使反应诱导期延长，较多水分甚至导致反应不能进行。 4. 若滴加溴后较长时间不反应，可适当提高温度，但不能超过50℃，当反应开始后要立即降低到规定温度。 5. 滴加溴的速度不宜太快，滴加速度太快及反应温度过高，不仅使溴积聚易逸出，而且还导致二溴化合物的生成。 6. 溴化氢应尽可能除去，以免下步消耗六亚甲基四胺。 思考题： 1. 溴化反应开始时有一段诱导期，使用溴化反应机理说明原因？操作上如何缩短诱导期？ 2. 本溴化反应不能遇铁，铁的存在对反应有何影响？ （二）对硝基α-溴化苯乙酮六亚甲基四胺盐的制备 在装有搅拌器、温度计的 250 mL三颈瓶中，依次加入上步制备好的对硝基α-溴代苯乙酮和氯苯20 mL，冷却至15℃以下，在搅拌下加入六亚甲基四胺（乌洛托品）粉末8.5 g，温度控制在28℃以下，加毕，加热至35~36℃，保温反应1 h，测定终点。如反应已到终点，继续在35~36℃反应20 min，即得对硝基α-溴代苯乙酮六亚甲基四胺盐（简称成盐物），然后冷至16~18℃，备用。 注释： 1. 此反应需无水条件，所用仪器及原料需经干燥，若有水分带入，易导致产物分解，生成胶状物。 2. 反应终点测定：取反应液少许，过滤，取滤液1 mL，加入等量4% 六亚甲基四胺氯仿溶液，温热片刻，如不呈混浊，表示反应已经完全。 3. 对硝基α-溴代苯乙酮六亚甲基四胺盐在空气中及干燥时极易分解，因此制成的复盐应立即进行下步反应，不宜超过12 h。 4. 复盐成品：mp.118~120℃（分解）。 思考题： 1. 对硝基-α-溴代苯乙酮与六亚甲基四胺生成的复盐性质如何？ 2. 成盐反应终点如何控制？根据是什么？ （三）对硝基-α-氨基苯乙酮盐酸盐的制备 在上步制备的成盐物氯苯溶液中加入精制食盐3 g，浓盐酸17.2 mL，冷至6~12℃，搅拌3~5 min，使成盐物呈颗粒状，待氯苯溶液澄清分层，分出氯苯。立即加入乙醇37.7 mL，搅拌，加热，0.5 h后升温到32~35℃，保温反应5 h。冷至5℃以下，过滤，滤饼转移到烧杯中加水19 mL，在32~36℃搅拌30 min，再冷至-2℃，过滤，用预冷到2~3℃的6 mL乙醇洗涤，抽干，得对硝基-α-氨基苯乙酮盐酸盐（简称水解物），mp.250℃（分解），备用。 注释： 1. 对硝基-α-溴代苯乙酮与六亚甲基四胺（乌洛托品）反应生成季铵盐，然后在酸性条件下水解成对硝基-α-氨基苯乙酮盐酸盐。该反应称Delepine反应。 加入精盐在于减小对硝基-α-氨基苯乙酮盐酸盐的溶解度。 3. 成盐物水解要保持足够的酸度，所以与盐酸的摩尔比应在3以上。用量不仅导致生成醛等副反应（Sommolet反应），而且对硝基-α-氨基苯乙酮游离碱本身亦不稳定，可发生双分子缩合，然后在空气中氧化成紫红色吡嗪化合物。此外，为保持水解液有足够酸度，应先加盐酸后加乙醇，以免生成醛等副反应。 4. 温度过高也易发生副反应，增加醛等副产物的生成。 思考题： 1. 本实验中Delepine反应水解时为什么一定要先加盐酸后加乙醇，如果次序颠倒，结果会怎样？ 2. 对硝基-α-氨基苯乙酮盐酸盐是强酸弱碱生成的盐，反应需保持足够的酸度，如果酸度不足对反应有何影响？ (四) 对硝基-α-乙酰胺基苯乙酮的制备 在装有搅拌器、回流冷凝器、温度计和滴液漏斗的 250 mL四颈瓶中，放入上步制得的水解物及水20 mL，搅拌均匀后冷至0~5℃。在搅拌下加入醋酐9 mL。另取40% 的醋酸钠溶液29 mL，用滴液漏斗在 30 min内滴入反应液中，滴加时反应温度不超过15℃。滴毕，升温到14~15℃，搅拌1 h（反应液始终保持在pH 3.5~4.5），再补加醋酐1mL，搅拌10 min，测定终点。如反应已完全，立即过滤，滤饼用冰水搅成糊状，过滤，用饱和碳酸氢钠溶液中和至pH 7.2~7.5，抽滤，再用冰水洗至中性，抽干，得淡黄色结晶（简称乙酰化物）,mp.161~163℃。 注释： 1. 该反应需在酸性条件下（pH 3.5~4.5）进行，因此必须先加醋酐，后加醋酸钠溶液，次序不能颠倒。 2. 反应终点测定：取反应液少许，加入NaHCO3中和至碱性，于40~45℃温热30 min，不应呈红色。若反应未达终点，可补加适量的醋酐和醋酸钠继续酰化。 乙酰化物遇光易变红色，应避光保存。 思考题： 1. 乙酰化反应为什么要先加醋酐后加醋酸钠溶液，次序不能颠倒 ？ 2. 乙酰化反应终点怎样控制，根据是什么？ (五) 对硝基-α-乙酰胺基-β-羟基苯丙酮的制备 在装有搅拌器、回流冷凝管、温度计的250 mL三颈瓶中，投入乙酰化物及乙醇15 mL，甲醛4.3 mL，搅拌均匀后用少量NaHCO3饱和溶液调pH 7.2~7.5。搅拌下缓慢升温，大约40 min达到32~35℃，再继续升温至36~37℃，直到反应完全。迅速冷却至0℃，过滤，用25 mL冰水分次洗涤，抽滤，干燥得对硝基-α-乙酰胺基-β-羟基苯丙酮（简称缩合物），mp.166~167℃。 注释： 1. 本反应碱性催化的pH值不宜太高，pH 7.2~7.5较适宜。pH过低反应不易进行，pH大于7.8时有可能与两分子甲醛形成双缩合物。 甲醛的用量对反应也有一定影响，如甲醛过量太多，亦有利于双缩合物的形成；用量过少，可导致一分子甲醛与两分子乙酰化物缩合。  为了减少上述副反应，甲醛用量控制在过量40%左右（摩尔比约为1 ：1.4）为宜。 2. 反应温度过高也有双缩合物生成，甚至导致产物脱水形成烯烃。 3. 反应终点测定：用玻棒蘸取少许反应液于载玻片上，加水1滴稀释后置显微镜下观察，如仅有羟甲基化合物的方晶而找不到乙酰化物的针晶，即为反应终点（约需3 h）。 思考题： 1. 影响羟甲基化反应的因素有那些？如何控制？ 2. 羟甲基化反应为何选用NaHCO3作为碱催化剂？能否用NaOH，为什么？ 3. 羟甲基化反应终点如何控制？ （六）异丙醇铝的制备 在装有搅拌器、回流冷凝管、温度计的三颈瓶中依次投入剪碎的铝片2.7 g，无水异丙醇63 mL和无水三氯化铝0.3 g。在油浴上回流加热至铝片全部溶解，冷却到室温，备用。 注释： 1. 所用仪器、试剂均应干燥无水。 2. 回流开始要密切注意反应情况，如反应太剧烈，需撤去油浴，必要时采取适当降温措施。 3. 如果无水异丙醇、无水三氯化铝质量好，铝片剪得较细，反应很快进行，约需1-2 h，即可完成。 (七) DL-苏阿糖型-1-对硝基苯基-2-氨基-1，3-丙二醇的制备 在上步制备异丙醇铝的三颈瓶中加入无水三氯化铝1.35 g，加热到44~46℃，搅拌30 min。降温到30℃，加入缩合物10 g。然后缓慢加热，约30 min内升温到58~60℃，继续反应4 h。冷却到10℃以下，滴加浓盐酸70 mL。滴毕，加热到70~75℃，水解2 h（最后0.5 h加入活性炭脱色），趁热过滤，滤液冷至5℃以下，放置1 h。过滤析出的固体，用少量20% 盐酸（预冷至5℃以下）8 mL洗涤。然后将固体溶于12 mL水中，加热到45℃，滴加15% NaOH溶液到pH 6.5~7.6。过滤，滤液再用15% NaOH调节到pH 8.4~9.3，冷却至5℃以下，放置1 h。抽滤，用少量冰水洗涤，干燥，得DL-苏阿糖型-1-对硝基苯基-2-氨基-1，3-丙二醇（DL-氨基物），mp.143~145℃。 注释： 1. 滴加浓盐酸时温度迅速上升，注意控制温度不超过50℃。滴加浓盐酸促使乙酰化物水解，脱乙酰基，生成DL-氨基物盐酸盐，反应液中盐酸浓度大致在20%以上，此时AL(OH)3形成了可溶性的AlCl3-HCl复合物，而DL-氨基物盐酸盐在50℃以下溶解度小，过滤除去铝盐。 2. 用20% 盐酸洗涤的目的是除去附着在沉淀上的铝盐。 3. 用15% NaOH溶液调节反应液到pH 6.5~7.6，可以使残留的铝盐转变成AL(OH)3絮状沉淀过滤除去。 4. 还原后所得产物除DL-苏阿糖型异构体外，尚有少量DL-赤藓糖型异构体存在。由于后者的碱性较前者强，且含量少，在pH 8.4~9.3时，DL-苏阿糖型异构体游离析出，而DL-赤藓糖型异构体仍留在母液中而分离。 思考题： 1. 制备异丙醇铝的关键有哪些？ 2. Meerwein-Ponndorf-Verley还原反应中加入少量AlCl3有何用？ 3. 试解释异丙醇铝—异丙醇还原DL-对硝基-α-乙酰胺基-β-羟基苯丙酮主要生成DL-苏阿糖型氨基物的理由。 4. 还原产物1-对硝基苯基-2-乙酰氨基-1，3-丙二醇水解脱乙酰基，为什么用HCl而不用NaOH水解？水解后产物为什么用20 %盐酸洗涤？ 5. “氨基醇”盐酸盐碱化时为什么要二次碱化？ (八) D -（-）-1-对硝基苯基-α-氨基-1，3-丙二醇的制备 1. 拆分 在装有搅拌器、温度计的250 mL三颈瓶中投入DL-氨基物5.3 g，L-氨基物2.1 g，DL-氨基物盐酸盐16.5 g和蒸馏水78 mL。搅拌，水浴加热，保持温度在61~63℃反应约20 min，使固体全部溶解。然后缓慢自然冷却至45℃，开始析出结晶。再在70 min内缓慢冷却至29~30℃，迅速抽滤，用热蒸馏水3 mL（70℃）洗涤，抽干，干燥，得微黄色结晶（粗L-氨基物），mp.157~159℃。滤液中再加入DL-氨基物4.2 g，按上法重复操作，得粗D-氨基物。 2. 精制 在100 mL烧杯中加入D-或L-氨基物4.5 g，1 mol / L稀盐酸25 mL。加热到30~35℃使溶解，加活性炭脱色，趁热过滤。滤液用15% NaOH溶液调至pH 9.3，析出结晶。再在30~35℃保温10 min，抽滤，用蒸馏水洗至中性，抽干，干燥，得白色结晶，mp.160~162℃。 3. 旋光测定 取本品2.4 g，精密称定，置100 mL容器中加1 mol / L盐酸（不需标定）至刻度，按照旋光度测定法测定（《中国药典》1995版二部附录38页），应为（+）/（-）1.36o~（+）/（-）1.40o。 根据旋光度计算：含量 % = (100×α) /（2×2.4×29.5）×100% 其中：α= 旋光度 29.5 = 换算系数 2 = 管长为2 dm 2.4 = 样品的百分浓度 注释： 1. DL-氨基物盐酸盐的制备：在250 mL烧杯中放置DL-氨基物30 g，搅拌下加入20% 盐酸39 mL（浓盐酸22 mL，水17 mL）。加毕，置水浴中加热至完全溶解，放置，自然冷却，当有固体析出时不断缓慢搅拌，以免结块。最后冷至5℃，放置1 h，过滤，滤饼用95% 乙醇洗涤，干燥，即得DL-氨基物盐酸盐。 2. 固体必须全溶，否则结晶提前析出。 3. 严格控制降温速度，仔细观察初析点和全析点，正常情况下初析点为45~47℃。 （九）氯霉素的制备 在装有搅拌器、回流冷凝器、温度计的100 mL三颈瓶中，加入D-氨基物4.5 g，甲醇10 mL和二氯乙酸甲酯3 mL。在60~65℃搅拌反应1 h，随后加入活性炭0.2 g，保温脱色3 min，趁热过滤，向滤液中滴加蒸馏水（每分钟约1 mL的速度滴加）至有少量结晶析出时停止加水，稍停片刻，继续加入剩余蒸馏水（共33 mL）。冷至室温，放置30 min，抽滤，滤饼用4 mL蒸馏水洗涤，抽干，105℃干燥，即得氯霉素，mp.149.5~153℃。 注释： 1. 反应必须在无水条件下进行，有水存在时，二氯乙酸甲酯水解成二氯乙酸，与氨基物成盐，影响反应的进行。 2. 二氯乙酰化除用二氯乙酸甲酯作为酰化剂外，二氯乙酸酐、二氯乙酸胺、二氯乙酰氯均可作酰化剂，但用二氯乙酸甲酯成本低，酰化收率高。 3. 二氯乙酸甲酯的质量直接影响产品的质量，如有一氯或三氯乙酸甲酯存在，同样能与氨基物发生酰化反应，形成的副产物带入产品，致使熔点偏低。 4. 二氯乙酸甲酯的用量略多于理论量，以弥补因少量水分水解的损失，保证反应完全。 思考题： 1. 二氯乙酰化反应除用二氯乙酸甲酯外，还可用哪些试剂，生产上为何采用二氯乙酸甲酯？ 2. 二氯乙酸甲酯的质量和用量对产物有何影响？ 3. 试对我国生产氯霉素的合成路线和其他合成路线作一评价。 （十）结构确证 1. 红外吸收光谱法、标准物TLC对照法。 2. 核磁共振光谱法。